平邑甜茶根毛細胞離子流動性對PAHs脅迫的響應

徐 金，黃翠香，劉 青，毛云飛，倪 偉，于文章，沈 向（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018）

平邑甜茶根毛細胞離子流動性對PAHs脅迫的響應

徐 金，黃翠香，劉 青，毛云飛，倪 偉，于文章，沈 向*（山東農(nóng)業(yè)大學園藝科學與工程學院，作物生物學國家重點實驗室，山東 泰安 271018）

以蘋果砧木-平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd）幼苗為實驗材料，采用營養(yǎng)液栽培，利用非損傷微測技術，研究多環(huán)芳烴（PAHs）中熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫處理對平邑甜茶幼苗根毛細胞Ca2+、K+、H+流速的影響.結果表明:（1）經(jīng)熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫處理后，平邑甜茶幼苗根毛細胞Ca2+平均流速由對照的（-63.53±9.30）pmol/（cm2·s）分別增加到（+62.85±10.00）pmol/（cm2·s）、（91.33±19.72）pmol/（cm2·s）；K+流速平均值由基礎流速（-60.56±14.56）pmol/（cm2·s）分別增至（+32.60±5.44）pmol/（cm2·s）、（+36.76±5.23）pmol/（cm2·s）；H+平均流速由對照的（+44.38±5.19）pmol/（cm2·s）分別降低至（-0.72±0.055）pmol/（cm2·s）、（-6.34±0.79）pmol/（cm2·s）.經(jīng)熒蒽及苯并（b）熒蒽處理，根毛細胞表面Ca2+、K+、H+流動性發(fā)生明顯逆轉.Ca2+、K+表現(xiàn)為外排趨勢，且外排量逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定；H+表現(xiàn)較穩(wěn)定的內吸趨勢.（2）苯并（b）熒蒽脅迫對平邑甜茶幼苗根毛細胞離子流動性造成的毒性效應高于熒蒽.說明PAHs脅迫會破壞植物根毛細胞離子流動性，影響植物正常生長，為深入研究植物受PAHs脅迫所產(chǎn)生的響應提供理論依據(jù).

平邑甜茶；熒蒽；苯并（b）熒蒽；脅迫；離子流動性

多環(huán)芳烴（PAHs）是指2個或2個以上芳香環(huán)稠合成的有機污染物，在環(huán)境中普遍存在，具有致癌、致畸、致突變效應［1-3］.隨著苯環(huán)數(shù)的增大，其水溶性越差，降解速度越低［4］.目前PAHs引起的環(huán)境問題已得到各國的廣泛關注，而土壤成為PAHs的重要歸宿，有研究表明滯留在土壤耕作層中的PAHs約達90%［5-6］.PAHs進入土壤后可通過揮發(fā)、遷移以及食物鏈等途徑在生態(tài)系統(tǒng)中富集，影響植物生長，威脅人體健康及食品安全，也給其他生物造成嚴重危害［7-8］.現(xiàn)在PAHs種類已達100種以上，我國也將7種PAHs列入優(yōu)先控制污染物黑名單中［9］.近年來，我國經(jīng)濟持續(xù)發(fā)展，卻忽視了對環(huán)境的保護，能源的高需求低利用導致PAHs排放量不斷增加，環(huán)境污染問題日益嚴重［10］，所以廣泛開展我國生態(tài)環(huán)境中PAHs的研究具有重要意義.

熒蒽（Fla）和苯并（b）熒蒽（Bbf）是我國7種優(yōu)控PAHs的代表性化合物，熒蒽具有潛在的致癌性、弱致突變性及免疫毒性，會破壞生物體正常防御體系［11-12］，且能長時間殘留在土壤中，并通過食物鏈給生態(tài)環(huán)境帶來風險［13］；苯并（b）熒蒽分子量較大，其光解、水解、生物降解很微弱，相對致癌性強，是檢驗食品中PAHs的標記［14］.這2種物質在土壤中含量較多，但目前有關這2種化合物對植物的毒性效應尚未見報道.植物離子流的變化是反應逆境脅迫后最初的快速信號，通過離子流可以快速診斷和預測細胞的關鍵發(fā)生過程，隨著非損傷微測技術（掃描離子選擇性微電極技術）的出現(xiàn)，離子跨膜流動的研究得到迅速發(fā)展［15-17］.本研究采用無融合生殖、抗性強的蘋果砧木-平邑甜茶幼苗為實驗材料，利用非損傷微測技術，檢測熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫處理對其幼苗根毛細胞Ca2+、K+、H+流速的影響，揭示PAHs對植物的毒性效應，為深入研究植物受PAHs脅迫所產(chǎn)生的響應提供理論依據(jù)，為PAHs的生態(tài)風險評估積累基礎研究數(shù)據(jù).

1 材料與方法

1.1 主要試劑

標準樣品：熒蒽（25mg，98.5%，上海安譜科學儀器有限公司），苯并（b）熒蒽（10mg，99.0%，上海安譜科學儀器有限公司）熒蒽和苯并（b）熒蒽溶液配制：用甲醇溶解熒蒽、苯并（b）熒蒽，將熒蒽及苯并（b）熒蒽的甲醇儲備液加入適量的Hoagland半強度培養(yǎng)液中，振蕩均勻，定容在2L的容量瓶中（控制甲醇濃度＜1‰），制得濃度為0.2mg/L的熒蒽培養(yǎng)液和5μg/L的苯并（b）熒蒽培養(yǎng)液，在低溫條件下避光保存?zhèn)溆茫?8-21］.

1.2 材料處理

選取蘋果砧木-平邑甜茶（Malus hupehensis Rehd）幼苗為供試材料，于2014年10月在山東農(nóng)業(yè)大學園藝學院果樹根系實驗室進行水培試驗.

為保證試驗準確性，所用平邑甜茶幼苗生長狀況應一致且普遍長出5～7片真葉，對其進行水培，水培期間加入適量Hoagland半強度營養(yǎng)液.啟動通氣設備，為植物生長提供良好環(huán)境.每7d換一次營養(yǎng)液，每盆加營養(yǎng)液2L.一個月后待幼苗適應水環(huán)境后，株高10cm、長出4對葉片有大量白色吸收根長出時，采用非損傷微測技術檢測熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫下平邑甜茶幼苗根毛K+、Ca2+、H+流動性.非損傷微測試驗于2015年5月在旭月（北京）科技有限公司進行.

1.3 試驗方法

測定方法：取平邑甜茶幼苗白色新生根尖1cm左右于培養(yǎng)皿，分別加入含0.2mg/L熒蒽和5μg/L苯并（b）熒蒽培養(yǎng)液處理15min，然后將幼苗根部放入測試液（Ca2+、K+、H+所用測試液相同）清洗根部，放根部于測試液中固定，對根尖部分生區(qū)周圍500μm進行測定，檢測凈Ca2+、K+、H+離子流，每個測試點測2min，大約10min流速穩(wěn)定后，結束測試，重復5次.

利用非損傷微測技術，測定平邑甜茶根毛細胞表面Ca2+、K+、H+離子流變化.測試液配方：0.1mmol/LKCl，0.1mmol/LCaCl2,0.1mmol/LMgCl2，0.5mmol/LnaCl，0.2mmol/LNa2So4，0.3mmol/LME S，pH 6.0.測定前微電極前端灌充有15～25μm的選擇性液態(tài)離子交換劑（LⅠX）液柱，LⅠX分別為Ca2+（Sigma #21048）、H+（Sigma #95293）、K+（Sigma #60031），其后灌充10mm左右的電解質.電解質為H+（15mmol/LNaCl+40mmol/L KH2PO4， pH 7.0），Ca2+（100mmol/L CaCl2）， K+（100mmol/L KCl）.將電極固定器（EHB-1； World Precision Ⅰnstruments）上的Ag/AgCl絲從電極后面插入，使其與電解質接觸［22］.參比電極（DRⅠREF-2； World Precision Ⅰnstruments）為固體電極.選用校正中能斯特斜率＞56mV/decade H+微電極使用，校正液為pH5.5和pH6.5的緩沖液［23］.

1.4 數(shù)據(jù)分析

離子流數(shù)據(jù)通過旭月公司提供的MageFlux軟件計算得出.采用EXCEL對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，利用DPS v7.05軟件作不同處理之間差異顯著性差異分析.

2 結果

2.1 熒蒽和苯并（b）熒蒽對平邑甜茶根毛細胞Ca2+流動性影響

圖1為熒蒽，苯并（b）熒蒽脅迫處理后，10min內平邑甜茶根毛細胞表面Ca2+流速變化.正值代表離子外排，負值代表離子吸收.從圖1可看出，根毛細胞在正常環(huán)境條件下有基礎性Ca2+吸收，進行熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后，Ca2+流動性發(fā)生逆轉，表現(xiàn)為外排趨勢，外排量隨處理時間的延長逐漸降低，最終呈穩(wěn)定趨勢.此時經(jīng)熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫后的平邑甜茶幼苗根毛細胞Ca2+流速分別為（+38.08±8.33）pmol/（cm2·s）和（+52.27±9.21）pmol/（cm2·s）.

10min內平邑甜茶幼苗根毛細胞Ca2+流速平均值為（-63.53±9.30）pmol/（cm2·s），經(jīng)熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫處理后，分別增加到（+62.85± 10.00）pmol/（cm2·s）和（91.33±19.72）pmol/（cm2·s），與對照差異顯著（P＜0.01）.分析2種處理可以看出，苯并（b）熒蒽脅迫對平邑甜茶Ca2+流動性的毒性效應高于熒蒽.

圖1 熒蒽，苯并（b）熒蒽處理根毛細胞表面Ca2+流速變化Fig.1 Change of the cell surface Ca2+flow rate of root hair cells treated with fluoranthene and Benzo［b］fluoranthene

2.2 熒蒽和苯并（b）熒蒽對平邑甜茶根毛細胞K+流動性影響

從圖2可以看出，根毛細胞在正常環(huán)境中基礎性的K+吸收，受熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后，平邑甜茶幼苗根毛細胞K+流動性也發(fā)生逆轉，表現(xiàn)為外排趨勢，起初流速迅速降低，后趨于穩(wěn)定.最終 流 速 達 到 （+23.55±6.74）pmol/（cm2·s）和（+32.15± 5.31）pmol/（cm2·s）.

平邑甜茶幼苗根毛細胞在受熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后，K+流速平均值由基礎流速（-60.56± 14.56）pmol/（m·s）分別增至（+32.60±5.44）pmol/（cm2·s）和（+36.76±5.23）pmol/（cm2·s），與對照差異極顯著（P＜0.01）.分析可以看出，2種脅迫處理對平邑甜茶幼苗K+流動性毒性效應同樣是苯并（b）熒蒽高于熒蒽.

圖2 熒蒽，苯并（b）熒蒽處理根毛細胞表面K+流速變化Fig.2 Change of the cell surface K+flow rate of root hair cells treated with fluoranthene and Benzo［b］fluoranthene

2.3 熒蒽和苯并（b）熒蒽對平邑甜茶根毛細胞表面H+流動性影響

從圖3可以看出，根毛細胞表面H+在正常環(huán)境中表現(xiàn)為外排趨勢，受熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫后，H+流動性發(fā)生逆轉，表現(xiàn)為比較穩(wěn)定的內吸趨勢.

測得平邑甜茶幼苗根毛細胞表面H+基礎流速平均為（+44.38±5.19）pmol/（cm2·s），經(jīng)熒蒽和苯并（b）熒蒽處理后，分別降低至（-0.72± 0.055）pmol/（cm2·s），（-6.34±0.79）pmol/（cm2·s），與對照差異極顯著（P＜0.01）.分析可以看出，苯并（b）熒蒽脅迫處理對平邑甜茶幼苗H+流動性造成的影響高于熒蒽.

圖3 熒蒽，苯并（b）熒蒽處理根部細胞表面H+流速變化Fig.3 Change of the cell surface H+flow rate of root hair cells treated with fluoranthene and Benzo［b］fluoranthene

3 討論

PAHs對植物的影響越來越引起人們的關注.Maria Ⅰsabel Cerezo等研究發(fā)現(xiàn)PAHs減少了原綠球藻的DNA合成，延緩其細胞分裂，導致原綠球藻生長量降低［24］.洪有為等［25］對秋茄幼苗進行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)隨菲濃度加大，根細胞受傷害程度增加，根系活力下降，葉綠素a、b含量也呈下降趨勢.丁克強等［26］研究認為苯并（a）芘污染土壤會抑制小麥種子發(fā)芽以及根的伸長，對于不同植物，污染物的毒性效應也有區(qū)別.本試驗選取PAHs中熒蒽及苯并（b）熒蒽這2種物質對蘋果砧木-平邑甜茶幼苗進行脅迫處理，發(fā)現(xiàn)受脅迫后的平邑甜茶幼苗根毛細胞表面Ca2+、K+、H+流動性相比正常環(huán)境中發(fā)生明顯逆轉，Ca2+、K+表現(xiàn)為外排趨勢，H+表現(xiàn)較穩(wěn)定的內吸趨勢.說明PAHs的存在嚴重干擾植物的正常生長，破壞了植物對礦質元素的吸收.

平邑甜茶幼苗在受到PAHs脅迫后，根毛細胞表面Ca2+外排.導致這種結果的原因可能是根毛細胞受外來PAHs刺激后，胞質Ca2+濃度出現(xiàn)短暫上升，從而激起細胞應答，做出相應調節(jié)反應.Ca2+泵和Ca2+/H+反向轉運體存在于細胞內，當細胞受到刺激后，跨膜釋放胞質Ca2+到胞外及胞內“鈣庫”，以維持Ca2+濃度穩(wěn)態(tài)［27-28］.Ca2+是維持植物細胞正常生理功能的重要離子，參與大多數(shù)細胞生理代謝過程，在穩(wěn)定植物細胞壁、細胞膜，調控細胞內外離子濃度平衡、誘導細胞抗逆基因表達中起重要作用［29-31］.平邑甜茶受到熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后，體內Ca2+會大量外排，細胞內離子穩(wěn)態(tài)失衡，細胞膜結構的完整性、功能穩(wěn)定性被破壞，不利于鈣的儲藏及吸收，影響平邑甜茶的正常生長發(fā)育.

受外源PAHs脅迫，平邑甜茶幼苗根毛細胞K+流動性發(fā)生逆轉，表現(xiàn)為外排趨勢.與顧閩峰等通過對結球甘藍幼苗根進行鹽脅迫，導致K+含量下降結果相似［32］.導致這種結果可能是由于PAHs對根毛細胞膜造成損傷，致使根毛喪失選擇性吸收離子的功能.細胞內離子穩(wěn)態(tài)失衡，導致K+外流［33-35］.此外，根毛細胞受PAHs脅迫會導致更多活性氧的產(chǎn)生，從而發(fā)生氧化脅迫，細胞膜通透性改變，內部電解質外滲，K+外排，引起細胞死亡［36］.此外，根毛細胞膜電勢的去極化也會造成K+外排［37］.K+是植物生長發(fā)育中必需的大量元素，對調節(jié)細胞滲透壓，維持細胞電荷平衡、酶活性調節(jié)、蛋白質合成、細胞生長、氣孔開閉、細胞極性以及葉片運動都有著重要意義［38］.K+外流，植物生長所需的營養(yǎng)元素得不到補充，營養(yǎng)失調，生長受到抑制，甚至死亡.

待測幼苗根部H+受PAHs脅迫后，表現(xiàn)為內吸趨勢.原因可能是Ca2+-ATPase、Ca2+/H+反向轉運體受熒蒽和苯并（b）熒蒽脅迫后被活化，同時H+-ATPase水解ATP產(chǎn)生能量，將H+從細胞質中泵出，產(chǎn)生跨質膜H+電化學勢梯度，驅動質膜Ca2+/H+反向轉運蛋白進行離子轉運：H+順著電化學勢梯度進入細胞，Ca2+逆著電化學勢梯度排出細胞.同時平邑甜茶幼苗根毛細胞由于受PAHs脅迫導致膜電勢去極化，外向K+通道被激活，介導K+向細胞膜外流動，促進K+的釋放，由此產(chǎn)生細胞內外電化學勢梯度，在H+/K+反向轉運體作用下，胞外H+進入細胞，K+排出細胞［39］.H+參與光合作用等植物生理活動，PAHs脅迫導致細胞內H+穩(wěn)態(tài)失衡，對平邑甜茶光合作用等一系列生理活動造成不利影響，影響其正常生長.

熒蒽及苯并（b）熒蒽這兩種物質對根系細胞膜結構的完整性、穩(wěn)定性的破壞，及其吸收轉運等毒性機理有待于進一步研究.

4 結論

4.1 受熒蒽及苯并（b）熒蒽脅迫，根毛細胞表面Ca2+、K+、H+流動性發(fā)生明顯逆轉，Ca2+、K+表現(xiàn)為外排趨勢，且外排量逐漸降低，最終趨于穩(wěn)定；H+表現(xiàn)較穩(wěn)定的內吸趨勢.

4.2 苯并（b）熒蒽脅迫對平邑甜茶幼苗根毛細胞表面Ca2+、K+、H+流動性造成的毒害效應高于熒蒽.

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致謝：文章中的英語寫作部分，謝興斌老師給予了很大幫助，在此表示感謝.

The ion mobility in root hair cells of Malus hupehensis in response to stress from PAHs.

XU Jin， HUANG Cui-xiang，LiU Qing， MAO Yun-fei， NI Wei， YU Wen-zhang， SHEN Xiang （College of Horticultural Science and Engineering，Shandong Agricultural University， State Key Laboratory for Crop Biology， Taian 271018， China）. China Environmental Science， 2016，36（10）：3107～3111

Apple stock-Pingyitiancha （Malus hupehensis Rehd） was selected as experimental materials， hydroponic experiments were conducted with or without fluoranthene and benzo （b） fluoranthene. Non-invasive Micro-test Technique was used to detect the effects of Ca2+， K+， H+fluxes in response to polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） treatments. Our results showed that: （1） fluoranthene and benzo （b） fluoranthene treatments resulted in the liquidity of Ca2+increased from（-63.53±9.30）pmol/（cm2·s） to （+62.85±10.00）pmol/（cm2·s）、（91.33±19.72） pmol/（cm2·s）； the liquidity of K+increased from（-60.56±14.56）pmol/（cm2·s） to（+32.60±5.44）pmol/（cm2·s）、（+36.76±5.23）pmol/（cm2·s）； the liquidity of H+reduced from（+44.38±5.19）pmol/（cm2·s） to（-0.72±0.055）pmol/（cm2·s）、（-6.34±0.79）pmol/（cm2·s）. fluoranthene and benzo （b）fluoranthene treatments resulted in the liquidity of Ca2+， K+， H+in root epidermis obvious reversal. A dramatic Ca2+， K+efflux was observed in root epidermis under stress， and gradually reduced to a stable level. Meanwhile， H+showed influx and did not affect the PAHs treatments. （2） Benzo［b］fluoranthene Stress showed more toxic effects on ion mobility in root hair cells than that of fluoranthene. The results indicated that PAHs stress could damage the ion mobility of root hair cells，interfere plants growth and development， providing a theoretical basis for further study on the response of plants to PAHs stress.

Malus hupehensis Rehd；fluoranthene；benzo［b］fluoranthene；stress；the ion mobility

X173

A

1000-6923（2016）10-3107-05

徐 金（1992-），女，山西運城人，在讀碩士研究生，主要從事果樹生理學方向研究.

2016-02-29

山東省果品創(chuàng)新團隊（SDAⅠT-06-07）；支撐計劃專項（2014BAD16B02）；現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術體系專項（CARS-28）；公益性行業(yè)科技專項（201303093）

* 責任作者， 教授， guanshanghaitang@126.com