反應激活型酶熒光探針的研究進展

錢明，張留偉，王靜云

（大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024）

反應激活型酶熒光探針的研究進展

錢明，張留偉，王靜云

（大連理工大學生命科學與技術學院，遼寧 大連 116024）

酶在維持生物體內穩態與生命活動的正常運行方面發揮著舉足輕重的作用。某些特定酶含量及活性的異常與人類重大疾病的發生與發展密切相關。因此，生物體內特定酶的實時原位檢測及可視化成像具有重要的意義?；瘜W熒光探針具有選擇性好、靈敏度高及高時空分辨率可視化成像等優點，近年來研究者設計合成了大量的可用于生物體系內酶識別與可視化成像的熒光探針。目前識別酶的熒光探針主要有兩類：（1）基于酶對熒光探針分子中酶抑制劑基團的識別引起探針熒光信號的變化；（2）基于酶對熒光探針特異性催化反應來實現識別前后熒光信號的激活，稱為反應激活型酶熒光探針。對反應激活型酶熒光探針的設計策略及4種重大疾病相關的生物標志酶（單胺氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝基還原酶、γ-谷氨酰轉肽酶）的識別可視化熒光探針研究進展進行了綜述，對未來酶識別熒光探針的研究方向進行了展望。

熒光；探針；酶；成像；細胞生物學

引 言

酶是細胞內一種具有催化效應的生物大分子，在維持生命活動的正常運行過程中扮演著不可或缺的角色。特定酶含量及活性的異常通常與某些疾病的發生和發展密切相關[1]，如某些癌癥的發生與 β-半乳糖苷酶的過表達存在密切關系[2]，低氧腫瘤內硝基還原酶的濃度顯著升高[3-5]，神經退行性疾病的發生通常伴隨著單胺氧化酶的高水平表達[6]等。因此，開發高效的檢測手段來實現對生物體系中特定標志酶的活性檢測和可視化成像對深入研究重大疾病的發病機制及其早期診斷具有舉足輕重的作用。傳統的酶活性分析檢測手段如比色法[7-8]、電化學法[9]、酶聯免疫吸附法[10]等無法實現對生物體系內特定酶的活性進行實時原位無損傷檢測?；跓晒鈭F的熒光探針法具有操作簡便，靈敏度高，選擇性強，可實現實時快速、原位無損傷檢測、高時空分辨率可視化成像等優勢[11]。近年來，熒光探針已廣泛用于活細胞/亞細胞水平離子及小分子的識別及可視化成像[12-13]，同時也成為生物體系中酶活性檢測與可視化成像的一種重要手段，是生命科學和醫學診斷領域的研究熱點。根據探針熒光信號變化的觸發方式不同，酶熒光探針主要可以分為兩類：（1）基于酶對熒光探針分子中酶抑制劑基團的識別引起熒光探針熒光信號的變化[14-16]，可以稱為抑制劑型酶熒光探針。此類探針能夠實現較強的酶結合親和力和良好的選擇性檢測，但存在靈敏度相對不足的局限性；（2）基于酶對熒光探針特異性催化反應來實現識別前后熒光信號的激活，稱為反應激活型酶熒光探針[17-18]，這類探針能夠通過酶的高效催化轉化能力實現熒光信號的放大和高檢測靈敏度。因此，本文就反應激活型酶熒光探針的一般設計策略，4種與疾病相關的重要生物標志酶的反應激活型熒光探針的研究進展進行綜述。

圖1 探針1與內酰胺酶的響應示意圖Fig.1 Proposed sensing mechanism for β-lactamase of probe 1

1 酶活性的檢測歷史

酶活性的檢測最早可以追溯到 1939年，當時Gomoki[19]利用磷酸酶催化甘油三磷酸水解釋放出的磷酸能與鈣離子形成不溶于水的磷酸鈣鹽的特性測定了組織切片中磷酸酶的活性。這是首次基于酶的催化能力而設計的酶活性檢測方法。自此以后，一系列新型檢測方法如比色法[7-8]、電化學法[9]、酶聯免疫吸附法[10]、熒光探針法等被開發出來用于酶活性的檢測，大大地提高了檢測的靈敏度。1998年，Tsien等[20]設計開發了首例真正意義上能用于活細胞中內酰胺酶活性檢測的熒光探針1 (圖1)。該探針將香豆素（能量給體）和熒光素（能量受體）用內酰胺環基團（可被內酰胺酶特異性催化水解斷裂）連接。未與內酰胺酶識別前，由于熒光共振能量轉移效應（fluorescence resonance energy transfer，FRET）的存在，探針在520 nm 處有最大的熒光發射（熒光素的熒光發射峰）；酶識別探針后，內酰胺環斷裂，香豆素與熒光素分離，FRET效應被抑制，探針的最大熒光發射波長藍移至447 nm（香豆素的熒光發射峰）。實驗結果顯示探針在兩個波長處的熒光強度比 ( I447/ I520)與酶的活性存在良好的線性關系，且熒光強度比在酶識別前后呈現高達70倍的增強。而且該探針具有較強的細胞穿膜能力，能夠實現活細胞內酶活性的定性和定量檢測。從此，酶活性檢測熒光探針成為研究細胞內生化過程和功能的一種有效的工具。近年來，得益于熒光檢測儀器特別是激光共聚焦顯微鏡等的發展，具有優良性能的熒光團的涌現（熒光素、羅丹明、氟硼二吡咯、萘酰亞胺、香豆素等）和熒光響應機理[光誘導電子轉移（photo induced electron transfer, PeT）、分子內電荷轉移（intramolecular charge transfer, ICT）、螺環開閉機理（spirocyclic switch）、熒光共振能量轉移等]的發展，涌現了一批優秀的酶熒光探針[14-16,21-33]，使得對各種酶活性進行實時原位檢測和可視化熒光成像成為可能，為生命科學和醫學的研究和發展奠定了堅實的基礎。

2 反應激活型酶熒光探針設計策略

反應激活型酶熒光探針的設計策略通常有3種途徑來實現[34]。第1種途徑[圖2(a)]是在現有的熒光團的基礎上引入一些保護基團，在保護基團的保護下，熒光團處于熒光淬滅狀態。一旦與酶識別，酶的催化作用使保護基團裂解，熒光團的熒光重新恢復，從而達到對特定酶熒光響應的目的。眾所周知，水解酶是一種具有極強水解能力的酶，因此這種設計策略特別適合外切型水解酶探針的設計，如糖苷酶、磷酸酶、肽酶等酶的探針設計。第2種途徑[圖2(b)]是利用熒光共振能量轉移效應來實現，探針通常由能量供體熒光團、受體熒光團、連接臂3部分組成。酶的催化作用使得連接臂斷裂，供受體熒光團分離，FRET效應抑制，熒光信號發生改變。此種設計策略適合一些內切型水解酶的探針設計，如β-內酰胺酶、蛋白酶、磷酸二酯酶等。第3種途徑[圖 2(c)]是將探針分子的熒光團進行直接轉化，使得熒光團的熒光性能發生變化，從而達到對酶活性熒光響應的目的。此類設計策略比較適合一些氧化還原酶和轉移酶的探針設計。除了上述探針設計策略外，一些熒光探針的基本響應機理如光誘導電子轉移[31]、分子內電荷轉移[22-24]、螺環開閉[21,28]等同樣被廣泛用于酶探針的熒光響應過程。

圖2 反應激活型酶熒光探針的3種常見設計策略[34]Fig.2 Three common design strategies for reaction-activated probe for enzymes[34]

3 反應激活型酶熒光探針的研究進展

近年來，得益于熒光探針技術的日益成熟以及對酶的生化特性的深入理解，多種優秀反應激活型酶熒光探針被報道[21-33]。其中單胺氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝基還原酶、γ-谷氨酰轉肽酶均在人體內生理病理過程中發揮著關鍵的作用，是重要的疾病標志酶。開發識別這4種酶的可視化熒光探針一直備受關注。因此，本文將對近十年來檢測上述 4種疾病標志酶的熒光探針的重要研究進展分別進行評述。

3.1 單胺氧化酶熒光探針的研究進展

單胺氧化酶（monoamine oxidase, MAOs, EC 1.4.3.4）是人體內一種催化各種胺類物質發生氧化脫氨反應的膜結合線粒體酶，在人體內維持神經遞質和有機胺類水平動態平衡方面發揮著至關重要的作用[35]。據文獻報道，單胺氧化酶在腦和中樞神經系統正常生命活動過程中扮演著關鍵的角色，其活性的異常變化與多種神經遞質代謝紊亂引起的神經退行性疾病和精神病的發生有關[6,36]。近年來單胺氧化酶已經成為各種腦紊亂相關疾病的重要治療靶標。因此開發能夠實現高靈敏、高選擇性、實時原位檢測生物體系中單胺氧化酶活性的熒光探針具有十分重要的生物醫學意義。近年來，已經出現一大批能夠用于生物體系中單胺氧化酶活性檢測的熒光探針[25,27,30,37-46]。2005年，Sames等[37]報道了首例能夠用于線粒體（從細胞中分離出來）內單胺氧化酶活性檢測的熒光探針2 (圖3)。該探針是基于酶促氧化后探針分子發生環化反應和 PeT機理設計而成。探針分子中對香豆素母體具有強PeT效果的氨乙基在單胺氧化酶的催化下，發生脫氨基作用形成乙醛，接著乙醛再與苯環上的氨基發生分子內環化形成吲哚環結構，使得PeT效應被抑制，從而實現熒光“OFF-ON”的效果。該探針巧妙地在香豆素母體的6號碳位上引入氨基，7號碳位上引入氨乙基。這種基團引入方式不僅能夠防止副產物的產生，而且能夠在短時間內實現對單胺氧化酶高達200倍的熒光響應。

圖3 探針2與單胺氧化酶的響應示意圖Fig.3 Proposed sensing mechanism for MAOs of probe 2

2007年，Chang等[38]設計合成了兩例能夠用于活細胞內單胺氧化酶活性檢測的探針3和4 (圖4)。這兩例探針均以具有優良光物理性能和良好生物相容性的熒光團試鹵靈（resorufin）為母體，在母體基礎上引入丙胺基醚衍生物，使探針處于熒光淬滅狀態。在單胺氧化酶的催化下，探針分子經過氧化、β-消去反應釋放出試鹵靈熒光團，從而實現熒光增強的效果。實驗結果顯示，探針 3和4不僅能在體外實現對單胺氧化酶高靈敏的熒光響應，而且還能在單胺氧化酶過表達的PC12神經細胞內實現對單胺氧化酶活性的檢測。

圖4 探針3、4與單胺氧化酶的響應示意圖Fig. 4 Proposed sensing mechanism for MAOs of probe 3, 4

圖5 探針5、6與單胺氧化酶的響應示意圖及探針5的細胞成像圖Fig.5 Proposed sensing mechanism for MAOs of probe 5,6 and fluorescent images of 5 in living cells

與單光子熒光探針相比，雙光子熒光探針具有較強的組織穿透能力，能夠降低組織自發熒光的干擾，降低激發光對細胞的損傷，避免光致漂白的發生等優點，因此特別適合生物體系中酶活性的檢測[47]。2012年，Kim 等[39]設計合成了兩例能夠用于活細胞內單胺氧化酶檢測和成像的雙光子熒光探針5和6 (圖5)。探針5和6均以萘的衍生物為熒光團母體，分別引入氨丙基和N-甲基氨丙基作為識別基團。在單胺氧化酶的催化下，處于熒光淬滅狀態的探針經過氧化反應、消去反應、分子內縮合成環3個步驟轉化成強熒光發射的產物，實現對單胺氧化酶的熒光響應。實驗結果顯示探針5和6不僅能夠在體外實現對單胺氧化酶的快速響應，而且還具有較強的細胞膜穿透能力，能夠在嗜鉻細胞中對高表達的單胺氧化酶實現高分辨率的雙光子成像。

人體內的單胺氧化酶具有兩種不同的異構體，單胺氧化酶A(MAO A)和單胺氧化酶B (MAO B)。這兩種異構體不僅具有形狀不同的活性中心、不同的底物選擇性、不同的抑制劑敏感性，而且在人體內具有不同的空間分布和生理作用[48]。遺憾的是，很多探針都不能高選擇性地將這兩種異構體區分開來。2012年，Zhu等[40]設計合成了一例對MAO B具有高度選擇性的熒光探針7 (圖6)。該探針以香豆素為母體，在母體上引入1-甲基-1, 2, 3, 6-四氫吡啶作為識別基團。探針7與MAO B發生特異性識別后，在酶的催化下，發生氧化反應和水解反應釋放出香豆素熒光團，實現對MAO B的熒光響應。分子對接表明探針7能夠與MAO B 活性部位中的羥基發生較強的氫鍵作用，而與 MAO A 活性部位羥基之間沒有顯著的氫鍵作用。因此，探針7能將兩種單胺氧化酶異構體區分開來，實現對MAO B活性的特異性檢測。

圖6 探針7與單胺氧化酶B的響應示意圖Fig. 6 Proposed sensing mechanism for MAO B of probe 7

2014年，Yao等[25]設計合成了首例能夠用于帕金森疾病模型中MAO B特異性檢測和成像的雙光子熒光探針8 (圖7)。該探針以典型雙光子熒光團acedan（2-甲氨基-6-乙酰基萘）為母體，以丙胺作為識別基團，母體與識別基團之間用氨基甲酸酯結構單元作為連接結構。具有強拉電子能力的氨基甲酸酯會破壞acedan熒光團的推拉電子體系，使探針處于熒光淬滅狀態。與MAO B識別后，在酶的催化作用下，探針發生氧化反應和β-消去反應釋放出acedan熒光團，實現對MAO B的熒光響應。分子對接顯示，該探針能夠與MAO B的活性口袋（長且窄）發生高親和力的結合而與MAO A的活性口袋結合親和力較差。因此該探針能夠很好地將兩種異構體區分開來，實現對MAO B的特異性檢測。將該探針用于一系列帕金森疾病模型和臨床樣品中MAO B活性的檢測和成像，進一步驗證了MAO B是帕金森疾病發展過程的一種重要的生物標志酶，探針8具有應用于臨床上診斷帕金森疾病的潛能。

與增強型或淬滅型熒光探針相比，比率型熒光探針在生物體系（細胞、組織、活體等）中酶活性的檢測方面具有獨特的優勢。這類探針利用兩個波長處的熒光強度比例變化顯示酶活性變化，因此能夠很好地排除探針濃度、生物體系微環境因素（pH、溫度、極性等）、激發光源強度、儀器測量誤差等因素的影響，實現高靈敏度、高精確度的酶活性檢測[49-50]。

圖7 探針8與單胺氧化酶B的響應示意圖Fig. 7 Proposed sensing mechanism for MAO B of probe 8

圖8 探針9與單胺氧化酶A的響應示意圖及細胞成像圖Fig. 8 Proposed sensing mechanism for MAOs of probe 9 and fluorescent images in living cells

2016年，Ma等[30]報道了一例能夠選擇性檢測活細胞內MAO A活性的比率型熒光探針9 (圖8)。該探針以1, 8-萘酰亞胺為母體，在母體上引入丙胺作為識別基團。未與MAO A識別前，該探針在波長454 nm處具有較強的熒光發射。一旦與MAO A發生特異性識別，探針將發生氧化反應和 1,6-消去反應使熒光團4-羥基-N-丁基-1,8-萘酰亞胺（最大發射波長為550 nm）釋放出來。酶促反應前后，兩個波長處的熒光強度比（I550/ I454）發生明顯的變化，實現對MAO A的比率響應。最重要的一點是，該探針對兩種單胺氧化酶異構體具有明顯的親和力強弱的差異，其對MAO A的親和力明顯強于MAO B。因此該探針能夠很好地將兩種異構體區分開來，實現對MAO A活性的特異性檢測。作者將該探針成功地應用于MAO A表達水平存在明顯差異的兩種細胞中成像。結果顯示MAO A高水平表達的HeLa細胞中的熒光強度比例顯著地強于MAO A低水平表達的NIH-3T3細胞。

3.2 β-半乳糖苷酶探針的研究進展

β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal，EC 3.2.1.23）是人體內一種具有重要生理病理作用的水解酶，其主要生理功能是催化水解糖苷鍵，將乳糖轉化成半乳糖。據文獻報道，該酶的表達水平與細胞衰老[22]、某些癌癥的發生[2]存在密切關系。因此，β-半乳糖苷酶活性的檢測在生命醫學領域存在重要的意義。相比其他檢測手段，利用熒光探針技術來實現生物體系中β-半乳糖苷酶活性的檢測具有重大優勢。最早使用熒光探針來檢測β-半乳糖苷酶活性可以追溯到1963年，Edelstein等[51]開發了一例β-半乳糖苷酶熒光探針10 (圖9)。遺憾的是，該探針的細胞穿透能力較差，不能直接用于細胞或組織成像，只有借助低滲振蕩或細胞固定的方法將探針傳送到細胞內才能實現細胞內 β-半乳糖苷酶活性檢測。但近年來，許多性能優異的β-半乳糖苷酶熒光探針[2,21-23,52-57]被設計合成出來。日本東京大學的Nagano等十多年來一直致力于 β-半乳糖苷酶探針的研究，設計合成了一系列β-半乳糖苷酶熒光探針，在β-半乳糖苷酶熒光探針的開發和理論研究方面做出了卓越的貢獻。

圖9 探針10與β-半乳糖苷酶的響應示意圖Fig.9 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 10

圖10 探針11與β-半乳糖苷酶的響應示意圖Fig.10 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 11

2005年，Nagano等[52]設計合成了一例基于熒光素PeT機理的熒光探針11 (圖10)。該探針的設計靈感來源于對羧基熒光素PeT機理的深入理解。他們研究發現熒光素中位苯環上的取代基團類型（影響電子供體的氧化勢能）和氧蒽雜環上苯酚基的存在形式（影響電子受體的還原勢能）對熒光素的PeT效果和熒光量子產率具有顯著的影響。通過調整中位苯環上基團的取代類型以及氧蒽雜環上苯酚基的存在形式（質子化形式或去質子化形式）可以實現對熒光發射效果的調控。探針11在羧基熒光素的基礎上，中位苯環 2號位上的羧基被替換成甲基，4號位引入新的基團甲氧基，氧蒽雜環上的酚羥基被半乳糖取代。探針11未與β-半乳糖苷酶識別之前，由于氧蒽雜環的酚羥基被半乳糖取代，因此中位苯環部分對氧蒽雜環的PeT效應足夠強，此時探針的熒光量子產率較低，熒光幾乎處于淬滅狀態。當β-半乳糖苷酶與探針識別后，在酶的催化下，半乳糖從探針分子上斷裂，生成的產物在中性或堿性環境下以去質子化的苯酚離子形式存在，此時中位苯環部分對氧蒽雜環的PeT效應大大減弱，熒光量子產率升高，熒光發射得以恢復。雖然該探針能夠在體外實現對 β-半乳糖苷酶活性高達 440倍的熒光響應，但是其細胞成像的效果卻并不十分理想。最大的問題在于該探針被水解后的產物在細胞中的保留效果較差。

為了解決這個問題，該團隊[53]于 2007年報道了一例新型熒光探針12 (圖11)。該探針在探針 11的基礎上引入乙酰羥甲基酯（acetoxymethyl，AM）以增加其細胞內保留能力。探針進入細胞被β-半乳糖苷酶水解后，緊接著被細胞內的酯酶水解，使得探針以羧酸離子形式存在，親水性大大增強，不容易擴散出細胞，從而實現細胞內β-半乳糖苷酶的高分辨率成像。該探針還可對小鼠腫瘤模型中外源性β-半乳糖苷酶活性進行檢測和成像（外源性β-半乳糖苷酶通過連接抗生素蛋白而定位于癌細胞）。但不足的是，該探針需要兩種酶的協同作用，響應時間較慢。而且酯酶在細胞外區域普遍存在，可能會使得探針未進入細胞內之前就被酯酶水解成水溶性的羧酸鹽形式，影響其進入細胞的能力，使得活體內成像效果降低。

為了進一步改善此問題，該團隊[54]于 2011年報道了一例新型β-半乳糖苷酶熒光探針13 (圖12)。該探針能夠完美解決細胞穿透能力限制、細胞內保留能力差等問題，實現對果蠅組織中β-半乳糖苷酶活性的高分辨率成像。該探針不再以PeT為熒光響應機理，而是以氧蒽雜環類探針的另一種常見的探針設計機理——螺環開閉機理設計而成。未被β-半乳糖苷酶水解前，在生理pH條件下，探針主要以螺環形式存在，處于熒光淬滅狀態。一旦被β-半乳糖苷酶水解，生成的產物在生理pH條件主要以螺環開環的形式存在，能夠發射強熒光，從而實現對β-半乳糖苷酶高達76倍的熒光響應。遺憾的是，該探針不能很好地用于小鼠腫瘤模型內β-半乳糖苷酶的成像，主要原因在于該探針存在較高的熒光背景強度。

圖11 探針12與β-半乳糖苷酶的響應示意圖Fig.11 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 12

圖12 探針13與β-半乳糖苷酶的響應示意圖Fig.12 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 13

為了進一步提高探針的成像信噪比，實現小鼠腫瘤模型內β-半乳糖苷酶的識別及高分辨成像，該團隊[21]于 2015年設計了一例能夠用于小鼠腹膜小轉移瘤內β-半乳糖苷酶成像的熒光探針14 (圖13)。該探針在探針 13的基礎上，引入強拉電子基團亞甲基三氟化碳結構單元（—CH2—CF3）來提高螺環狀態的存在比例（未與酶識別之前），從而降低探針分子的背景熒光強度，實現對β-半乳糖苷酶更大的熒光響應比例。實驗結果顯示該探針能夠在生理pH條件下實現對β-半乳糖苷酶高達1420倍的熒光響應。作者不僅將該探針用于7種卵巢癌細胞內β-半乳糖苷酶的可視化熒光成像，而且還實現了卵巢癌小鼠模型內窺鏡成像，表明該探針具有應用于臨床上診斷卵巢癌轉移和熒光指導手術切除腫瘤的潛能。

2016年，Han等[57]報道了一例基于ICT機理的雙光子比率型熒光探針15 (圖14)。該探針在具有雙光子發射性能的 1,8-萘酰亞胺熒光團上引入半乳糖，半乳糖的引入使得熒光團的ICT程度發生變化，熒光發射峰藍移至 440 nm。與 β-半乳糖苷酶識別后，在酶的水解作用下，探針釋放出1,8-萘酰亞胺熒光團（最大發射波長為545 nm），實現對β-半乳糖苷酶的熒光比率響應。實驗結果顯示該探針能夠成功實現活細胞和活體內β-半乳糖苷酶的高分辨率雙光子成像。

圖13 探針14與β-半乳糖苷酶的響應示意圖及細胞成像圖Fig.13 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 14 and fluorescent images in living cells

圖14 探針15與β-半乳糖苷酶的響應示意圖Fig.14 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 15

圖15 探針16與β-半乳糖苷酶的響應示意圖及細胞成像圖Fig.15 Proposed sensing mechanism for β-Gal of probe 16 and fluorescent images in living cells

同年，Zhu等[23]報道了一例近紅外比率型熒光探針16 (圖15)。該探針以苯并吡喃腈的衍生物為母體，在母體上引入半乳糖單元作為識別基團。苯并吡喃腈的衍生物具有典型的D-π-A電子推拉體系、光穩定性極好、發射波長位于近紅外區域而且具有約150 nm的斯托克斯位移，是一種具有優良光物理性能的近紅外熒光團。該探針同樣利用典型的ICT機理設計而成，β-半乳糖苷酶水解前后，探針的ICT程度發生明顯變化，熒光最大發射波長紅移（從500 nm紅移至685 nm），實現對β-半乳糖苷酶的比率型熒光響應?；诒讲⑦拎嫜苌锪己玫臒晒庑阅芤约疤结樀谋嚷薯憫Ч?，該探針被成功應用于卵巢癌細胞內熒光成像和結腸癌小鼠模型內β-半乳糖苷酶活性的高分辨率三維成像。

3.3 硝基還原酶探針的研究進展

硝基還原酶（nitroreductase, NTR, EC 1.7.99.4）是人體內一種代謝芳香族硝基化合物或者硝基取代的雜環化合物的還原酶。據文獻報道，硝基還原酶濃度的升高與缺氧腫瘤的發生、侵襲和遷移存在密切的關系[3-5]。腫瘤的低氧通常伴隨著微脈管的異常增生，因此會限制化療藥物擴散進入腫瘤內部，使治療效果大大降低[58]。因此檢測腫瘤內硝基還原酶的活性可以實現腫瘤的早期診斷和化療藥物的抗癌效果的評估。近年來，一系列性能優良的小分子熒光探針[3-5, 24, 26, 31-32, 59-61]被開發出來用于缺氧腫瘤內硝基還原酶活性的實時原位監控和可視化熒光成像。

硝基還原酶熒光探針的設計原理大致可以分為兩類，即基于多米諾反應機理和基于硝基直接還原成氨的反應機理實現在硝基還原酶識別前后熒光信號的改變[62]。所謂的多米諾反應機理是指探針上硝基還原酶識別基團硝基被酶還原成羥胺或氨基后電子重新排列而誘導碳氧鍵斷裂反應（電子重排和1, 6-消去反應），釋放出熒光團，實現熒光信號的改變。基于此反應機理，Qian等[24]于2011年報道了一例能夠實現硝基還原酶比率型檢測的熒光探針17 (圖16)。該探針以萘酰亞胺衍生物為熒光團，在熒光團上引入硝基芐基單元作為識別基團，識別基團與熒光團之間通過對氨基甲酸酯結構單元連接。具有強吸電子能力的氨基甲酸酯的存在削弱了萘酰亞胺分子內電荷轉移程度，使熒光探針發射波長藍移至475 nm。一旦硝基還原酶識別探針，探針通過多米諾反應將萘酰亞胺（最大發射波長為550 nm）釋放，從而實現對硝基還原酶的比率型熒光響應。實驗結果顯示該探針具有較好的生物相容性和細胞穿膜能力，能夠用于不同缺氧狀態下細胞內硝基還原酶活性的監測以及體外腫瘤內硝基還原酶的成像研究。

圖16 探針17與硝基還原酶的響應示意圖Fig.16 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 17

2013年，基于上述同樣的機理，Ma等[59]設計合成了一例高靈敏的硝基還原酶熒光探針 18 (圖17)。該探針以試鹵靈為熒光團，在熒光團上引入5-硝基呋喃作為識別基團。未與硝基還原酶識別前，5-硝基呋喃的引入使探針處于熒光淬滅狀態。一旦與硝基還原酶發生特異性識別，探針發生多米諾分解反應釋放出試鹵靈熒光團，實現熒光響應。實驗結果表明該探針可用于缺氧腫瘤細胞中硝基還原酶活性的檢測和可視化成像研究。

2015年，Zhang等[32]報道了一例能夠用于腫瘤細胞和組織內硝基還原酶檢測和可視化成像的雙光子熒光探針19 (圖18)。該探針以具有優良雙光子發射性能的萘衍生物作為熒光團，引入對硝基芐基作為識別基團。硝基還原酶識別前后，探針出現高達70倍的熒光強度變化。作者利用該探針成功實現缺氧HeLa細胞中硝基還原酶的高分辨率雙光子成像，進一步驗證了腫瘤細胞缺氧狀態與硝基還原酶濃度的關系。

圖17 探針18與硝基還原酶的響應示意圖Fig.17 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 18

另一種常見的用于設計硝基還原酶探針的策略為基于熒光團上的硝基直接還原為氨基的反應機理。通過將吸電子基團硝基直接轉化成氨基使得熒光團分子內的電子云分布或電子環境發生顯著改變，從而實現熒光性能的變化?；诖嗽O計策略，2013年，Tang等[31]報道了一例近紅外硝基還原酶探針20 (圖19)。該探針以具有近紅外發射性能的七甲川菁染料為母體，在母體上引入硝基咪唑作為識別基團。硝基還原酶將吸電子基團硝基咪唑直接還原成氨基咪唑從而實現熒光從淬滅到恢復的變化。實驗結果顯示，該探針在不同氧氣水平條件下的熒光成像強度存在明顯差異，低氧條件下熒光強度明顯增強。作者成功將該探針用于研究實體瘤變化時上皮細胞-間質細胞的轉化過程與細胞內的缺氧狀態之間的關系。

圖18 探針19與硝基還原酶的響應示意圖及缺氧狀態下的細胞成像圖Fig.18 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 19 and fluorescent images in living cells under hypoxic conditions

2015年，Li等[26]報道了一例超靈敏的近紅外硝基還原酶探針21 (圖20)。探針分子中的硝基苯基團在硝基還原酶的催化下被直接還原成苯胺從而實現熒光從淬滅到恢復的變化。作者合成了5例探針來研究硝基在苯環上的取代位置以及硝基苯與熒光團母體之間的連接基團類型對酶識別能力的影響，最終發現探針21（對硝基取代，酯鍵連接）與酶具有最強的親和力和識別效果。實驗結果顯示探針21能夠實現對硝基還原酶高達110倍的熒光響應?；谠撎结樀某`敏和高選擇響應效果以及優良的近紅外發射性能，作者將該探針成功用于缺氧條件下A549細胞內成像及小鼠低氧腫瘤模型內高分辨率成像。

圖19 探針20與硝基還原酶的響應示意圖及不同氧氣狀態下的細胞成像圖Fig.19 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 20 and fluorescent images in living cells under different oxygen conditions

圖20 探針21與硝基還原酶的響應示意圖及缺氧狀態下的細胞及活體成像圖Fig.20 Proposed sensing mechanism for NTR of probe 21 and fluorescent images in living cells under hypoxic conditions and in vivo

3.4 γ-谷氨酰轉肽酶探針的研究進展

γ-谷氨酰轉肽酶（γ-gumatyl transpeptidase, GGT, EC 2.3.3.2）是人體內一種重要的細胞膜結合酶，主要功能是選擇性催化裂解γ-谷氨?；鵞63]。據文獻報道，GGT在體內發揮著關鍵的生理病理作用，例如藥物濫用所導致的肝臟損傷通常伴隨著 GGT 水平升高[64]，一些癌癥如子宮頸癌、卵巢癌等的發生和發展也與癌細胞內過表達的 GGT水平存在密切關系[65-66]。因此，開發高效的檢測手段用于體內GGT活性的檢測具有巨大的應用價值。2011年，Urano等[28]報道了一例基于羅丹明螺環開閉機理的 γ-谷氨酰轉肽酶熒光探針22 (圖21)。該探針以羅丹明為母體，在母體上引入谷氨酸作為識別基團。未與GGT識別前，探針以螺環形式存在而處于熒光淬滅狀態。當探針與 GGT發生識別作用后，在酶的催化下，探針中的γ-谷氨酰基團斷裂，分子內電子重排誘導螺環打開，從而實現熒光恢復的效果。實驗結果顯示該探針不僅能夠在 11種人卵巢癌細胞內實現高分辨率成像，還能夠通過外表直接噴灑探針溶液的方式在超短時間內（1 min）實現卵巢癌小鼠模型內高信噪比成像。基于該探針超高靈敏、超快速響應、高分辨活體成像效果，該探針具有應用于臨床上手術指導腫瘤切除的潛能。

2015年，Fan等[29]報道了一例比率型γ-谷氨酰轉肽酶探針 23 (圖 22)。該探針是以氟硼二吡咯（boron dipyrromethene, BODIPY）為母體，在母體上引入谷胱甘肽作為識別基團。谷氨酰轉肽酶識別探針后，在酶的催化下，探針發生γ-谷?；D移作用，釋放出半胱氨酸的氨基，接著氨基對硫原子發生親核攻擊，形成分子內的N-S交換，產生氨基取代的BODIPY，從而實現酶促反應前后熒光信號的變化，達到對γ-谷氨酰轉肽酶熒光響應的目的。實驗結果顯示該探針能夠在體外達到對γ-谷氨酰轉肽酶快速、高選擇性、比率響應的效果，并且被成功用于卵巢癌細胞內γ-谷氨酰轉肽酶活性的檢測和高分辨率成像。

同年，Ma等[67]報道了一例高靈敏的γ-谷氨酰轉肽酶熒光探針24 (圖23)。該探針以甲酚紫為熒光團母體，在母體的氨基位置上引入谷氨酸作為識別基團。利用γ-谷氨酰轉肽酶的谷?；D移作用將谷氨酸從探針分子上斷裂下來，釋放出具有強熒光發射效果的甲酚紫熒光團，實現熒光“OFF-ON”的效果。實驗結果顯示該探針不僅能被用于活細胞內γ-谷氨酰轉肽酶熒光成像和人血清中 γ-谷氨酰轉肽酶活性的檢測，而且還成功實現了對正常人血清樣品和肝癌患者血清樣品的區分。

2016年，Wu等[33]報道了一例γ-谷氨酰轉肽酶雙光子熒光探針25 (圖24)。該探針以苯并吡喃腈作為熒光團母體，谷氨酸作為識別基團。在γ-谷氨酰轉肽酶的催化作用下，處于熒光淬滅狀態的探針將發生谷氨?；D移作用釋放出強熒光發射的苯并吡喃腈熒光團，實現對γ-谷氨酰轉肽酶的熒光響應。實驗結果表明該探針不僅能在人卵巢癌A2580細胞內實現對 γ-谷氨酰轉肽酶的單光子與雙光子熒光成像，而且還能夠用于斑馬魚模型內 γ-谷氨酰轉肽酶熒光成像。利用斑馬魚模型，該探針成功揭示了γ-谷氨酰轉肽酶活性與藥物導致的肝損傷之間的關系。

圖21 探針22與γ-谷氨酰轉肽酶響應示意圖Fig.21 Proposed sensing mechanism for GGT of probe 22

圖22 探針23與γ-谷氨酰轉肽酶響應示意圖Fig.22 Proposed sensing mechanism for GGT of probe 23

4 總結和展望

綜上所述，本文主要綜述了反應激活型酶識別熒光探針的設計策略及與重大疾病密切相關的單胺氧化酶、β-半乳糖苷酶、硝基還原酶、γ-谷氨酰轉肽酶熒光探針的研究現狀。雖然目前相應的酶熒光探針取得了一定的進展，但還是有如下亟待解決的問題。

（1）目前識別亞細胞器中酶的熒光探針報道基本沒有，而不同細胞器中酶活性的不同可能會引起不同的疾病，因此研制新型靶向識別不同細胞器中酶的熒光探針會成為廣大科研工作者的研究熱點。

（2）設計合成生物相容性好、水溶性適中、能對活體內深層組織中酶活性檢測和可視化成像的近紅外熒光探針仍是一個重要的研究領域。

（3）為提高對酶識別的選擇靈敏度和成像時空分辨率，發展比率型雙光子酶識別熒光探針也會是未來十分活躍的研究領域。

（4）隨著蛋白質及轉錄組學的進一步發展，越來越多的與疾病相關的標志酶被挖掘，而識別新標志酶的熒光探針的研究將受到廣泛的關注。

圖23 探針24與γ-谷氨酰轉肽酶響應示意圖及血清與細胞成像圖Fig.22 Proposed sensing mechanism for GGT of probe 24 and fluorescent images in living cells and serum

圖24 探針25與γ-谷氨酰轉肽酶響應示意圖及細胞成像圖Fig.24 Proposed sensing mechanism for GGT of probe 25 and fluorescent images in living cells

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Progress in research of reaction-activated fluorescent probe for enzymes

QIAN Ming, ZHANG Liuwei, WANG Jingyun
(School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, Liaoning, China)

Enzyme plays an extremely important role in maintaining homeostasis and the normal life activities in biological systems. The abnormality of some particular enzymes activity is closely relevant to the occurrence and development of related diseases. Therefore, it is of great significance to detect and visualize specific enzyme in vivo with an in-situ and real-time method. The chemical fluorescent probes are endowed with the obvious advantages such as good selectivity, high sensitivity, high imaging resolution and so forth. In recent years, researchers have designed and synthesized a series of fluorescent probes for enzyme detection and visualized imaging in living systems. Based on the trigger mode of fluorescence response, the enzymatic fluorescent probes can be generally divided into two categories: (1) probes based on the recognition between enzyme and specific groups of its inhibitor existing in the probes, called inhibitor-based enzymatic fluorescent probes and (2) probes based on the effective catalytic ability of specific enzyme, also known as the reaction-activated enzymatic fluorescent probes. Herein, in this review, the design strategies of reaction-activated fluorescent probe for enzymes and the research progress of reaction-activated fluorescent probes for four important disease-related enzymes (monoamine oxidase, β-galactosidase, nitroreductase, γ-gumatyl transpeptidase) were mainly reviewed, and the future research of fluorescent probes for enzymes was prospected.

fluorescence; probes; enzyme; imaging; cell biology

Prof. WANG Jingyun, wangjingyun67@dlut. edu.cn

O 657.3

：A

：0438—1157（2017）01—0008—15

10.11949/j.issn.0438-1157.20161279

2016-09-12 收到初稿，2016-10-19 收到修改稿。

聯系人：王靜云。

：錢明（1993—），男，博士研究生。

國家自然科學基金項目（21376039）。

Received date: 2016-09-12.

Foundation item: supported by the National Natural Science Foundation of China (21376039).