一例肝豆狀核變性家庭的ATP7B基因突變研究

趙龍國慧劉世國宋衛青

一例肝豆狀核變性家庭的ATP7B基因突變研究

趙龍1國慧2劉世國3宋衛青1

目的 檢測肝豆狀核變性（Wilson Disease）患兒及其父母的ATP7B基因突變類型。方法 采用全基因組外顯子測序技術（WES）對1例肝豆狀核變性患兒及其父母ATP7B基因進行檢測。結果 患兒母親ATP7B-exon8基因發生了錯義突變（c．2 333G＞T），導致p．R778L；患兒父親ATP7B-exon11基因發生了錯義突變（c．2 621C＞T），導致p．A874V。結論 患兒父母均為肝豆狀核變性基因攜帶者。

肝豆狀核變性；ATP7B基因；突變；測序分型

肝豆狀核變性（Wilson Disease）又稱威爾遜氏病，是一種遺傳性銅代謝障礙所致的肝硬化和以基底節為主的腦部變性的常染色體隱性遺傳的銅代謝障礙疾病。世界范圍發病率為1/10萬～1/3萬[1]，雜合子頻率為1/200～1/100[2]，其中中國是高發區，發病年齡多在5～35歲[3]，但報道經基因確診的3～72歲均有[4-5]。該病是位于13q14.3的ATP7B基因突變所致，導致銅轉運P型ATP酶缺失，從而導致血漿銅藍蛋白降低及銅在體內器官的沉積等一系列臨床表現。肝豆狀核變性是目前少數可以治療的神經遺傳病之一，患者如果能在發病早期或癥狀前期即被確診并得到及時治療，大多預后良好，反之病情逐漸加重甚至危及生命。

1 資料與方法

1.1 一般資料

患兒，女，12歲，父母非近親結婚。血清學檢查結果顯示血清銅藍蛋白52 mg/L，23 h尿銅排泄量232 μg，影像學檢查結果顯示輕度肝硬化，腦MRI雙側豆狀核呈對稱性低密度陰影，診斷為肝豆狀核變性。采集患兒及其父母外周靜脈血5 ml，用于提取DNA。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 患者、患者父母分別采集靜脈血10 ml，保存于抗凝管中。

1.2.2 基因組DNA提取 選用天根生化科技生產的DNA提取試劑盒，對該家庭3人采集靜脈血進行基因組DNA提取。

1.2.3 外顯子測序（WES） 對基因組DNA隨機片段化制備cDNA文庫。PCR擴增并純化富集回收產物后，采用安捷倫人全外顯子試劑盒特異性捕獲外顯子區域序列。使用安捷倫2100檢測DNA樣品的濃度和含量。在Illumina MISeq2000高通量測序平臺對樣品進行雙向測序，并通過SOAPaligner2.20對比軟件進行生物信息學分析，初步篩選高質量單核苷酸多態性（SNP）位點。

1.2.4 Sanger重測序驗證 對于WES測序所檢測到的突變結果在原標本中進行Sanger測序。來驗證外顯子測序結果的準確性。PCR突變所在的外顯子，引物序列由青島生工生物科技有限公司合成。 取擴增產物10 μl置于15 g/L的瓊脂糖凝膠中電泳，使用ABI70測序儀（Applied Biosystems）進行產物程序。采用DNAMAN軟件進行生物信息學分析，并與GenBank中的ATP7B基因序列進行對比，判斷是否為新突變位點。

2 結果

2.1 全基因組外顯子測序

結果表明，患兒的父親 ATP7B-exon11基因發生了錯義突變（c.2 621C＞T），導致p.A874V；患兒的母親ATP7B-exon8基因發生了錯義突變（c.2 333G＞T），導致p.R778L。

2.2 Sanger測序驗證

以PCR擴增為基礎的Sanger測序也得到了與WES方法完全相同的突變。

3 討論

肝豆狀核變性廣泛分布于各族群人種之間，通常發生于兒童和青少年期，少數成年期發病。若早發現早診斷早治療，一般較少影響生活質量和生存期。銅代謝障礙是該病的主要特征之一。銅離子在體內異常沉積的速度、部位不同使得患者出現一個或多個器官功能損傷，隨著病情的不斷進展，可導致數個臟器不可逆的損傷，并出現各種并發癥，危及患者生命。

傳統臨床上用于診斷肝豆狀核變性的手段還比較單一，給臨床診治帶來一定困擾。較多的肝豆狀核變性的患者早期癥狀復雜多樣，易被誤診為其他疾病如慢性肝炎、肝硬化、脾功能亢進、溶血性貧血等。而且銅代謝檢查存在自身的局限性，假陰性假陽性結果較多。若能及早得到正確的診斷和治療，大多數患者可恢復良好，且生活質量和壽命與正常人相似。

DNA測序技術是目前診斷肝豆狀核變性最常用的基因檢測方法，是該病基因診斷的標準。ATP7B基因全長約80 kb，由21個外顯子和20個內含子組成[6]。基因長度為78 821 bp，大多數外顯子的長度為200 bp左右。結構分析表明肝豆狀核變性基因呈一個開放讀碼框，cDNA序列長度為4 233 bp，編碼由1 411個氨基酸組成的P-型銅轉運ATP酶。

隨著基因測序技術的不斷發展，及早確定ATP7B的基因突變類型，對于盡早明確診斷，及時做出干預有非常重要的意義，使機體早日免受器官損傷的風險。目前該基因以逐步作為產前診斷和新生兒篩查的指標[7]。然而ATP7B基因突變類型非常多，目前報道的ATP7B基因突變類型有550多種，以少數幾個突變為主，存在明顯的種族和地區差異[8]。這些突變大多是雜合突變，了解這些突變對基因檢測至關重要。Kenney SM等[9]于2007年報道在肝豆狀核變性的518種突變中，379種是致病的，139種為非致病性的，還有一些突變尚不能確定是否致病。

我們本次的研究僅有1例樣本，對研究基因型與表現型的關系尚存在局限性。另外，闡明本地區ATP7B基因突變類型對于產前診斷和新生兒篩查非常重要，未來我們將收集更多患者資料，確定本地區肝豆狀核變性基因變異的基礎，并在此基礎上進一步闡明ATP7B基因型與表現型的關系。

[1] Figus A，Angius A，Loudianos G，et al． Molecular pathology and haplotype analysis of Wilson disease in Mediterranean populations[J]．Am J Hum Genet，1995，57（6）：1318-1324．

[2] Als A，Walker AP，Ashkan K，et al． Wilson’s disease[J]． Lancet，2007，369（9559）：397-408．

[3] Roberts EA．Schisky ML． Division Gastroenterology and Nutrition． A practice guideline on Wilson disease[J]． Hepatology，2003，37（6）：1475-1492．

[4] Wilson DC，Phillips MJ，Cox DW，et al． Severe hepatic Wilson’s disease in preschool-aged children[J]． J Pediatr，2000，137（5）：719-722．

[5] 陳晶貞，孟艷燕． ATP7B蛋白在肝豆狀核變性中的分子機制研究進展[J]． 臨床和實驗醫學雜志，2008，7（8）：183-185．

[6] 陳定邦，馮黎，李洵樺． 肝豆狀核變性的分子生物學研究進展[J]．分子診斷與治療雜志，2011，3（2）：120-124．

[7] Roberts EA，Schilsky ML． Diagnosis and treatment of Wilson disease：an update[J]． Hepatology （Baltimore， Md），2010，47（6）：2089-2111．

[8] 張秀海，劉偉． 肝豆狀核變性的遺傳學研究及治療進展[J]． 臨床醫學，2008，28（11）：109-111．

[9] Kenney SM，Cox DW． Sequence variation database for the Wilson disease copper transporter，ATP7B [J]． Hum Mutat，2007，28（12）：1171-1177．

Study on ATP7B Gene Mutation in a Family With Wilson Disease

ZHAO Long1GUO Hui2LIU Shiguo3SONG Weiqing11 Medical College of Qingdao University, Qingdao Shandong 266003, China; 2 International Clinic, Qingdao Municipal Hospital, Qingdao Shandong 266003, China; 3 Prenatal Diagnosis Center, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao Shandong 266003, China

ObjectiveTo investigate the type of ATP7B mutation in a child with Wilson disease and her parents.MethodsUsing whole-genome exon Sequencing(WES) to detect ATP7B gene in one patient with Wilson's disease and her parents.ResultsMissense mutations (c.2 333G＞T) in ATP7B-exon8 gene occurred in patient’s mother, which lead to p.R778L;Missense mutations (c.2 621C＞T) in ATP7B-exon8 gene occurred in patient’sfather, which lead to p.A874V.ConclusionPatient’s parents are Wilson disease gene carriers.

wilson disease; ATP7B gene; mutation; multilocussequence typing

R446．6

A

1674-9316（2017）06-0090-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．06．054

1 青島大學醫學部，山東 青島 266003；2 青島大學附屬青島市市立醫院國際門診，山東 青島 266003；3 青島大學醫學院附屬醫院產前診斷中心，山東 青島 266003

宋衛青