探討分子生物學技術在微生物檢驗中的應用研究

侯鳳英

山東省菏澤市疾病預防控制中心檢驗科，山東菏澤 274000

探討分子生物學技術在微生物檢驗中的應用研究

侯鳳英

山東省菏澤市疾病預防控制中心檢驗科，山東菏澤 274000

伴隨分子生物學的技術飛速發展，微生物的檢驗方法與技術被廣泛應用與研究。近幾年，國內外的學者不斷深入研究，已經建立適用、快速、低耗、簡便與特異微生物的檢驗方法與技術，特別是對于分子生物學的技術應用，其中較為突出的有生物芯片、聚合酶鏈的反應與核酸探針等。該文著重分析了各種分子生物學的技術應用進展。

分子生物學；微生物檢驗；應用

通常傳統微生物的檢驗技術時根據微生物具體存在狀態對其分裂與地位進行確定，這種傳統檢測方式容易存在誤差，就算是同一類微生物，生理生化的性狀與形態都會存在差異，鑒定準確性難以保證。而在微生物檢驗的工作中，研究現代化分子生物學的技術時，主要是研究蛋白質遺傳、結構與功能；生物大分子；核算機器的表達產物等互相作用科學。將現代化分子的生物學技術應用于微生物的檢驗中時，能夠獲得以下效果，現代的分子生物學研究的領域比較廣泛，在很大程度上可以提高檢驗范圍與精度；伴隨微生物檢驗認可的程度提高，可以促進分子生物學發展，進而推動各領域工作的進步。近幾年，伴隨微生物的檢驗認可程度不斷提升，推動了現代化分子生物學發展與進步，這在某種程度上會促進社會進步，提高檢驗準確性與可靠性。

1 聚合酶鏈的反應技術

由于微生物檢驗種類比較多。如果檢驗目的不一樣，容易造成檢驗技術方面的差異。在現代的分子生物學檢驗技術中，其要求的是高準確性、高精度與快速度，在各種檢驗技術中聚合酶鏈的反應技術屬于一種分子生物學的技術，其較具有代表性。就目前而言，應用聚合酶鏈的反應技術可以同時鑒定與檢測不同病原的微生物，檢驗原理如下：在同一聚合酶鏈的反應管之中，能夠添加不同病原微生物特異性的引物，產生聚合酶鏈的反應，實現同時檢測[1]。

2 基因芯片的技術

為了在微生物的檢驗中充分發揮現代化分子生物學的技術應用效果，相關人員逐漸研究出較高端基因芯片的技術。早在上個世紀的90年代就開發出了基因芯片的技術，其是把尼龍膜與玻片當作載體，于單位面積中有秩序、高密度排列中很多生物活性的分子，主要是為了能夠一同對多種疾病進行檢測，或是對不同生物的樣品進行分析。在較為復雜微生物的檢驗中比較常用基因芯片的技術，在長期總結和發展過程中，基因芯片的技術以相對成熟，并且該技術有著其他方式無法比擬的優越性。①可以將抗體產生以前感染患者檢測中應用基因芯片的技術，以便臨床上診斷。目前，大部分患者的臨床癥狀比較特殊，且不能經傳統檢測技術獲取精確信息與數據，這使得治療過程因為缺乏準確數據，也就不能針對患者實際情況治療，導致患者最佳治療時機延誤，影響了患者康復。但采取基因芯片的技術進行檢測，能夠早診斷患者基本，做到早發現與早治療。②基因芯片的技術能夠彌補其他檢測技術缺陷，例如：可疑檢測出其他技術無法決定的疾病感染，在臨床上，感染始終是個難題，應用基因芯片的技術，可以準確確定患者感染程度與范圍等。

3 核算探針的技術

伴隨現代化分子生物學的技術發展，在很大程度上完善了微生物的檢驗體系。因為衛生影響較為廣泛，尤其對于生物、社會與醫學領域有著決定性影響。因此，如果單純應用基因芯片或是聚合酶鏈的反應技術來檢測，難以取得理想效果，這就需要相關人員深入研究核算探針的技術[2]。核算探針的技術和上文兩種技術有著本質區別，就概念而言，核算探針的技術主要指的是帶有標記特異DNA的片段，按照堿基互補的原則，這種技術能夠和目的DNA進行雜交，然后通過特定方式對標記物進行測定。從現今微生物的檢驗來看，核算探針的技術在下面幾個方面應用比較廣泛。①核算探針可以對細菌中抗藥基因進行檢測，而抗藥基因檢測的結果可以為醫學治療藥物研究提供參考，防止患者治療時體中出現抗藥性，以充分發揮藥物治療的效果，緩解患者病情。②核算探針技術能夠檢測那些用于生化鑒定、不能培養、缺少診斷抗原以及不能觀察微生物的產物，在臨床上，腸毒素的檢測主要使用核算探針檢測，這種檢測技術可以有效獲取腸毒素指標與相關數據，進而給臨床治療的工作提供參考。③核算探針能夠對病毒病進行檢測，如：在流行病學的調查與感染病毒檢測中均會使用核算探針，并且能夠用來對無毒菌株以及有毒菌株進行區分。核算探針這項技術能夠直接檢測物質本質，并且經物質表面獲取結果，尤其在DNA的檢測方面有著極高的權威性與準確率。

4 DNA分子的標記技術

在很多微生物的分類、檢驗與遺傳育種方面都會使用DNA分子的標記技術，就目前而言，DNA分子的標記技術主要包含3種：①把分子雜交與電泳作為核心；②把PCR與電泳作為核心；③把DNA的序列作為核心。

4.1 隨機擴增的多態性DNA/RAPD

RAPD的技術主要是通過隨機合成引物，應用PCR來擴增靶細胞的DNA，因為引物的長度不一致，容易產生各種大小不一樣PCR擴增的產物?，F階段，RAPD應用比較廣泛，主要操作過程如下：提取樣本中的DNA，隨機對引物PCR進行擴增，對電泳進行凝膠，放射自顯影或是EB染色。通常情況下，在分析與鑒定菌株之間、微生物中間以及亞種間親緣關系時，經常會采用RAPD的技術，即使在微生物的檢驗中，RAPD的技術比較簡便與快速[3]。

4.2 限制片段的長度多態性DNA/RFLP

在體中不同生物結構存在巨大差異，同類生物不同個體間，就算蛋白質的產物功能與結構基本一樣或是完全一樣，但是DNA的水平還是存在明顯差異。而RFLP指紋圖譜在微生物種類與種間分型鑒定中比較適用，屬于種群、種與種類分類手段。通常RFLP的技術操作過程如下：提取樣本中的DNA，限制內切酶的酶切，對電泳進行凝膠，雜交，清洗膜，最后放射自顯影。

5 分析核酸序列

分析核酸序列主要過程是在核算的序列中查找基因位置，并對已知DNA的序列進行標記。核算的測序步驟如下：提取與純化核酸，進行PCR的擴增，應用自動序列的分析儀測序PCR產物，把序列提交至GeNBANk，經BLAST的程序以及已知序列分析相似性，分析系統發育情況，然后繪制出系統的發育樹。在處理數據時，微生物種、屬間遺傳距離計算方式比較多，Jukes-CNAtor的方法比較常用。在完成遺傳距離的計算以后，要建立系統的進化樹，同樣有很多建立方法，例如：NeighborJoiN。分析系統的發育樹時，常用軟件包含ARB與MEGA等。在真菌核酸的序列中，測序對象主要是18SrDNA，主要原因是長度相對較長，所含信息比較多。一般情況下，ITS的序列屬于中度保守的序列，保守性的表現在種內較為一致，但是在種間則有顯著差異。也就因為ITS的序列該特點，使其比較適用于分析種類或是屬內物種間差異明顯的一些菌群。對于細菌而言，16SrRNA的序列分析逐漸變成種屬分類與鑒定常用的方式，現已報道了超過2500個16SrRNA的序列。在微生物的細胞之中16SrRNA數量比較大，其分子量相對適中，提取比較容易，并且16Sr-RNA一級結構較為保守，其在微生物分類與檢驗中比較有用，能夠方便微生物間同源性的關系分析。通常認為只要16SrRNA的序列同源性超過97%，就是同一個種類，但是16SrRNA的寡核苷酸中順序分析無法對微生物的菌株進行鑒定，例如：膿腫的分枝桿菌與龜分支的桿菌中，DNA的同源性＜50%，但是16SrRNA的基因同源性高達99%[4]。

6 PCR的技術

在微生物的檢驗中，PCR的技術比較常見，其是在同一個反應管之中，添加不同病原微生物特異性的引物實施擴增，能夠用在各種病原性微生物同時鑒定與檢測中。早在上個世紀的90年代中期，我國就開始廣泛應用PCR的技術對感染病原性微生物進行檢測，例如：性病的致病菌、人類免疫的缺陷病毒以及肝炎病毒等。目前，PCR的技術逐漸用在結核桿菌的耐藥基因與分枝桿菌檢測與鑒定中，并且禽流感致病毒檢測中，同樣采取了PCR的技術。PCR的技術主要優勢是準確、快速與靈敏，但凡樣本中存在病原體，應用PCR就能夠檢測出。并且PCR的技術不會因為混合標本而受到影響，能夠從很多正常菌群標本之中檢測出病原菌，其對不易分離的病原菌鑒定比較有用，例如：螺旋體、分枝桿菌以及支原體衣原體等，可見在病原性微生物檢驗中，PCR應用的前景比較好。但是傳統PCR的技術也有諸多問題，例如：PCR在檢測RNA的病毒時，操作比較繁瑣，并且種間的污染環節比較多，容易出現假陰性或是假陽性的結果；產生引物的二聚體。因此，為有效規避傳統PCR的技術缺陷，逐漸研發出新型PCR的技術，并且已經用在實踐中，如：引物DNA的擴增、熱啟動的PCR、多重PCR以及逆轉錄的PCR等[5]。

7 結語

綜上，在微生物的檢驗中，現代化分子生物學的技術應用越來越普遍，這種技術優勢比較明顯，并且較為先進，能夠為臨床治療提供有效的依據。在微生物的檢驗中，分子生物學主要優勢就是廣泛、快速、高效與準確，近幾年，分子生物學的技術逐漸向著特異性與自動化方向進步，同時和其他技術、學科進行融合，這將會拓展分子生物學應用范圍，促進其發展與推廣。

[1]梅冰,陸翔,王永喬.微生物非培養技術在環境微生物領域的研究進展[J].化學工程師,2015,29(10):31-33.

[2]黃東紅,鄭友限,潘少敏.泉州市6例布魯菌病的微生物生化鑒定及分子生物學確認[J].福建醫科大學學報,2014,48(2):125-127.

[3]楊燕,孫夢家,蔣波.藥品無菌檢查中污染微生物的鑒定與OOS調查分析[J].中國醫藥工業雜志,2016,47(12):1559-1563.

[4]方婷子,施春雷.分子技術在食源性致病微生物檢測中的應用[J].食品安全質量檢測學報,2014,23(7):1923-1929.

[5]陳雯雯,段文峰,劉洋，等.新技術在食品微生物檢驗檢測中的應用[J].上海師范大學學報：自然科學版,2016,45(1):121-126.

R7

A

1672-5654（2017）05（c）-0191-02

10.16659/j.cnki.1672-5654.2017.15.191

2017-02-22）

侯鳳英（1967-），女，山東菏澤人，本科，研究方向：微生物檢驗。