鹿源中藥材的DNA條形碼鑒定研究進展※

張辛寧 許亮* 才麗平 王孟虎 夏靜文 王友辰

（1遼寧中醫藥大學藥用植物教研室，遼寧大連116600；2遼寧中醫藥大學中醫基礎教研室，遼寧沈陽110847）

鹿源中藥材的DNA條形碼鑒定研究進展※

張辛寧1許亮1*才麗平2王孟虎1夏靜文1王友辰1

（1遼寧中醫藥大學藥用植物教研室，遼寧大連116600；2遼寧中醫藥大學中醫基礎教研室，遼寧沈陽110847）

鹿源中藥材的來源復雜多樣，鑒定方法也有很多，如基原鑒定、性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定等。但在實際應用中，鹿源中藥材的鑒定難度極大，一般的鑒定方法很難滿足其鑒定要求，因此需要一種快速有效的鑒定方法來鑒定鹿源的真偽和質量。本文以網絡文獻檢索與手工檢索相結合的方法，梳理了近20年的文獻進行綜述。

鹿源；DNA條形碼；中藥鑒定

鹿源藥材為名貴中藥材。《中華人民共和國藥典》2015版（一部）規定：鹿茸來源為鹿科動物梅花鹿Cervus Nippon Temminck或馬鹿Cervus elaphus Linnaeus的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者習稱“花鹿茸”，后者習稱“馬鹿茸”。藥材市場上約有10多種鹿源藥材，如鹿茸、鹿角、鹿血、鹿鞭等，由于鹿茸的品種、年生等不同，鹿茸質量也就不同，肉眼難以輕易辨別，再加上市場上常用牛、驢等或不同品種來冒充正品，所以在鹿源市場上常有以劣充優、以假亂真的現象，給鑒定的準確性帶來了一定難度。一般傳統的鑒定方法由于其主觀性較大、對鑒定者的專業水平和經驗依賴性較強、通用性較差、特異性不強等，存在一定局限性，不利于建立規范化、標準化的鑒定方法[1-3]。目前，在鹿茸等貴重藥材及其原動物的分子鑒定方面有不少文獻報道采用了分子標記方法，此方法具有靈敏性高、準確性好、重現性好、簡單快速等優勢[4]。近些年DNA條形碼在國內外引起廣泛關注，COI(cytochrome c oxidase subunit I)基因的DNA條形碼技術具有強大的物種鑒定可靠性，因此成為目前常用的物種鑒定技術手段[5]。

1 鹿源中藥材的應用

隨著中醫藥知識的普及，預防、治療與保健更為人們所接受。遠在漢代就有“鹿身百寶”之說。所以，鹿源類中藥材更為人們所青睞。

《本草綱目》載鹿產品入藥，達17種。《中華人民共和國藥典》1977版（一部）收錄鹿角、鹿角膠、鹿角霜、鹿茸4味中藥[6]。在此之后，各版《藥典》一直沿用至今。《中藥大辭典》1977年版收錄鹿茸、鹿角、鹿血、鹿筋等18個條目，原動物均為鹿科動物梅花鹿或馬鹿，對麋鹿茸則另設條目記載[7]。《中華本草》1999年版收錄鹿茸、鹿角、鹿血、鹿鞭等20個條目。同時，分別對水鹿茸、麋鹿茸和狍茸等作了記載[8]。鹿產品的臨床使用與記述，品種日漸增多，且更加詳細。

鹿產品大多具有滋補、強壯作用。《本草綱目》將鹿茸收載于獸部第五十一卷，記載:“鹿茸生精補髓、養血益陽、強筋健骨、治一切虛損、耳聾、目暗、眩暈、虛痢”。《本草品匯精要》記載鹿腎:“主補腎氣。”《名醫別錄》謂鹿肉:“補五臟，調血脈”。鹿角溫腎陽，強筋骨，行血消腫。鹿角膠溫補肝腎，益精養血。鹿角霜溫腎助陽，收斂止血。鹿茸壯腎陽，益精血，強筋骨，調沖任，托瘡毒。鹿產品中有滋補強壯作用的還有，鹿血、鹿尾、鹿骨等。

我國是主要的產鹿國之一，鹿科的動物品種繁多，有10屬，18種在中國曾經產或現在仍產[9]。由于資源有限，價格高昂，給分析鑒定帶來一定難度，藥材市場上經常出現使用其他動物藥材充當鹿茸、鹿角等藥材出售的現象，以假亂真擾亂醫藥市場秩序。鹿角為鹿科動物馬鹿或梅花鹿已骨化的角或鋸茸后翌年春季脫落的角基，分別習稱“馬鹿角”“梅花鹿角”“鹿角脫盤”。鹿茸來源為鹿科動物梅花鹿或馬鹿的雄鹿未骨化密生茸毛的幼角。前者習稱“花鹿茸”，后者習稱“馬鹿茸”。鹿角膠、鹿角霜等也都是在鹿角的基礎上加工而成。鹿源品種來源雖多，但《藥典》規定正品均來源于鹿科動物馬鹿或梅花鹿，而藥材市場上出現過用其他動物藥材如駝鹿Alces alces Linnaeus、馴鹿Rangifer tarandus Linnaeus、狍（子）Capreolus capreolus Linnaeus、麋鹿Elaphurus davidianus MilneEdwards、白唇鹿Cervus albirostris Przewalski等以及其他動物的骨塊[10-11]來充當鹿茸、鹿角等藥材出售。鹿茸偽品還有用鹿皮、羊等包制成囊套，也有將各種鹿角切成薄片來冒充鹿茸片。這些因素都嚴重影響了鹿源中藥材的質量，所以更需要一種簡便、快速的鑒定方法。

2 DNA條形碼鑒定技術

DNA條形碼（DNA barcoding）技術是一種新興的、嶄新的分子鑒定體系，即通過比較一段通用DNA序列，對物種進行快速識別與鑒定，在生物物種鑒定方面有著廣闊的發展前景，目前該技術已成為物種分類和鑒定的研究熱點，相信隨著研究的深入，必將大大加快中藥鑒定標準化的進程[12-14]。DNA條形碼數據庫既是存儲DNA條形碼序列的工具，又是DNA條形碼和物種分析鑒定研究的平臺，對推動DNA條形碼研究發展具有極其重要的意義[15]。DNA條形碼鑒定技術是按照不同物種的DNA序列均是由腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）四種堿基不同順序排列而成，因此，可以對某一特定的DNA片段序列進行分析鑒定，從而區分不同物種。近年來，中藥DNA條形碼分子鑒定得到快速發展，目前已經取得階段性成果，對推動DNA條形碼研究發展具有重要意義。

從DNA條形碼概念提出到現在發展研究階段，“通用條形碼”的選擇一直都是人們最關注的問題之一。動物類藥材選用細胞色素C氧化酶1的線粒體COI基因作為DNA條形碼已基本形成共識。對于動物，Hebert將編碼細胞色素C氧化酶的線粒體基因COI作為DNA條形碼，隨后對昆蟲、鳥類和魚類鑒定的研究結果表明COI條形碼作為DNA條形碼應用于動物物種識別具有可靠性[16]。除此之外，以核糖體為代表的其他一些基因標記也被認可作為動物DNA條形碼使用。DNA核酸序列和特異引物PCR擴增的方法也常用于鑒定動物類藥材如鹿茸、鹿鞭、烏梢蛇、鱉甲等[17-19]，這些研究都取得了良好的效果。近些年來，國內外學者做了大量的COI實驗，結果表明COI具有很高的通用性，能夠有效并且快速地鑒別動物物種。

鹿源類藥材鑒定仍然存在一些問題。首先，《中國藥典》規定了梅花鹿和馬鹿這2個種，而并非某個產地，而不同產地之間就會存在差異；其次，對同一物種不同藥用部位如:角、血、鞭、筋、肉，甚至毛等DNA序列的比對難度很大。由于屬間及其以上DNA序列的差異遠大于同屬種間的差異，所以，從DNA水平上最具鑒定意義的是同屬內動物藥材的鑒定，因此在DNA水平上關鍵的是要找出DNA種間水平的差異[20]。本文應用DNA條形碼技術來鑒別傳統方法難以鑒別的鹿源中藥材領域。鹿源類中藥DNA條形碼鑒別方法相比于傳統的鑒別方法，具有以下幾個顯著特點：第一，可重復性。直接利用DNA序列進行鹿源的鑒定，具有可重復性。在鹿源個體發育過程中DNA序列不會隨之改變，雖然經過加工，形態可能發生變化，但DNA序列信息在此過程中不會改變，即使樣本部分受損也不會對識別結果產生影響；第二，快速、高效。特定的鹿源中藥材具有特定的DNA序列信息，不會因為形態上的趨同而導致物種的鑒別失誤，并且易于構建龐大的鹿源DNA數據庫，從而可以快速的鑒定大量樣本。第三，確定性。可獲得由四種堿基組成的核苷酸序列所構成的鹿源的明確數字信息，彌補了形態描述含糊不清的不足。第四，方便性，只需一對或幾對通用引物，在不同鹿源中藥材之間進行對比鑒定，在全球鹿源中藥材鑒定中可以形成統一的標準，任何人都可以利用DNA數據庫，方便序列的比對，使鹿源鑒定更為規范易行，標準化的分子條形碼數據庫甚至使專業領域以外的人運用自如。第五，可以有效地區別鹿源形態相近的近緣種。DNA條形碼的應用，將使人們用藥更加準確、安全，使人們基本告別偽劣產品，準確辨別各種鹿源藥物。

3 DNA條形碼技術在鹿源類中藥材鑒定的應用

目前，鹿類藥材的鑒定方法有傳統鑒定，如形狀鑒定、顯微鑒定、理化鑒定[21-23]，和分子鑒定方法，如基于特異引物PCR擴增和COI條形碼序列。研究鹿科動物的線粒體DNA(mtDNA)較多[24]。利用mtDNA的研究目前也有一些進展，分析梅花鹿和日本鹿的遺傳變異時利用了mtDNA控制區；分析鹿屬動物的多態性時利用到了mtDNA[25]；近幾年，唐雙焱等[26]利用細胞色素b基因和特異性PCR片段，從鹿血，鹿茸和偽鹿茸中提取mtDNA，鑒定鹿茸藥材的真偽。王學勇等[27]研究了9種近源物種鹿科動物鹿茸藥材的位點特異性PCR鑒別方法；白根本等[20]利用線粒體12S rRNA基因片段，從馬鹿、梅花鹿等國內11種鹿的鹿血和鹿茸中提取DNA，鑒定馬鹿茸和梅花鹿等珍貴中藥材。李仁茂等[28]利用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對梅花鹿筋、新西蘭鹿筋、牛筋等五種動物筋進行了電泳分析，得出鹿筋與其他四種動物筋具有顯著差異。郭月秋等[29]用免疫凝集試驗鑒別鹿鞭及其偽品。王建云等[30]用線粒體DNA細胞色素b的方法鑒定了鹿鞭。趙靜雪等[31]分析比較不同DNA提取方法對鹿骨類藥材的提取質量，從而選擇高質量的提取方法，獲得高質量的DNA，用于PCR擴增，進行對比鑒定。崔麗娜等[10]利用COI序列對鹿茸及其混偽品進行DNA條形碼鑒別。另外，張蓉等[32]也利用COI基因序列，設計一對鹿科動物DNA條形碼通用引物，對于不同來源的鹿茸樣本進行準確鑒定。以上對鹿類藥材的鑒定方法繁多，在一定程度上不夠完善，缺乏統一的鹿類藥材鑒定方法。

4 小結與展望

藥材市場上的鹿茸、鹿角、鹿血、鹿鞭等鹿源系列中藥代用品、習用品、混偽品較多，導致市場上商品藥材復雜混亂，用常規方法鑒定具有一定局限性。中藥鑒定以確保中藥品種正確、質量優良，安全、有效、穩定、可控。中藥材的準確鑒定至關重要，直接影響到中醫臨床用藥的安全和療效。隨著分子生物學的高速發展以及DNA序列自動分析儀的普及，使DNA分子鑒定的逐漸成本降低，有利于將此技術引入中藥材的檢驗中。把DNA條形碼鑒定方法用于鹿源的鑒定，可以快速鑒定鹿茸、鹿鞭、鹿尾、鹿筋等，有利于鹿源鑒定標準化的實現，能加速構建龐大的、統一的鹿源DNA數據庫，極大地提高分析效率，以實現更加便捷經濟的鹿源鑒別模式，制定出切實可行，有利于推廣應用，實用性強的有效的鑒定方法，澄清其混亂現象，確保用藥準確、有效，必將帶來更大的社會和經濟效益，推動生物分子鑒定的發展進程。

[1]CHEN D X，GUO Y Q，REN W.Character identification of kinds of pilose natler medicinal materials[J].J Chin Med Mater(中草藥)，1999，22（9）：441-443.

[2]錢忠直，林瑞超，肖培根.中藥鑒定與標準研究[J].中國中藥雜志，2014，39 (12):2153-2154.

[3]ZHANG B G，LIQ，LIU D.Identification and study of the pseudo articles of Cornu Cervi and Cornu Cervi pantotrichum[J].Chin PharmJ(中國藥學雜志)，1992，27（12）:713-715.

[4]WANG X Y，LIU C S，ZHANG R.Establishment of allele-specific diagnostic PCR method for identification of antlers[J].China J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34（23）：52-55.

[5]PAUL D N，HEBERT A，CYW IN SKA S L B.Biological identifications through DNAbarcodes[J].The Royal Society，2003，8(1):313-320.

[6]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典1977年版（一部）[S].北京：人民衛生出版社，1978:555-557.

[7]江蘇新醫學院.中藥大辭典[M].上海：上海人民出版社，1977:2230-2241.

[8]國家中醫藥管理局《中華本草》編委會.中華本草（第9冊）[M].上海：上海科技出版社，1999:646-667.

[9]單云芳，張林源，鐘震宇.中草藥在養鹿業的應用現狀與展望[J].黑龍江畜牧獸醫，2013(3):141-143.

[10]崔麗娜，杜鶴，劉新成，等.基于COI條形碼序列的鹿茸及其混偽品的DNA分子鑒定.吉林中醫藥，2012，32(4):384-387.

[11]張保國，李欽，劉東，等.鹿角、鹿茸混淆品-狍角、狗茸的鑒別研究[J].中國藥學雜志，1992，27(12):713-715.

[12]陳士林，龐曉慧，姚輝，等.中藥DNA條形碼鑒定體系及研究方向[J].世界科學技術(中醫藥現代化)，2011(5):747-754.

[13]Hebert PDN，Cywinska A，Ball SL，deWaard JR.Biological identifications through DNAbarcodes[J].Proc Biol Sci，2003，270，313.

[14]陳士林，姚輝，宋經元，等.基于DNA barcoding（條形碼）技術的中藥材鑒定.世界科學技術-中醫藥現代化，2007，9（3）:7-12.

[15]陳士林.中藥DNA條形碼分子鑒定[M].北京:人民衛生出版社，2012.

[16]Xiwen Li，Yang Yang，Robert J，et al.Plant DNA barcoding:from gene to genome.Biological Reviews，2015，90:57-166.

[17]Liu Z Q，Wang Y Q，Zhou K Y，et al.Study on highly specific diag nostic PCR of the traditional chinese medicine tortoise plastron and its original animals[J].Acta Pha rmSin(藥學學報)，1999，34(12):941-945.

[18]唐曉晶，馮成琦，黃璐琦，等.高特異性PCR方法鑒別烏梢蛇及其混淆品[J].中國藥學雜志，2007，42（5）：333.

[19]杜鶴，崔麗娜，張輝，等.鱉甲及其混偽品的DNA分子鑒定[J].世界科學技術—中醫藥現代化，2011，13（2）：429.

[20]白根本，張林源，劉春生，等.鹿源類中藥材DNA序列分析及馬鹿和梅花鹿的PCR鑒定[J].中草藥，2006(10):1566-1569.

[21]仲昭慶，盧守奇.鹿鞭的電泳鑒別[J].中藥材，1997，20(7):339-340.

[22]陳代賢，郭月秋，任瑋，等.11種鹿茸組織特征比較鑒別[J].中藥材，2000，23(12):743.

[23]Chen D，Guo Y，Ren W.Character identification of 12 kinds of pi－lose antler medicinal materials.J Chin Med Mater(in Chinese)，1999，22(9)∶441-444.

[24]Niedzia kowska M，Jedrzejewska B，Honnen AC，et al.Molecular biogeography of red deer Cervus elaphus from eastern Europe:insights from mitochondrial DNAsequences[J].ActaTheriol，2011，56:1-12.

[25]蘭宏，施立明.麂屬(Muntiacus)動物線粒體DNA多態性及其遺傳分化[J].中國科學:B輯，1993，23(5):489-497.

[26]唐雙焱，傅文，陳永久，等.中藥材鹿茸的分子分類學鑒定研究[J].中國藥學雜志，2002，37(4):258-260.

[27]王學勇，劉春生，張蓉，等.位點特異性PCR方法的建立及對近源種鹿茸藥材的鑒別研究[J].中國中藥雜志，2009，34(23):3013-3016.

[28]李仁茂，鐘炳輝，林海強，等.鹿筋的電泳鑒別研究[J].湛江師范學院學報(自然科學版)，1998，19(2):77-78.

[29]郭月秋，陳代賢，劉輝，等.鹿鞭及偽品的免疫凝集試驗鑒別[J].中國藥事，2000，14(2):103-105.

[30]王建云，何廣新，付文，等.鹿鞭的微量DNA提取及序列鑒定[J].中國中藥雜志，1997，22(10):579-583.

[31]趙靜雪，陳敏，崔光紅，等.鹿骨類藥材DNA提取方法研究[J].中國中藥雜志，2011，36(3):370-373.

[32]張蓉，劉春生，黃璐琦，等.鹿茸飲片的DNA條形碼鑒別研究[J].中國藥學雜志，2011，46(4):263-266.

Research Progress on Chinese Herbal Medicine Luyuan DNA Barcode Identification

ZHANG Xinning1,XU Liang1*,CAI Liping2,WANG Menghu1,XIA Jingwen1,WANG Youchen1
(1.Department of Medicinal Plants,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Dalian 116600,China 2.Department of Traditional Chinese Medicine,Liaoning Universityof Traditional Chinese Medicine,Liaoning Province,Shenyang 110847,China)

The source of Chinese medicinal herbs luyuan is complex and diverse,and identification methods have many,such as the basis of identification,characterization,microscopic identification and physical and chemical identification.However,in practical application,the identification of Chinese herbal medicines luyuan is very difficult,and the general appraisal method is difficult to satisfy the identification requirements,so a fast and effective identification method is needed to identify the authenticity and quality of strephococcus.This paper summarized the literature of nearly 20 years by combining the method of network literature retrieval and manual retrieval.

luyuan;DNA barcodes;identification of traditional Chinese medicine

10.3969/j.issn.1672-2779.2017.16.062

1672-2779（2017）-16-0144-03

：李海燕本文校對：王冰

2017-04-10）

國家商務部項目中央本級重大增減支項目【No. 2060302】；國家中醫藥管理局項目【No.201407002】；大學生創新創業訓練計劃項目；遼寧中醫藥大學杰出青年基金【No. 20121228】；遼寧省高等學校杰出青年學者成長計劃【No. LJQ2014101】

*通訊作者：861364054@qq.com