非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法研究進展

■文/山東省濱州畜牧獸醫研究院 莊金秋 梅建國 謝金文 李 峰 沈志強

非洲豬瘟病毒實驗室檢測方法研究進展

■文/山東省濱州畜牧獸醫研究院 莊金秋 梅建國 謝金文 李 峰 沈志強

非洲豬瘟是由非洲豬瘟病毒引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，其臨床癥狀與豬瘟極其相似。本病已在非洲、歐洲和美洲等幾十個國家暴發。雖然我國尚未發生，但防控其傳入的形勢也非常嚴峻。本文綜述了非洲豬瘟病毒最新實驗室檢測方法研究進展，以期為我國開展非洲豬瘟的監測及綜合防控提供技術參考。

非洲豬瘟；非洲豬瘟病毒；檢測；研究進展

非洲豬瘟(African Swine Fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)感染引起的家豬和野豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。臨床癥狀與豬瘟極其相似，以高熱、皮膚發紺、內臟器官嚴重出血、呼吸障礙和神經癥狀為主要特征。本病傳播快、致死率高，對養豬業危害巨大，是我國一類動物疫病和世界動物衛生組織(OIE)規定的必須報告的動物疫病，受到世界各國的高度重視。本病是唯一以節肢動物作為傳播媒介的DNA病毒。迄今為止，ASF已在非洲、歐洲和美洲等幾十個國家暴發。雖然我國尚未發生，但防控ASF傳入的形勢非常嚴峻。目前，本病尚無有效的預防疫苗和治療藥物，防止疫情擴大的唯一有效措施就是撲殺。因此事先建立簡便、快速、準確的ASFV檢測方法顯得十分必要。本文綜述了ASFV最新實驗室檢測方法研究進展，以期為我國開展ASF的監測提供技術參考。

1 血清學檢測方法

1.1 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

ELISA應用于血清抗體的檢測，具有操作方便、特異性較好、靈敏度高的特點，適用于大批量樣品的檢測，OIE將ELISA作為診斷ASF的首選血清學方法。ASFV含有約150種蛋白，目前國內外常用作檢測抗原的蛋 白 有 VP73、VP72、P54、P32、P30等。Wardly等[1](1979)首次建立了間接ELISA方法檢測ASFV抗體，具有較好的敏感性和特異性。Pastor等[2](1990)分別以ASFV主要結構蛋白VP73和病毒感染的細胞培養物中高特異胞質可溶性抗原(CS-P)建立了兩種間接ELISA方法，兩種方法特異性均較高，但是CS-P抗原比VP73抗原至少能提前2d檢測出ASFV抗體。Vidal等[3](1997)用VP73單抗建立的固相ELISA，能夠檢測到濃度為0.5μg/mL的VP73抗原和2.3×102pfu/mL的全病毒顆粒。Hutchings等[4](2006)比較了用全病毒多抗血清和針對VP73蛋白的單抗進行間接夾心ELISA檢測ASFV，顯示多抗血清的敏感性高于單抗。Perez等[5](2006)以昆蟲細胞表達的P30重組蛋白為包被抗原，建立了檢測ASFV抗體的間接ELISA方法，敏感性高，可用于ASFV特異性抗體的早期檢測。Gallardo等[6](2009)利用重組蛋白 pK205R、pB602L、p104R和 P54建立的ELISA檢測方法具有較高的敏感性和特異性。蔣正軍等[7](2000)以桿狀病毒表達的ASFV VP72蛋白為抗原，研究和組裝了間接ELISA抗體檢測試劑盒，具有反應體系小、快速、特異等優點，且比Dot-ELISA方法更加敏感。仇華磊[8](2006)采用大腸桿菌表達的GST-VP72融合蛋白為包被抗原，建立了間接ELISA。朱紅[9](2007)成功獲得5株分泌抗ASFV VP72蛋白單克隆抗體的細胞株，也建立了間接ELISA方法。李秋霞[10](2010)以大腸桿菌表達的ASFV pET32a-VP73L重組蛋白作為包被原，也建立了間接ELISA方法。曾少靈等[11](2013)利用桿狀病毒表達載體在昆蟲細胞中表達的ASFV的VP73重組蛋白作為檢測抗原，建立了間接ELISA方法。靳雯雯[12](2014)以VP73純化蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA方法，與商品化的阻斷ELISA相比，其具有較好的敏感性和特異性。董志珍等[13](2012)針對ASFV P54蛋白建立了單克隆抗體競爭法ELISA并構建了檢測試劑盒，靈敏度高于間接免疫熒光(IFA)方法。梁云浩等[14](2014)利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統表達出的ASFV P54重組蛋白作為檢測抗原建立了間接ELISA方法。鄔旭龍等[15](2016)以原核表達的ASFV pK205R蛋白作為包被抗原，建立了間接ELISA檢測方法。張倩等[16](2012)采用瑞典Svanova ASFV間接ELISA抗體檢測試劑盒對遼寧綏靖、內蒙古赤峰、大連東港共計92份豬血清進行了ASFV抗體的檢測，結果全部為陰性。鄧飛等[17](2016)采用西班牙Ingenasa ASFV阻斷ELISA抗體檢測試劑盒對來源于四川省內的92份豬血清進行檢測，結果表明，92份血清樣本均為ASFV抗體陰性。

1.2 膠體金免疫層析(GICA)試紙條

張鑫宇等[18](2014)用原核表達的ASFV P54重組蛋白制備了ASFV抗體快速檢測膠體金試紙條，通過對ASFV不同感染時期141份豬血清樣品進行比對檢測，顯示該試紙條在感染早期的符合率高于OIE推薦的ELISA檢測方法。劉波[19](2014)也運用原核表達系統和膠體金免疫層析技術，對ASFV快速檢測試紙條的技術進行了研究。吳海濤[20](2015)運用雙抗體夾心法原理純化后的抗ASFV單克隆抗體制備金標抗體，制備了用于檢測ASFV的膠體金免疫層析試紙條。

1.3 其他血清學方法

熒光抗體試驗(FAT)可用于檢測野外可疑豬或實驗室接種豬的脾、淋巴結等組織壓片和冰凍切片中的ASFV抗原。該方法具有快速、經濟、敏感性和特異性高等優點，但需要專業試驗人員，同時需要熒光顯微鏡及高質量的熒光標記抗體。因此僅作為ASFV的輔助檢測方法。間接免疫熒光試驗(IFA)可用于檢測感染ASFV的豬血清樣品。該方法的優點是當ELISA檢測結果不確定或制備抗原困難或復雜時，可選用此法。Malmquist等[21](1960)提出并建立了血細胞吸附試驗方法，血細胞吸附是指豬的紅細胞附著在感染ASFV的單核細胞或者巨噬細胞的表面。絕大多數從非洲分離的ASFV毒株以及最初從歐洲國家分離的ASFV毒株均產生豬紅細胞吸附現象。Pan等[22](1978)應用免疫過氧化物酶噬斑染色技術，對接種ASFV的Vero細胞進行檢測，3d后觀察到噬斑。可對ASFV進行抗原定量分析。此方法快速、特異，不用借助其他儀器，肉眼便可觀察結果。Pastor等[23](1992)用細胞質可溶性抗原CS-P，建立了斑點免疫(DIA)檢測方法，敏感性與OIE推薦的ELISA方法相當。Marco等[24](2007)建立了免疫組化法，用來檢測急性感染ASFV豬的扁桃體組織病理學變化，通過檢測發現，感染ASFV豬有出血、單核細胞增多現象。免疫組化法是通用的檢測方法之一，但對于臨床癥狀不明顯的病例，確診有一定難度，因此，該方法僅作為ASFV的輔助檢測方法。

2 分子生物學檢測方法

2.1 PCR

PCR具有簡單快速、靈敏度高和特異性強的優點，是目前ASFV最常用的實驗室檢測方法。Aguero等[25](2003)和曾少靈等[26](2009)先后根據ASFV VP72基因設計引物，建立了ASFV的PCR檢測方法，均具有良好的敏感性和特異性，可以檢測出極低含量的ASFV，為ASFV早期感染的快速診斷提供了有效的分子生物學檢測方法。Aguero等[27](2004)和張倩[28](2010)先后建立了一步法多重RT-PCR方法，能夠鑒別診斷豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)和ASFV，可以從臨床樣品(如抗凝全血、細胞培養物和組織)中檢測到病毒，這為早期快速、特異性診斷非洲豬瘟和豬瘟提供了可靠的方法。Basto等[29](2006)建立了檢測蜱ASFV的套式PCR方法，敏感性高于OIE推薦的PCR檢測方法。Giammarioli等[30](2008)建立了檢測CSFV、ASFV、豬圓環病毒2型(PCV2)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)和豬細小病毒(PPV)5種病毒的多重PCR檢測方法，可以用于這5種病毒感染的鑒別診斷。崔尚金等[31](2012)建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法，該方法采用納米金顆粒作為熱導介子，提高了PCR反應效率。敏感性試驗表明，納米PCR是常規PCR檢測技術敏感性的1,000倍以上，最低核酸拷貝數檢出量可以達到10個拷貝。采用該方法對黑龍江、吉林和河南3個省份臨床送檢的69份樣品進行檢測，結果均為陰性，表明該地區均無ASFV感染情況。

2.2 熒光定量PCR

實時熒光定量PCR比常規PCR具有更高的敏感性和特異性，可同時快速檢測大批量樣品。King等[32](2003)、李維彬等[33](2007)、張泉等[34](2007)、黃萍等[35](2010)、Tignon等[36](2011)、李洪利等[37](2012)先后根據ASFV VP72基因，曾少靈等[38](2010)根據VP73基因，董志珍等[39](2009)根據P54基因各自設計引物和探針，建立了TaqMan實時熒光定量PCR方法。McKillen等[40](2007)建立的實時熒光定量PCR分子信標(molecular beacon)技術具有快速、特異性強、靈敏性和準確性高的特點。該檢測方法可快速鑒別PRV、ASFV、PCV2和PPV。郭少平等[41](2010)根據ASFV K205R基因序列設計合成引物及TaqMan探針，建立了基于K205R基因的ASFV實時熒光定量PCR檢測方法。McKillen等[42](2010)根據9GL基因建立了MGB探針實時熒光定量PCR檢測方法，最低可以檢測到20拷貝標準DNA。該方法檢測臨床樣品中的ASFV，敏感性與OIE推薦TaqMan熒光定量PCR方法相當。Fernandez等[43](2013)利用通用探針庫建立了ASFV的實時熒光定量PCR方法。陳靜靜等[44](2012)建立了雙重熒光定量PCR，可同時檢測CSFV和ASFV，只需一步即可完成，可作為鑒別兩種病毒的診斷方法。王建華等[45](2016)根據ASFV CP530R基因和高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒(HP-PRRSV)NSP2基因為靶序列，分別設計特異性引物和TaqMan-MGB探針，建立了一種可同時鑒別檢測ASFV和HPPRRSV的二重熒光定量RT-PCR方法。

2.3 重組酶聚合酶擴增(RPA)技術

RPA是一種可以替代傳統PCR的新型核酸檢測技術，該方法操作簡單、反應快速、檢測成本低、結果確實可靠，王建昌等[46](2016)基于ASFV VP72基因保守序列設計并合成引物，建立了ASFV RPA等溫檢測方法，為ASFV的一線防控提供了一種新的、可靠的技術支持。

2.4 線性指數聚合酶鏈式反應(LATE-PCR)技術

LATE-PCR是不對稱PCR的一種形式，該方法用于檢測組織樣品的病毒，其敏感性可以達到大約1拷貝的病毒DNA。Ronish等[47](2011)基于ASFV VP72基因建立了LATE-PCR方法，為ASFV的實驗室診斷提供了敏感的檢測方法。

2.5 環介導恒溫擴增(LAMP)技術

LAMP技術操作簡單、靈敏、快速，檢測成本遠低于熒光定量PCR，且不需要特殊儀器設備，具有較高的臨床實用性。江彥增等[48](2009)、王彩霞等[49](2010)、楊吉飛等[50](2011)先后根據ASFV VP72基因序列設計引物，建立了快速檢測ASFV的LAMP方法，最低檢測限可達10拷貝質粒DNA，且具有良好的特異性。鄔旭龍[51](2014)根據ASFV K205R基因序列設計引物，建立了LAMP檢測方法。LAMP方法不需要PCR中的變性、退火步驟即可進行靶序列的循環擴增，不但大大縮短了時間，且使反應能夠在恒溫條件下進行，無需特殊儀器設備，肉眼判讀，可以滿足基層快速診斷的需要，非常適合于基層獸醫實驗室和養殖場使用。

2.6 探針雜交技術

張鑫宇等[52](2011)針對ASFV VP72基因分別設計合成1條與保守區域互補的5′生物素標記及3′烷巰基修飾短鏈寡核苷酸探針，并將烷巰基修飾的探針吸附到納米金顆粒上，制備納米金標記探針，將PCR擴增產物與生物素探針及納米金標記探針進行雜交，雜交產物加入吸附鏈霉親和素的酶標板，利用親和原理，捕獲雜交產物，銀染增強法對納米金標記探針進行信號放大，進而建立了檢測ASFV VP72基因的納米金探針雜交方法。探針雜交技術檢測靈敏度高，能有效排除PCR檢測過程中的非特異性結果，省去了瓊脂糖凝膠電泳步驟，操作簡便、檢測迅速，在酶標板中可批量反應，為ASFV核酸檢測方法開辟了新的途徑，但該方法的建立難度較高、操作較繁瑣，對試驗人員技術水平要求較高。

3 小結

近年來，隨著世界經濟和貿易全球化趨勢的發展，一些嚴重危害動物和人類健康的跨國疫病接連發生，使我國現代農業、養殖產業受到了沉重的打擊，嚴重影響了我國的經濟和進出口貿易的健康發展。ASFV雖然尚未在我國發現，但從西非至東非、歐洲、亞洲傳播的態勢已經形成，該病對我國潛在的威脅也越來越大，是我國貿易中監測的重要疫病，必須保持高度警惕，嚴防該病入境。由于本病尚無有效的疫苗用于防控，因此研究并建立敏感、特異、快速的ASFV實驗室檢測對ASF的防控至關重要。目前，ASFV的檢測技術主要有針對病毒DNA的核酸檢測技術和基于病毒抗原、抗體反應的免疫學技術兩大類。OIE推薦檢測ASFV的方法主要有PCR、實時熒光定量PCR、ELISA等。用免疫學方法檢測抗體可以了解ASFV感染、發生、發展的進程，但抗體只有在病毒感染至一定時期后才會出現，故ELISA等抗體檢測方法存在一定的局限性。PCR、實時熒光定量PCR、LAMP等分子生物學技術在豬感染ASFV的早期即可檢測到病毒核酸，在ASFV的早期檢測中具有重要作用。總之，ASFV的實驗室檢測方法多種多樣，各有優缺點，但對各種方法的檢測結果均要求準確、快速、敏感，這不僅對感染ASFV的動物治療非常重要，而且對未感染的動物及時采取有效的預防措施同樣具有重要的意義。隨著免疫學與分子生物學技術的不斷發展，ASFV的實驗室檢測方法必將不斷完善，進一步為我國開展ASF的監測與綜合防控提供技術支持。■

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山東省重點研發計劃項目(2015GSF121027)；山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-08-17)。