新型豬口蹄疫疫苗研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

新型豬口蹄疫疫苗研究進展

■文/山東綠都生物科技有限公司 李天芝 于新友

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的偶蹄的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病傳染性強、傳播速度快、危害嚴重，給畜牧業造成了嚴重的經濟損失，接種疫苗是防控口蹄疫的重要手段。本文介紹了口蹄疫亞單位疫苗、合成肽疫苗、核酸疫苗、表位疫苗、活載體疫苗、基因缺失/標記疫苗和病毒樣顆粒疫苗等幾種豬口蹄疫新型疫苗的研究進展情況，以期為口蹄疫的防控提供參考。

豬口蹄疫；新型疫苗；研究進展

口蹄 疫（Foot and Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的偶蹄動物的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，可感染豬、牛、羊等70多種動物[1]。FMD傳染性強、傳播快、流行范圍廣，且能以氣溶膠的形式遠距離傳播，一旦發生，往往造成大范圍流行，不易控制和消滅，給畜牧業造成巨大的經濟損失。OIE將其列在15個A類動物疫病之首，我國將其排在一類動物傳染病的第一位。一年四季均可發病，多發于冬、春寒冷季節[2]。

口蹄疫病毒（FMDV）具有7個血清型，分別為O型、A型、C型、亞洲1型、南非1型、南非2型、南非3型[3]，80多個亞型。病毒很容易發生變異，各型之間均無交叉免疫性，同型各亞型之間免疫力差，給FMD的防控與凈化帶來了困難。目前，滅活疫苗是防控FMD所用的疫苗。然而，由于滅活疫苗生產成本昂貴，需多次免疫，且存在滅活不徹底引發疫情的風險，需研發FMD新型疫苗。目前FMD新型疫苗研發工作取得了一定的進展，本文就研究情況進行綜述，旨在為FMD防控提供參考。

1 亞單位疫苗

利用DNA重組技術，將編碼病原微生物的抗原基因導入受體菌或細胞，使其在受體中高效表達出蛋白，提取純化后，加入佐劑制成的疫苗，稱為亞單位疫苗。焦穎等[4]利用畢赤酵母系統表達O型FMDV VP1基因，并用酵母表達的VP1蛋白免疫小鼠，然后通過ELISA檢測抗體水平。結果表明，酵母所表達的VP1蛋白能誘導小鼠產生特異性體液免疫應答。

2 合成肽疫苗

合成肽疫苗是通過人工合成病原微生物的保護性多肽，并將其連接到大分子載體上，加入佐劑而制成的疫苗。唐華等[5]應用兩種不同濃度的含 AF/72 株 FMDV VP1[131-159]、VP4[20-35]、3A[21-35] 和3B[29-42]4個抗原表位的合成肽聯合CpG寡聚脫氧核苷酸(5′-TCGCGAA CGTTCGCCCGATCGTCGGTA-3′)合成肽疫苗365和364在豚鼠上進行了免疫效力評價，并設置滅活疫苗免疫組和PBS對照組。結果顯示，2.5μg/只的合成肽364能保護4/5的豚鼠免受FMDV AF/72株的攻擊，滅活苗組獲得完全保護，其他組的保護效力僅為3/5，保護效力最高的兩組的外周血CD4+T淋巴細胞含量高達33.7%和36.6%，而其他組不超過27.7%，PBS組僅為18.1%。

3 核酸疫苗

將病原基因克隆入真核表達載體上，經篩選后，獲得正確的重組質粒，免疫動物后，外源病原基因可在動物機體表達，激活針對該病原的免疫應答反應，這類疫苗稱為核酸疫苗。王曉虎等[6]構建了單獨含FMDV VP1、VP4基因或同時含兩種基因的的重組核酸疫苗，將3種核酸疫苗免疫動物后，檢測免疫原性，結果顯示，這3種疫苗質粒均能刺激機體產生中和抗體，且具有一定的保護效力。VP1單表達組和聯合組保護率均為28.6%，共表達組和融合表達組保護率均為42.9%，滅活疫苗組保護率為100%，空載體組保護率為0。

4 表位疫苗

表位疫苗是指利用基因工程方法體外表達或人工合成病原微生物的抗原分子表位，將其作為抗原研制成的疫苗[7]。李艷麗等[8]采用FMDV衣殼蛋白VP1G-H環132～160位和C-端200～213位氨基酸序列置換豬PCV2衣殼蛋白的核定位信號序列，在大腸桿菌中表達嵌合FMDV表位的PCV2衣殼蛋白及完整的PCV2 ORF2蛋白。目的蛋白純化后，進行復性。復性蛋白與PCV2、FMDV多克隆抗體有良好的免疫反應性。將復性蛋白加聚肌胞苷酸(Poly I:C)與ISA206制備油佐劑疫苗免疫小鼠，結果顯示，復性與未復性蛋白均未能產生FMDV中和抗體，但產生了一定水平的FMDV特異性抗體。高明等[9]取O型FMDV 3個毒株VP1蛋白的優勢表位，設計并合成重復串聯表位基因3FoEN2，并克隆豬IgG重鏈恒定區基因。將2個基因依次克隆到pProEX-HTb載體，將獲得的重組質粒轉化感受態細胞。誘導后，經鑒定獲得目的蛋白表達。分別用5種佐劑ISA206、ISA201、IMS1313、603、ISA61乳化融合蛋白配制疫苗免疫BALB/c雌鼠，并檢測免疫效果。結果顯示，重組蛋白能與感染O型FMDV的豬的陽性血清發生特異性免疫反應，ISA201佐劑試驗組刺激機體產生的抗體水平最高。項林盛等[10]以1株O型FMDVVP1基因為模板，根據畢赤酵母密碼子偏嗜性，設計合成了含有T細胞表位(21-40 aa)和B細胞表位(129-169 aa)的多肽基因TB60，構建成分泌型重組酵母表達載體pGAPZαA-TB60，線性化后，用電穿孔法轉入畢赤酵母X33中，經博萊霉素篩選及PCR檢測后，獲得高拷貝轉化子；經誘導后，該多肽能以分泌物形式在上清中表達，免疫動物后，能誘導機體產生特異性的體液免疫應答，有良好的免疫原性。

5 活載體疫苗

將外源病原基因插入到已經弱毒的活病毒或通過特定的質粒導入無毒力的細菌體內，免疫動物后，外源病原基因可在動物體內表達，這類疫苗稱為活載體疫苗。李婧靜等[11]根據減毒鼠傷寒沙門菌的密碼子偏好性將FMDV VP1進行優化，并將其插入pYA3341載體中，獲得重組質粒pYA3341-VP1，將重組質粒pYA3341-VP1依次轉入減毒鼠傷寒沙門菌中間宿主X3730和表達宿主X4550中，誘導目的蛋白表達，并進行鑒定。結果表明，在重組減毒沙門菌中，表達的FMDV VP1目的蛋白大小為23ku，與預期相符。秦曉冰等[12]構建了含O型FMD結構蛋白基因的重組雞痘病毒或疫苗，免疫BALB/c小鼠后，檢測其免疫水平，結果發現，小鼠能產生較好的細胞免疫和體液免疫應答反應。王淼等[13]構建了能表達A型FMDV VP1基因的重組乳酸桿菌pSIP411-VP1-NC8和pSIP411-VP1-WCFS1，將獲得的重組乳酸桿菌分別免疫豚鼠以檢測免疫效果，并設置空質粒對照組pSIP411-NC8、pSIP411-WCFS1和陰性對照組，結果顯示，兩組重組乳酸桿菌免疫組抗體水平明顯高于其他3組，差異顯著，CD4+、CD8+淋巴細胞含量明顯增多，脾淋巴細胞在抗原刺激后增殖明顯，可在血清中檢測到中和抗體。

6 基因缺失/標記疫苗

采用基因工程技術將病原毒力基因缺失，從而使病毒毒力減弱，制成的疫苗免疫動物后，無毒性，只有免疫原性，稱為基因缺失疫苗，又稱“標記”疫苗[14]。楊波等[15]利用反向遺傳操技術構建了含組氨酸(His)標簽的重組FMDV，該重組病毒能穩定表達His標簽。其對BHK-21細胞和乳鼠的致病性與親本毒株(rAsia1)類似，為新型疫苗的研制奠定了基礎。袁紅等[16]為研制針對我國邊境地區(尤其是西南邊境)流行的A型FMD(FMD)的標記疫苗儲備病毒株，構建了含A型FMD疫毒P1基因的O型FMD的嵌合型質粒pO/3A91-105-AP1，NotⅠ酶切線性化后轉染BSR/T7細胞，拯救得到FMDV重組病毒。間接免疫熒光、RT-PCR和序列測定結果表明拯救的FMDV為正確的A型和O型間嵌合及3Aaa91-aa105缺失的重組病毒。病毒蝕斑和一步生長曲線表明拯救病毒的感染性和復制能力稍低于其親本病毒。

7 病毒樣顆粒疫苗

體外表達的一個或多個病毒蛋白，能自動組裝成與天然病毒粒子類似的空心蛋白顆粒，不含病毒核酸，不能自動組裝成的復制，安全性好，免疫原性好，由此，制成的疫苗稱為病毒樣顆粒疫苗。董艷美等[17]根據豬源FMDV VP1上第141～160位氨基酸序列設計引物，利用重疊延伸PCR技術將該序列插入到大腸桿菌噬菌體MS2外殼蛋白基因的特定位點。然后連接到原核表達載體pET28a上，構建了重組表達質粒28a-CP-VP1，轉化BL21，ITPG誘導表達得到融合表達的CP-VP1蛋白，透射電子顯微鏡下觀察融合蛋CP-VP1成類VLPs狀。間接ELISA實驗證實，該蛋白能夠特異地結合豚鼠抗O型FMDV的陽性血清，30μg的CP-VP1的VLPs蛋白免疫小鼠后，可以誘導其產生高效價的特異抗體。盛蓉等[18]以兔出血癥病毒(RHDV)衣殼蛋白VP60為載體，分別在RHDV衣殼蛋白的C端、N端、306和307位氨基酸之間插入FMDV B細胞表位(VP1 200-213aa)，得到嵌合VP60基因。利用桿狀病毒表達系統表達嵌合蛋白，分別命名 VP60-2F、VP60-306F 和 VP60-578F。通過電鏡觀察嵌合蛋白自聚為病毒樣顆粒的能力，動物免疫試驗結果顯示，將病毒樣顆粒免疫小鼠后均可產生針對VP60和B細胞表位特異的免疫應答。

8 結語

我國是世界上口蹄疫多發國家之一，且疫情復雜，這與我國的地理環境密切相關，鄰國如越南、緬甸、泰國等國都有口蹄疫的暴發及流行。世界各國都很重視口蹄疫的防控工作，在國際貿易中口蹄疫是各國重點檢疫的疾病。安全有效的疫苗是成功防控乃至最終消滅FMD的重要條件。隨著分子生物技術的不斷發展，未來FMD疫苗研發的主要方向是盡快研制價格便宜、安全性好、免疫效果好的新型基因工程疫苗。FMD基因工程疫苗研制工作也取得了令人鼓舞的成就，制備了多種FMD基因工程疫苗，但這些基因工程疫苗也存在一些缺陷，如亞單位苗與全病毒疫苗比免疫原性差，需經多次免疫才能獲得有效保護。合成肽疫苗容易被細胞內的蛋白酶所降解，并且抗原位點也不一定能被所有的宿主動物識別，免疫原性較弱，使用效果并不理想。核酸疫苗長期使用后可能產生DNA抗體，對動物機體產生不良影響。表位疫苗還需要就FMDV抗原位點演變與表型間的關系進行深入研究。接種活載體疫苗后可能會因對載體病原產生相應的免疫力，干擾目的病原基因的表達，還可能造成目的基因的丟失。病毒樣顆粒疫苗不易制備。可飼疫苗抗原蛋白的表達量較低。隨著技術的不斷發展，問題都會逐漸解決，畢竟新疫苗的研發是大勢所趨。目前，商品化的FMD合成肽疫苗投放市場，對其免疫效果有待于市場進一步檢驗，已經通過國家新獸藥臨床試驗審批的FMD基因工程疫苗還有復合表位蛋白疫苗、病毒樣顆粒疫苗及基因缺失標記疫苗，相信未來FMD基因工程疫苗一定會替代滅活疫苗成為我國FMD防控的主力疫苗。■

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山東省現代農業產業技術體系生豬產業創新團隊項目(SDAIT-08-17)。