鄰苯二胺/β-環糊精/銀-碳納米管修飾電極測定瑪卡中腺嘌呤的含量

申 遠，張書娟，李 洲，丁坤飛，何香香，申貴雋,*

（1. 大連大學 人才建設辦公室，遼寧 大連 116622；2. 大連大學 醫學院，遼寧 大連 116622；3. 大連大學 環境與化學工程學院，遼寧 大連 116622）

瑪卡(Maca)屬于十字花科植物瑪卡獨行菜(Lepi-diummeyeniiWalp)，是一年生草本植物，地上部分平鋪在地面，地下部分為蘿卜狀塊莖，長約10～14 cm，寬約3～5 cm[1]。瑪卡是一種非常獨特的高原農作物，含有豐富的營養成分，研究認為瑪卡有改善性功能、提高生育力、增強體力、抗疲勞、調節內分泌、延緩衰老、減輕壓力、緩解焦慮、抑制癌變、抗腫瘤等功效。在我國，瑪卡沒有被歸為藥類，也沒有相關依據批準其作為藥品使用，僅有衛生部2011年第13號公號批準瑪卡粉可作為新資源食品。目前在國內，瑪卡是以瑪卡粉和瑪卡提取物的形式較為廣泛地應用于食品、保健食品等領域，由于營養成分豐富而且無任何毒副作用，近年來以瑪卡為主要原料生產的各類保健品已得到越來越多消費者的青睞[2-8]。

瑪咖的生理活性與其化學組成有著密切的關系，其中蛋白質和生物堿被認為是瑪咖的主要功效成分。其中腺嘌呤等生物堿基是其抗疲勞、抗衰老活性的主要成分之一。腺嘌呤也是生命體中構成DNA和RNA的幾種基本堿基之一，在生命過程中發揮著重要作用，與各種生物體有緊密的關系[9]。其與磷酸的結合物有刺激白細胞增生的作用，目前常用于腺嘌呤測定的有色譜法、光度法、質譜法等方法[10-12]。然而這些方法有的設備價格高、操作過程復雜、耗時長，有的精確度低不能滿足檢測的要求。電化學方法用于物質的檢測具有操作簡便、靈敏度高、選擇性好、成本低廉等優點[13-14]。可以為瑪卡中腺嘌呤的含量測定提供一種新的途徑。

本研究旨在采用多種修飾材料對玻碳電極進行處理，以期獲得電信號響應強，穩定性好的修飾電極，并運用修飾后的電極對腺嘌呤的電化學行為進行研究。探討合適的實驗條件，以建立一種測定腺嘌呤含量的電化學方法，使其能用于瑪卡中腺嘌呤含量的測定，并為瑪卡的質量檢測和開發利用提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

CS300電化學工作站（武漢科思特儀器有限公司）；QT2060超聲波清洗儀（天津市瑞普電子有限公司）；Sartorius數字式酸度計（北京賽多利斯儀器公司）；離心沉淀機 80-1型（上海機械手術廠）；三電極系統：玻碳電極（GCE）（天津艾達恒晟科技發展有限公司），參比電極為Ag/AgCl電極（上海納锘實業有限公司），對電極為鉑電極（天津艾達恒晟科技發展有限公司）。

多壁碳納米管（MWNT）（中科院成都有機所）、β-環糊精（β-CD）、鄰苯二胺（o-PD）（天津市科密歐化學試劑開發中心）；腺嘌呤（國藥集團化學試劑有限公司）；西藏瑪卡（由大連大學弓曉杰教授提供并鑒定）；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）。所有試劑均為分析純；實驗用水為二次蒸餾水。

1.2 溶液的配制

1.2.1 緩沖溶液

取35.8 g Na2HPO4，15.6 g NaH2PO4分別溶于1 L水中，取Na2HPO4620 mL，NaH2PO4380 mL混合，用NaOH調節pH,Sartorius數字式酸度計測定，調至pH=7.0，即得0.1 mol/L，pH=7.0的PBS緩沖溶液，轉移到容量瓶中，冷藏備用。

1.2.2 對照品標準溶液

腺嘌呤標準溶液，稱取0.014 g腺嘌呤標準品于燒杯中，用pH=7.0的PBS溶解，轉移到容量瓶中定容至50 mL，貼上標簽備用。

1.2.3 樣品溶液

取瑪卡原生植物樣品，粉碎，過篩（40目），得到瑪卡粉末。取5 g瑪卡粉末，用150 mL丙酮在90℃條件下索氏提取，得到30 mL提取液。經旋轉蒸發儀濃縮到10 mL左右，過0.45 um微孔濾膜，用pH=7的PBS緩沖溶液配成50 mL，冷藏備用。

1.2.4 鄰苯二胺溶液

稱取0.060 g鄰苯二胺于溫水中溶解，待全部溶解后，轉移到50 mL容量瓶中定容，貼上標簽備用。

1.2.5 β-環糊精溶液

取一定量的β-環糊精固體，于室溫下達到飽和狀態，貼上標簽備用。

1.3 玻碳電極的活化處理

將GCE在金相砂紙（3000#）上打磨，然后在麂皮上依次用1.0、0.3、0.05 um的α-氧化鋁粉末拋光，最后依次用無水乙醇和水各超聲清洗3 min。將處理后的GCE置0.5 mol/L的H2SO4溶液中，以100 mV/s掃描速度，在-0.2～+0.6V電位區間用循環伏安法（CV）掃描至穩定[15]。將電極取出用水沖洗干凈后，保存在水中，備用[16-17]。

1.4 鄰苯二胺/β-環糊精/Ag-碳納米管修飾電極的制備

將處理后的 GCE置于 10 mL鐵氰化鉀（5 mmol/L）中，以100 mV/s的掃描速度，在-0.2～+0.6 V電位區間用循環伏安法（CV）掃描至穩定。將電極取出用水沖洗干凈后，在紅外燈下干燥。然后以該GCE為基體電極，依次在 10 mL鄰苯二胺（1.00 mol/L），10 mLβ-環糊精（5 mmol/L）中，溶液靜置條件下。在上述電化學條件下，通過CV掃描20圈至CV曲線穩定，然后取出電極，在紅外燈下干燥。

采用 V(HNO3):V(HCl)=1:3回流 12 h的方法將MWNTs羧基化，用NaOH（0.01 mol/L）洗至pH至接近中性時為止，離心后干燥。稱取5.0 mg預處理過的MWNTs于5.0 mLDMF（N，N-二甲基甲酰胺）中超聲分散30 min，最后得到穩定的黑色分散液[18]。稱取7 mgMWNT于10 mLAgNO3(0.1 mg/mL)中混合，將上述修飾后的GCE放入此混合溶液中，超聲5～10 min，在上述電化學環境下掃描10圈，然后取出電極，在紅外燈下烘干即得 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，放在PBS緩沖溶液中保存，備用[19]。

1.5 電化學測試方法

電化學測試都是在三電極體系下完成，工作電極是 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE電極，參比電極為Ag/AgCl電極，輔助電極是鉑電極。

循環伏安（CV）測量的相關參數設置：掃速100 mV/s,在-0.2～+0.6 V電位區間。

2 結果與討論

2.1 電聚合膜的循環伏安法表征

依次用裸玻碳電極、o-PD/β-CD/GCE、o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE 5 mmol/L 的K3[Fe(CN)6]溶液中用 CV 法掃描（電位范圍-0.2～+0.6V，掃描速度100 mV/s），結果如圖1所示。圖中 K3[Fe(CN)6]探針分子在裸玻碳電極上的氧化峰與還原峰對稱性較好（曲線 a），具有良好的可逆性。在o-PD/β-CD/GCE上的氧化峰正移，峰型變寬，峰電流顯著減小（曲線 b）。可能是由于修飾電極表面具有交聯作用的鄰苯二胺與 β-CD 牢固地鍵合[20]，β-CD具有特殊的空腔結構，在電極表面形成一定覆蓋率的膜層，具弱導電性[21]，從而阻礙了K3[Fe(CN)6]在電極表面的電子傳遞。而在 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE上，氧化還原峰電流遠大于上述兩種電極（曲線 c），這可能是因為銀離子的優良導電性，促進了電子在電極表面的傳遞速度；碳納米管具有大的比表面積以及較多的活性位點，能夠提高電極檢測的靈敏度[22]。由此表明電極修飾效果良好，當鄰苯二胺、β-環糊精、Ag-MWNTs共同修飾于玻碳電極表面時，既可達到防止干擾，延長使用壽命的效果，又能高效傳遞電子。

圖1 不同修飾電極的循環伏安表征

2.2 腺嘌呤在 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE 的電化學響應

將不同修飾電極以 100 mV/s的掃描速度，在-0.2～+0.6 V電位范圍之間，用循環伏安掃描 0.01 mg/mL的腺嘌呤標準液，結果如圖2所示。由圖可見，裸玻碳電極對腺嘌呤幾乎沒有響應（曲線 a）；腺嘌呤在o-PD/β-CD/GCE上的電信號響應比裸玻碳電極稍強，表明這些修飾材料對腺嘌呤起到了一定的催化富集的作用（曲線b），可能是由于交聯劑o-PD與β-CD相互鍵合，使該修飾電極對腺嘌呤的吸附作用相對增強；而在 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE上，峰電流顯著增大，與上述兩種修飾電極相比，該修飾電極對腺嘌呤的電化學響應最強（曲線 c），可能是因為銀離子有很好的導電性能，MWNTs具有多活性位點，大的比表面積，因此該電極的電催化活性更加明顯。說明在o-PD/β-CD/Ag-MWNTs修飾電極上由于各修飾層的共同作用，使得腺嘌呤的氧化作用速度加快。

圖2 腺嘌呤在不同修飾電極上的循環伏安表現

由圖 2可以看出，腺嘌呤在 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs修飾電極上發生的電氧化是不可逆的過程。在腺嘌呤的結構當中，其C-8和C-2位上碳原子與氮原子之間存在著碳碳雙鍵，π電子云將會向氮原子上轉移，從而碳原子上的電子云密度減小；同時在碳原子相鄰的位置上，還存在電負性比較強的氮原子；二者共同作用導致C-H鍵的極性增強，使C-H鍵容易斷開，氫原子脫去，因此可以推測這一步的反應是涉及兩個電子的氧化過程[23]，如圖3所示。

圖3 腺嘌呤氧化過程示意圖

2.3 實驗條件優化

2.3.1 碳納米管用量的選擇

分別以碳納米管用量為4、7、10、13和16 mg制備 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，在上述電化學條件下于腺嘌呤標準液中進行對比實驗。結果如圖 4所示，當碳納米管用量為7 mg時，電化學響應最強，峰電流最大，峰型最佳，故使用7 mg碳納米管修飾電極。

圖4 腺嘌呤在不同碳納米管用量的修飾電極上的循環伏安表現

2.3.2 硝酸銀修飾液濃度的選擇

分別以硝酸銀濃度為0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 mg/mL制備o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE，在上述電化學條件下于腺嘌呤標準液中進行對比實驗。結果如圖5所示，當硝酸銀濃度為0.1 mg/mL時，其峰電流最大且峰型最好，故選用0.1 mg/mL AgNO3修飾電極。

圖5 腺嘌呤在不同硝酸銀濃度的修飾電極上的循環伏安表現

2.3.3 掃描速率的影響

在10～150 mV/s的掃描速率范圍內改變掃描速度進行實驗，100 mV/s時峰電流最大，所以選擇100 mV/s的掃描速度。

2.3.4 底液的選擇

按如上所述的電化學方法，在TISAB（曲線a）、乙酸乙酸鈉和PBS（曲線c）這三種底液條件下分別對腺嘌呤進行對比實驗。結果如圖6所示，在乙酸乙酸鈉溶液中出現氧化還原峰，且峰電流極大（曲線b），可以認為乙酸乙酸鈉溶液對腺嘌呤的檢測有干擾；在TISAB中出現的峰較比PBS緩沖溶液中出現的峰電流大，因此認為PBS緩沖溶液更適合本實驗條件下對腺嘌呤進行測定。

圖6 腺嘌呤在不同底液中的循環伏安表現

2.3.5 底液pH值對極化電流的影響

在pH=2.0～11.0范圍內改變底液的pH值，用上述電化學方法測定 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE上1.0 mg/mL腺嘌呤的峰電流，腺嘌呤的峰電流在pH=2.0～5.0范圍內隨pH增大而增大；在pH=5.0～7.0范圍內隨pH增大，峰電流減小；在pH=7.0～11.0范圍內隨pH增大而增大。故選擇pH=7.0的PBS為最佳底液。

2.4 干擾實驗

考察了一些常見的有機化合物和金屬離子對腺嘌呤測定的干擾。實驗結果顯示：500倍的K+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Al3+、Fe3+、Fe2+、Hg2+；100 倍的維生素 E、尿酸；25倍的鳥嘌呤、胸腺嘧啶幾乎不會對腺嘌呤的測定產生干擾。這說明自制的修飾電極對腺嘌呤測定時的選擇性很好。

2.5 重現性和穩定性

用 o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE 對 0.01 mg/mL的腺嘌呤標準溶液連續測量8次，測定結果的相對標準偏差（RSD）為0.2%，說明該修飾電極重現性好。

o-PD/β-CD/Ag-MWNTs/GCE在室溫、空氣流通的條件下保存18d，對腺嘌呤標準溶液響應電流基本不變，說明該電極穩定性良好。

2.6 線性范圍與檢出限

在最佳測試條件下，用循環伏安法研究了腺嘌呤的氧化峰電流與其濃度的關系（圖 7），發現腺嘌呤的氧化峰電流與其濃度在0.2～1.0 mg/mL之間有良好的線性關系，線性方程為：y=-0.0558x+0.2935(I:mA，c:mg/mL，R2=0.9419)，最低檢出限為 0.06 mg/mL。

圖7 腺嘌呤氧化峰電流與濃度的關系曲線

2.7 回收率實驗

取瑪卡原生植物樣品，粉碎，過篩（40目），得到瑪卡粉末。取5 g瑪卡粉末，用150 mL丙酮在90℃條件下索氏提取，得到30 mL提取液。經旋轉蒸發儀濃縮到10 mL左右，過0.45 um微孔濾膜，用pH=7的PBS緩沖溶液定容成50 mL，搖勻，即制成待測樣品溶液。取適量待測樣品，在最佳實驗條件下用循環伏安法掃描，得到峰高和電流值，通過線性方程y=-0.0558x+0.2935，計算得到1 g瑪卡中腺嘌呤含量為0.037 mg。待測樣品取3份20 V/mL瑪卡樣品溶液，用上述修飾好的電極進行檢測，并在樣品中加入0.01 mg/mL的腺嘌呤標準溶液進行回收率實驗，結果見表1。實驗結果表明，該修飾電極對腺嘌呤的測定，具有較好的準確度和精密度。

表1 瑪卡中腺嘌呤含量回收率測定結果

3 結論

由于鄰苯二胺的交聯作用使具有特殊空腔結構的β-環糊精牢固的附著在表面，并且會使銀離子填充其中與之形成包絡物。在電化學條件下形成惰化層，增強了電極抗干擾能力、耐用性；而且碳納米管具有較大的比表面積以及較多的活性位點，能夠提高腺嘌呤檢測的靈敏度[23]，使得腺嘌呤在o-PD/β-CD+Ag-MWNTs/GCE電極上顯示良好的氧化還原活性。條件優化結果表明，在 pH=7的 PBS緩沖液中，用碳納米管用量為7 mg、銀離子濃度為0.1 mg/mL修飾過的玻碳電極，在-0.2～+0.6 V電位范圍之間，100 mV/s的掃描速度的條件下，可以測定瑪卡中腺嘌呤的含量。該方法具有操作簡便、靈敏高的優點，且該修飾電極重現性和穩定性較好，具有一定的應用價值。

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