Cyt c與NO配位反應及環境因素對其反應的影響

唐 乾，李如玉，史珊珊，曹洪玉，王立皓，鄭學仿

（1. 大連大學 生命科學與技術學院, 遼寧 大連 116622；2. 大連大學 遼寧省生物有機化學重點實驗室，遼寧 大連116622；3. 大連大學 環境與化學工程學院，遼寧 大連 116622）

0 引言

血紅素類蛋白是生物體內一系列含有原卟啉Ⅸ輔基的金屬蛋白質，在生物體中發揮著極其重要的生物功能[1]。由于血紅素蛋白含有血紅素輔基結構這一特殊性，因此他們能與不同的生物活性小分子進行配位。通過活性小分子配體與血紅素蛋白相互作用的研究，人們能更好地解釋血紅素蛋白的生物功能。近年來血紅素蛋白與各種活性小分子配體的結合過程、結合動力學等問題一直是眾多學科專家研究的熱點，而這其中的氣體配體與血紅素蛋白的相互作用研究是其中一項更富挑戰性的研究課題[2,3]。已有研究表明：肌紅蛋白能與一氧化碳(CO)、一氧化氮(NO)等小分子配體可逆地結合與釋放，從而調控其它蛋白的生理、生化功能[4]，李濤等[5]利用納秒瞬態拉曼光譜技術研究了氣體分子配體 NO與肌紅蛋白結合的動力學過程。渠敏等[6]利用光聲量熱法通過測量碳氧血紅蛋白光解反應的焓變和結構體積變化，研究了血紅蛋白與其配合物的結合與解離過程中各反應分子的結構變化和能量變化的動力學過程以及作用機理。Karin Nienhaus等[7]采用傅里葉變換紅外-溫度導數光譜(FTIR-TDS)技術，在較低的溫度下，研究了NO和血紅素蛋白的結合，Ionascu等[8]人也提出NO和血紅素蛋白的再結合動力學過程受溫度的影響，外界環境的改變會影響血紅素蛋白與NO的結合。

細胞色素C(Cytochrome c；Cytc)是一種含血紅素的蛋白，它在呼吸鏈中將電子由復合物III傳遞給復合物 IV[9]，它由一個含鐵的血紅素和其周圍 104個氨基酸殘基肽鏈構成的金屬蛋白，血紅素Fe與卟啉環的四個吡咯結構上的4個N形成配位鍵，而血紅素Fe的第5和第6個位配位鍵的形成則分別與多肽鏈上的Met80和His18形成，同時借助在血紅素原卟啉環上的乙烯基側鏈上的S-H進行還原加成反應，生成的巰基鍵與肽鏈的Cys14和Cys17分別形成共價鍵[10]。在發生氧化還原反應的過程蛋白的構象也發生相應的變化[11]。Cytc在水溶液中以單體、多聚體兩種形式存在，在極性溶劑中以多聚體形式為主，因此當溶液極性發生改變時，Cytc的血紅素構象也會發生相應的變化[12]，因此Cytc所在溶劑的微環境發生改變將會對Cytc的結構產生一定的影響。

NO分子一直受到各學科領域的高度關注[13-16]，是生物體內很多重要反應的關鍵性細胞信號分子，可以控制和調節各種不同生理過程，例如血壓的控制，引起肌肉松弛，導致血小板聚集，影響神經遞質傳遞和免疫反應等。關于Cytc與NO的相互作用研究[17-18]主要利用紫外區 Q帶進行分析而得出的，而關于紫外區的soret帶的分析卻沒有提及，根據Gouterman提出的四軌道模型理論可知，Cytc分子的soret帶由血紅素卟啉中的外層電子躍遷產生的，把它歸屬為π-π*躍遷的第二電子激發單重態，血紅素卟啉的變化情況可由它的變化來分析，這一區域的光譜變化與Q帶相比是非常靈敏的，因此利用Soret帶的變化來分析血紅素卟啉的變化情況更全面和具有重要意義。而且，之前的研究也沒有全面地分析外界因素對Cytc與NO配位反應的影響。本文通過光譜法研究Cytc與NO結合及解離反應，以及外界環境的影響，進而找到了其反應的最佳條件。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

馬心肌來源的細胞色素C(Cytc)樣品，購于美國Sigma公司，純度>99%，測定用 PB緩沖溶液(0.01 mol/L、0.05 mol/L、0.1 mol/L、0.15 mol/L、0.2 mol/L，pH=5.4、6.4、7.4、8.4、9.4、10.4)配制成濃度為 1×10-5mol/L的溶液，避光于4℃保存，并盡快用于實驗測定；proliNONOate ，或者寫成proliNO/NO，20℃時，其半衰期為6 s，從Cayman公司購置。Tris-HCl緩沖溶液(pH=7.4)；HAc-NaAc緩沖液溶(pH=7.4)；Ficoll70及Dextran70(100 g/L，購于上海生物工程公司)；試劑均為國產分析純；實驗用水為超純水。

V-560型 UV光譜儀(日本，Jasco)，FP-6500型熒光/磷光光譜儀(日本，Jasco)，電子順磁共振波譜儀(德國，Bruker)；F-12型制冷和加熱循環器(德國，Julabo公司)，pH 酸度計(上海雷磁分析儀器廠，PHSJ-4A)。

1.2 實驗方法

Cytc樣品的制備：三價高鐵形式的細胞色素C制備：添加過氧化氫；二價還原形式細胞色素 C制備：添加連二亞硫酸鈉，現用現配。實驗中所用的Cytc濃度均為1 uM，H2O2以及Na2S2O4試劑濃度分別配制為10 mM、0.5M。

將高濃度的Cytc溶解在不同離子強度、pH、溫度的磷酸鹽緩沖液，及不同緩沖溶液和擁擠試劑中，蛋白的終濃度為1×10-5mol/L；分別將樣品通入一定量的NO，通氣速率為100個氣泡/分，時間為2 min；取通NO后的Cytc樣品用氙燈進行光照。

紫外光譜的測定：將已處理的Cytc樣品至于1 cm方形比色杯中測定，測定條件為：狹縫寬度：2 nm，掃描范圍：220～700 nm，掃描速率：400 nm/min，響應時間：中等。

時間過程光譜測定：將細胞色素 C（未處理的，Cytc(WT)）、高鐵形式細胞色素C（Cyt c-Fe(III)）和還原態細胞色素C（Cyt c-Fe(II)）三種樣品分別置于10 mm光徑的方形石英比色皿中測定，測定條件：波長設置為416 nm、562 nm，靈敏度調置為高，響應時間間隔：2 s，其他條件同紫外-可見吸收光譜測定。

電子順磁共振譜測定：液氮條件下，進行樣品檢測，儀器測定條件為：功率9.33 GHz，6-G，10.2 mW，掃描速度：83.97 s，掃描范圍：2900～3900 G，時間常量：40.96 ms，溫度：100 K，最終結果為掃描次數20次的平均結果。

2 結果與討論

2.1 不同價態的Cyt c與NO之間配位反應過程的紫外吸收光譜

Cytc與NO相互作用的紫外吸收光譜如圖1所示，圖1A為Fe(III)-Cytc與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜，由圖1A可知Fe(III)-CytcSoret帶的409 nm處吸收峰紅移且吸收強度增大，Q帶530 nm處的吸收峰強度增大，同時在562 nm處出現新的吸收峰，Fe(III)-Cytc與NO配位結合生成Cytc-NO配合物。圖1B為亞鐵細胞色素C(Fe(II)-Cytc)與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜，由圖1B可知隨著NO通入量的增加，其soret帶的吸收峰由415 nm藍移到409 nm，Q帶520 nm與550 nm處吸收峰消失，在530 nm處出現新的單一小峰，隨著NO的繼續增加Soret帶的吸收峰由409 nm紅移到416 nm，同時Q帶在562 nm處出現新的吸收峰，逐漸生成細胞色素C-NO配合物(Cytc-NO)。因此，不同價態的Cytc與NO反應的過程為：Fe(II)-Cytc先被氧化為高鐵細胞色素C(Fe(III)-Cytc)，后者與NO配位形成Cytc-NO配合物[19]。根據Gouterman 四軌道模型理論，Cytc分子的 Soret帶是由其卟啉中的外層電子躍遷所產生的，其歸屬為π-π*躍遷的第二電子激發單重態。當NO與Fe(III)-Cytc分子進行配位反應時，由于NO分子具有較強的親核性，其電荷通過 Fe3+轉移到卟啉環上，從而使得卟啉環上電子云密度增大，導致π軌道能量增加，與π*間的能級差減小，即π→π*能級差降低，從而造成 Soret帶的紅移[20]。根據之前的研究結果，推斷出其配位反應機制為：NO氣體在溶液中以NO·形式存在，促使Cytc分子微環境發生改變，同時，NO進入到Heme腔中使其極性改變，使Met80與Heme之間作用力減弱，導致Met與Heme之間的配位鍵斷裂，經過分子間重排，血紅素中心Fe與NO之間形成新的Fe-N配位鍵，但新形成的配位鍵不穩定，會發生斷裂，解離再次生成五配位的 Fe，與溶液中的H2O分子結合，最終達到一個平衡。

圖1 Cyt c與NO相互作用的紫外吸收光譜

2.2 Cyt c與proliNONOate 相互作用的電子順磁共振光譜

電子順磁共振（electron paramagnetic resonance，EPR）是由不配對電子的磁矩發源的一種磁共振技術，可用于從定性和定量方面檢測物質原子或分子中所含的不配對電子，并探索其周圍環境的結構特性。研究生物組織中的順磁金屬離子，包括過渡族金屬離子，對一些動物組織、植物材料和微生物都能見到銅（Ⅱ）、錳（Ⅱ）或鐵的EPR信號。

圖2 細胞色素c與NO相互作用的電子順磁光譜

圖2A中顯示單獨存在的Cytc沒有順磁信號，但是在樣品中添加了少量的proliNO/NO后，出現弱的順磁信號，隨著proliNO/NO添加量的增加，信號更加明顯，見圖 2B。但是生成的六配位的亞硝酰血紅素鐵不穩定，因此，隨著時間的推移發生了解離，見圖 2C，與 2.1的實驗結果一致。圖 2D顯示，proliNO/NO直接加到緩沖液中也沒有順磁信號。

本文在此基礎上研究不同環境因素對 Cytc與NO結合及解離的影響。由于Fe(II)-Cytc要先被氧化為Fe(III)-Cytc再與NO反應，因此實驗過程中均以Fe(III)-Cytc進行后續實驗。

2.3 不同外界條件對Cyt c與NO結合反應的影響

Cytc在生物體內與NO的結合受到環境中多種因素的影響，因此我們分別考察了氧氣、離子強度、酸堿度、溫度、不同緩沖體系、擁擠環境等因素對二者結合反應的影響。

2.3.1 O2對Cyt c與NO結合反應的影響

O2是需氧生物生存的必需條件，在呼吸鏈中必不可少，Cytc是呼吸鏈的主要成分之一，因此在研究Cytc與NO相互作用的過程中，O2是一個重要因素，可能會對其反應產生影響。圖3A為通NO前，Cytc通入N230 min排除O2后與未排O2的UV-Vis吸收光譜，由圖3A可知Cytc去O2前后光譜沒有發生任何變化，說明O2對Cytc溶液本身沒有影響。圖3B為Cytc排O2前后與NO反應的UV-Vis吸收光譜，由圖3B可知通入相同量的NO，排O2后Cytc與NO相互作用的UV-Vis吸收光譜的Soret帶的特征峰在416 nm而含O2的Cytc在413 nm，Q帶特征峰都在530 nm和562 nm，但前者吸收強度大于后者，說明生成的Cytc-NO更多，即O2對Cytc與NO之間的配位反應產生一定的阻力，但并不參與其反應。這與本實驗室之前所做的metMb與NO反應時，少量的O2能夠促進其反應的結果相反，其原因主要是兩種蛋白的結構不同，metMb中血紅素鐵是五配位，而Cytc是六配位，同時在肌紅蛋白的血紅素中存在一個口袋結構而在細胞色素c中沒有，因此在Cytc與NO反應的過程中O2無法進入到其內部，而是消耗一部分 NO，使其生成產物減少，反應速率減慢。實驗中向Cytc中通入過量的O2，發現對其紫外吸收沒有影響(結果與圖3A相同，此處未列出)。

2.3.2 離子強度對Cyt c與NO結合的影響

在不同離子強度的緩沖溶液中，Cytc與NO反應時Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)處峰面積變化如圖4所示。由圖4可知，隨離子強度的增大反應速率逐漸降低，Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)處的峰面積都逐漸減少，離子強度由 0.01 mol/L到 0.05 mol/L變化最明顯，隨離子強度的繼續增加，變化逐漸減小，但仍有微弱的變化。在離子強度低的溶液中，Cytc易發生去折疊，形成伸展結構[21]，所以NO進入到其Heme中受到的阻力小，但隨離子強度的增大，Cyt c易發生折疊反應，血紅素周圍的結構更緊湊，NO進入CytcHeme中的阻力增大，以至Cytc與NO反應受阻，因此隨著離子強度的增大，反應生成的Cytc-NO配合物逐漸減少。隨緩沖溶液濃度的增強，其緩沖能力增大，但當溶液溶度過低時，緩沖溶液受外界離子的干擾過大，因此綜合以上原因，實驗過程選取0.05 mol/L的緩沖溶液。

圖3 O2對cyt c與NO相互作用的影響的紫外-可見吸收光譜

2.3.3 pH對Cyt c與NO結合的影響

圖5為不同pH溶液中Cytc通NO前后Soret 帶(416 nm)與Q帶(562 nm)峰面積變化。由圖5可知，在低于生理pH時，隨pH的增大，Soret帶(416 nm)與Q帶(562 nm)峰面積通氣前后變化逐漸減小，而當pH＞8后，其變化基本不變。Cytc在低pH溶液中，其二級結構會發生變化，α-螺旋和β-轉角會向β-折疊轉變[22]，溶液的pH越低對Cytc結構的影響越大，促使氧化態Cytc的生成，而氧化態的Cytc易與NO結合，因此其在Soret 帶(416 nm)與Q帶(562 nm)的吸收峰面積的變化越大，Cytc與NO結合的越多，隨pH增大變化峰面積逐漸減小，結合速率減慢；但當pH由酸性變為堿性時，Cytc自身會向還原態轉變，而還原態的Cytc不易與NO結合，因此Cytc與NO結合的反應速率下降。因為生理pH為7.4，所以實驗過程中選取pH為7.4進行，所得的實驗結果更具有參考價值。

圖4 不同離子強度中Cyt c與NO反應吸收峰面積變化

圖5 不同 pH溶液中Cyt c通NO前后峰面積變化

2.3.4 溫度對Cyt c與NO結合的影響

在不同的溫度下，Cytc與NO的反應如圖6所示。由圖6可知隨溫度的升高，Soret帶(416 nm)與Q帶(530 nm和560 nm)的峰面積都是先上升后下降的趨勢，Soret帶在293 K時面積達到最大，Q帶在283 K時峰面積最大，說明在283～293 K溫度范圍內為溶液反應的適合溫度，反應完全。溫度的改變引起Cytc蛋白構象的變化，而Cytc蛋白構象的變化會直接影響其血紅素卟啉環與NO的結合速率，當溫度較低時，Cytc自身結構穩定，處于低能狀態，NO進入溶液后受到的阻力較大，不易與之結合，使得反應生成的配合物較少，但隨著溫度的升高，Cytc自身的能量升高，分子變得活潑，易與NO反應，生成的配合物增多，使其相應位置的吸收峰面積也增大，而當溫度繼續升高時，可能會破壞一部分Cytc的結構，使其構象發生改變，無法與NO反應，同時溫度過高時NO在溶液中的溶解度降低，使得溶液中的NO量減少，因此Cytc與NO結合生成的配合物會迅速減少，吸收峰的面積也大量降低。因此Cytc與NO反應的溫度應該控制在283～293 K之間，過高過低都會使得反應現象不明顯。

圖6 Cyt c與NO反應的峰面積隨溫度變化圖

2.3.5 不同緩沖溶液對Cyt c與NO反應的影響

Cytc通NO前在不同緩沖溶液中的紫外吸收光譜如圖7A所示，由于Cytc在酸性環境中以氧化態存在，在堿性環境中以還原態存在，因此實驗中分別選取pH=7.4的酸性緩沖溶液（HAc-NaAc)、堿性緩沖溶液(Tris-Hcl)以及中性緩沖溶液(PB)，由圖7A可知在不同的緩沖溶液中，Cytc在soret帶409 nm處的特征吸收峰的位置沒有變化，只是其吸收峰的強度發生了微弱的變化；而 Q帶變化明顯，在 Tris-Hcl中Cytc部分被還原，HAc-NaAc中沒有變化。不同緩沖溶液中Cytc中通入NO后，其soret帶與Q帶的峰面積變化如圖7B所示，由圖7B可知HAc-NaAc緩沖溶液的變化是最明顯的，而Tris-Hcl 較PB緩沖溶液其面積變化減少，因為在HAc-NaAc溶液中有利于Fe(III)-Cytc的存在，而Fe(III)-Cytc易與NO結合，因此利于反應的進行，而堿性環境中Cytc主要以還原態存在，由于Fe(II)-Cytc在與NO結合的過程中要先生成Fe(III)-Cytc，因此在堿性緩沖溶液中，Cytc-NO配合物生成速率下降。為使實驗條件更接近生理環境，因此實驗中選取pH=7.4磷酸緩沖溶液更合適，得到的實驗結果也更接近于生理條件。

圖7 不同緩沖液中Cyt c的紫外吸收光譜及其與NO相互作用后的峰面積的變化

2.3.6 擁擠試劑對Cyt c與NO結合的影響

通常所進行的蛋白質相關實驗均以稀溶液作為緩沖體系完成的，但真實的細胞環境是非常復雜的，存在各種大分子，處在一個擁擠的環境中，Sasahara等[23]發現擁擠試劑可以促進折疊的蛋白質折疊為更為緊致的結構，此外McPhie等[24]也發現增加大分子擁擠試劑的濃度能促進折疊的脫輔基血紅素蛋白向熔球態轉變。本實驗研究了不同擁擠環境中Cytc與NO相互作用，其soret帶與Q帶峰面積如圖8所示，圖8可知Dextran70與PB緩沖溶液中soret帶與Q帶的面積基本相同，而Ficoll 70其面積明顯減少。Dextran 70是一種長度約為0.4 nm，無交聯線性的，相對靈活的大分子聚合物，其在溶液中易形成準隨機螺旋，排阻體積效應小[25]，可以容納更多的間隙空間，對Cytc的束縛能力較弱，而Ficoll 70是高度交聯構成的剛性共聚體[26]，造成溶液中可移動的空間減少，對Cytc的束縛能力較強，同時擁擠試劑形成的擁擠環境降低了NO的擴散系數，因此減弱了NO與Cytc的相互作用，且Ficoll 70對其影響較明顯，說明其能夠穩定了蛋白中血紅素的結構，延遲了與溶液中NO分子的反應。

圖8 不同的擁擠試劑中Cyt c與NO結合的峰面積變化

2.4 光照對亞硝酰細胞色素C解離的影響

光是生物有機體生活環境中必然存在的，而Cytc中含有一個血紅素輔基結構，其能吸收特定波長的光，劉艷偉[27]等研究發現其在280 nm處的吸收最大，因此本文選取280 nm的波長進行光照，發現光照對Cytc-NO的解離具有促進作用。圖9為Cytc-NO光照前后解離的面積變化圖，其中曲線2為光照后的解離曲線。由圖9可知光照與未光照Cytc-NO的解離都遵循方程(1)如下：

其中Y是面積，A是振幅，k是解離速率常數，y0是截距(表1)，由表1可知，光照前后其反應速率k1/k2=0.5，光照后 Cytc-NO的解離速率是原來的 2倍，光照后血紅素基團吸收能量，因此使得整個Cytc-NO分子的能量增高，血紅素周圍的電子分布發生改變，導致整個分子的穩定性降低，生成的Fe-N變弱，更易發生斷裂，因此光照會促進Cytc-NO的解離。

表1 Cyt c-NO光照和未光照下解離速率常數和相關參數值

圖9 光照前后Cyt c與NO反應配合物解離面積變化

3 結 論

本文采用光譜法證實了Cytc與NO能發生配位反應，并且研究了不同的外界條件，如離子強度、pH、溫度、緩沖溶液、及擁擠試劑對Cytc與NO配位反應和光照對Cytc-NO解離反應的影響。實驗結果發現，隨離子強度的增大反應速率逐漸降低，酸性pH下有利于Cytc與NO配位，而堿性pH則會抑制其反應的進行，溫度過高過低都不利于Cytc與NO配位反應的進行，控制溫度在283～293 K之間，有利于反應的進行，酸性緩沖溶液較堿性緩沖溶液更有利于配位反應的進行，而擁擠試劑Ficoll 70對于穩定蛋白的結構效果更好，使Cytc不易與NO反應，光照會促進Cytc-NO的解離，因此控制溫度在283～293 K之間，pH=7.4的0.05 mol/L的PB緩沖溶液的近生理條件是Cytc與NO配位結合反應的最佳條件。本研究對于進一步研究Cytc與NO配位反應動力學以及結合中間態的研究提供了最佳的反應條件。

[1]BURMESTER T, WEICH B, REINHARDT S, et al. A vertebrate globin expressed in the brain[J]. Nature, 2000,407(6803): 520-523.

[2]唐乾, 張越, 曹洪玉, 等. 光譜法研究高鐵肌紅蛋白活性中心與一氧化氮的配位反應[J]. 光譜學與光譜分析, 2015,5(7): 1967-1972.

[3]Ma J Y, ZHENG X fF, TANG Q, et al. Investigation on the photo-induced de-oxygenation process of myoglobin in aqueous solution by use of fluorescence spectroscopy[J].Science in China B, 2008, 51(5): 141-419.

[4]趙慧卿, 汪顯陽. 一氧化氮、一氧化碳與血紅素的配位化學及其生理作用[J]. 化學教育, 2004(03): 4-6.

[5]李濤, 呂榮, 于安池. 時間分辨拉曼光譜研究一氧化氮與肌紅蛋白的結合過程[J]. 物理化學學報, 2010, 26(01): 18-22.

[6]渠敏, 李家璜, 張淑儀, 等. 時間分辨光聲量熱法研究碳氧血紅蛋白的光解反應[J]. 聲學學報: 中文版, 2008, 33(05): 425-429.

[7]NIENHAUS K, PALLADINO P, NIENHAUS G U. Structural Dynamics of Myoglobin: FTIR-TDS Study of NO Migration and Binding [J]. Biochemistry, 2007, 47(3): 935- 948.

[8]IONASCU D, GRUIA F, YE X, et al. Temperature-Dependent Studies of NO Recombination to Heme and Heme Proteins[J].Journal of the American Chemical Society, 2005, 127(48):16921-16934.

[9]LARSON S K, DWYER D S, LO H H, et al. Mitochondrial cytochrome c reacts with nitric oxide via S-nitrosation[J].Biochemical and Biophysical Research Communications,2006, 342(3): 991-995.

[10]CASSINA A M, HODARA R, SOUZA J M, et al.Cytochrome c nitration by peroxynitrite[J]. The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(28): 21409-21415.

[11]SIMONE M J, KREISHMAN G P. Determination of the formal reduction potential, the electron stoichiometry, and the magnitude of the conformational change upon reduction for cytochrome c from potential-dependent fluorescence spectra[J]. Analytical Biochemistry, 1983, 132(1): 142-146.

[12]楊昌英, 李敏, 付靜,等. 脂質體對細胞色素 C 結構的穩定作用[J]. 分析科學學報, 2010, 26(02): 153-156.

[13]Bruhwyler J, Chleide E, Liegeois J F, et al. Nitric oxide: a new messenger in the brain[J]. Neurosci Biobehav Rev, 1993,17(4): 373-384.

[14]AJJURI R R, O'Donnell J M. Novel whole-tissue quantitative assay of nitric oxide levels in Drosophila neuroinflammatory response [J]. J. Vis. Exp., 2013, (82):50892.

[15]RATHNASIRI BANDARA S M. Migraine and psychiatric disorders comorbidity explained by sinus hypoxic nitric oxide theory ---a new hypothesis on the Sino rhinogenic theory [J].Medical Hypotheses, 2014, 82(3): 257-265.

[16]INAMDAR A A, BENNETT J W. A common fungal volatile organic compound induces a nitric oxide mediated inflammatory response in Drosophila melanogaster[J]. Scientific Reports, 2014(4): 3833.

[17]ORII Y, SHIMADA H. Reaction of Cytochrome c with Nitrite and Nitric Oxide: A Model of Dissimilatory Nitrite Reductase. Journal of Biochemistry, 1978, 84(6): 1543-1552.

[18]SHARPE M A, COOPER C E. Reactions of nitric oxide with mitochondrial cytochrome c: a novel mechanism for the formation of nitroxyl anion and peroxynitrite. Biochem. J.,1998, 332(1): 9-19.

[19]唐乾, 史珊珊, 曹洪玉, 等. 細胞色素c與NO反應機制[J].無機化學學報, 2015, 31(8): 1511-1519.

[20]王樹軍.光譜法研究硝基苯基卟啉鋅與咪唑類的軸向配位反應[J].應用化學, 2010, 27(06): 721-726.

[21]GOTO Y, HAGIHARA Y, HAMADA D, et al. Acid-induced unfolding and refolding transitions of cytochrome c: A three-state mechanism in water and deuterium oxide[J].Biochemistry, 1993, 32(44): 11878-11885.

[22]BALAKRISHNAN G, HU Y, OYERINDE O F, et al. A conformational switch to beta-sheet structure in cytochrome c leads to heme exposure. Implications for cardiolipin peroxidation and apoptosis[J]. Journal of the American Chemical Society, 2007, 129(3): 504-505.

[23]SASAHARA K, MCPHI P, MINTON A P. Effect of Dextran on Protein Stability and Conformation Attributed to Macromolecular Crowding[J]. Journal of molecular biology,2003, 326(4): 1227-1237.

[24]MCPHIE P, NI Y S, MINTON A P. Macromolecular Crowding Stabilizes the Molten Globule Form of Apomyoglobin with Respect to Both Cold and Heat Unfolding[J]. Journal of molecular biology, 2006, 361(1):7-10.

[25]MUKHERJEE S, WAEGELE M M, CHOWDHURY P, et al.Effect of macromolecular crowding on protein folding dynamics at the secondary structure level[J]. J Mol Biol, 2009,393(1): 227-236.

[26]VENTUROLI D, RIPPE B. Ficoll and dextran vs. globular proteins as probes for testing glomerular permselectivity:effects of molecular size, shape, charge, and deformability y[J]. American Journal of Physiology - Renal Physiology, 2005,288(4): 605-613.

[27]劉艷偉, 曹洪玉, 唐乾, 等. 大分子擁擠條件下光誘導細胞色素C還原的光譜研究[J]. 化學學報, 2014,72: 246-252.