高海拔地區視網膜靜脈阻塞氣虛血瘀證患者外周血VEGF及ET-1表達的差異

楊艷 ，王仁嬡 ，吳萍 ，黃寧斌 ，尚虎虎 ，馬錫玲

視網膜靜脈阻塞 （retinal vein occlusion,RVO）是高原地區常見眼底疾病，屬中醫“暴盲”范疇，是眼科典型的血瘀證候，但是臨床大多數患者，又兼有氣虛的表現[1]，從中醫理論角度研究低氧環境對機體的影響是一項重要的研究課題。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）和內皮素-1（endothelin-1,ET-1）均為血管活性物質，在調節血管舒縮及血管重建中起重要作用，已日益被人們所重視。本課題通過對不同海拔環境下氣虛血瘀證RVO患者VEGF以及ET-1的檢測，研究其表達水平的變化及差異，探討高原氣虛血瘀的本質，為以后更加深入的研究高原氣虛血瘀證打下基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2012年1月—2015年1月，經青海大學附屬醫院眼科門診或病房收集確診為氣虛血瘀證的單眼RVO患者60例，分屬于兩個不同的海拔地區。西寧地區 （平均海拔2000 m）RVO患者30例，男性16例，女性14例；年齡最小41歲，最大75歲，平均（56±1.2） 歲；CRVO 19 例，BRVO 11 例； 缺血型 12例，非缺血型18例；合并有高血壓病者15例。格爾木市（平均海拔2800 m，患者居住地在海拔3000 m以上）選取RVO患者30例，男性21例，女性9例；年齡最小 45 歲，最大 81 歲，平均（51±2.3）歲；CRVO 13例，BRVO 17例；缺血型16例，非缺血型14例；合并有高血壓者19人。同期收集西寧地區及格爾木市的正常人各30例。所有被納入者均為世居人群，經門診或住院確診。研究方案已通過醫學倫理委員會批準，對所有受試者均進行知情同意并簽署知情同意書。

RVO診斷標準 參照人民衛生出版社出版的十二五規劃教材《眼科學》[2]中的診斷標準。（1）視力減退，或眼前黑影飄動；（2）眼底檢查，視網膜靜脈擴張迂曲，視網膜表層火焰狀或片狀出血，棉絨斑，水腫，絮狀滲出，或伴有玻璃體積血、黃斑水腫等；（3）熒光素眼底血管造影（FFA）：視網膜靜脈充盈時間延遲，管壁滲漏，并出現視網膜毛細血管缺血無灌注區。

氣虛血瘀證標準 參照普通高等教育中醫藥類十二五行業規劃教材《中西醫結合眼科學》[1]相關內容制定。面色淡白或晦滯，身倦乏力，氣少懶言，疼痛如刺，常見于胸脅，痛處不移，拒按，舌淡暗或有紫斑，脈沉澀。

氣虛血瘀證RVO納入標準 （1）同時符合RVO診斷標準以及氣虛血瘀證辨證標準；（2）當地世居人群，單眼首次發病，年齡不限。

氣虛血瘀證RVO排除標準 （1）妊娠或哺乳期婦女；（2）心、肝、腎功能明顯異常者，或惡性腫瘤患者；（3）青光眼，糖尿病視網膜病變（DR），葡萄膜炎，視網膜脫離等疾病患者。

正常人納入標準 當地世居人群，眼底正常。

正常人排除標準 新入高原的外來人口。

1.2 觀察指標

血清ET-1：住院患者于入院后次日清晨空腹抽取靜脈血5 ml，門診患者于診斷清楚后次日清晨空腹抽取靜脈血5ml。乙二胺四乙酸鈉抗凝，3000 r/min離心10 min，取血清置于EP管中，-20℃冰箱保存待測。檢測前室溫下復溫，所有標本均凍融一次。酶聯免疫吸附試驗法 （enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）檢測ET-1，用純化的人ET-1抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入ET-1，再與辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的羊抗人抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過徹底洗滌后加底物四甲基聯苯胺（3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine,TMB）顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的ET-1呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，通過標準曲線計算樣品中人ET-1濃度。

血清VEGF：取血方法同上，ELISA法檢測血清VEGF。

試驗儀器：低溫冰箱（-80℃），TG16-WS高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），恒溫箱（上海一恒科學儀器有限公司），酶標定量測定儀（深圳雷杜生命科學有限公司），游標卡尺（桂林可立德量器有限公司）。ELISA試劑盒（北京久峰潤達生物技術有限公司提供）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 12.0統計分析軟件，計量資料以xˉ±s表示，不同人群組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

在西寧以及格爾木地區，RVO氣虛血瘀證患者的ET-1及VEGF水平均明顯高于本地區的正常組（P＜0.05）。不同地區間比較，格爾木地區RVO氣虛血瘀證患者的ET-1及VEGF數值高于西寧地區患者（P＜0.05），兩地區正常組間的 ET-1、VEGF 水平則均無明顯差異（P＞0.05），具體見表 1、表 2。 RVO 氣虛血瘀證者ET-1、VEGF水平的普遍升高，以及該兩項指標數值隨海拔升高而增加的結果，提示外環境低氧參與了氣虛血瘀證視網膜靜脈阻塞的形成，并且加劇了靜脈阻塞后的局部缺血缺氧。

3 討論

外環境低氧損傷是高原醫學、航天醫學等學科領域面臨的共性問題，高原氣虛證系由外環境低氧引發并且具有較典型氣虛證的病理改變和臨床表現的一種中醫證型，由氣虛導致血瘀是許多高原常見疾病發病的病理機制[4]。RVO是高原地區常見眼底疾病，屬中醫“暴盲”范疇，是眼科典型的血瘀證候，但是臨床大多數患者，又兼有氣虛的表現[1]。從中醫角度研究外環境低氧對機體的影響是一項重要的研究課題。

表1 不同海拔地區RVO氣虛血瘀證者及正常人血清 ET-1 比較（xˉ±s，ng/l）

表2 不同海拔地區RVO氣虛血瘀證者及正常人血清 VEGF 比較（xˉ±s，pg/ml）

ET-1是血管內皮損傷的分子標志物之一[5]。內皮損傷是增加ET-l釋放的重要機制，有研究發現低氧能以時間依賴的方式誘導微血管周細胞ET-l的分泌，缺氧狀態下，血管內皮細胞生成各種活性物質的比例失衡，ET-1的產生增加，內皮細胞凋亡亦增加。視網膜靜脈阻塞后由于靜脈血管的栓塞，導致了局部的缺血缺氧，誘導ET-1升高[6]。VEGF是多功能的細胞因子，是生理條件下和病理生理適應過程中血管生長的主要調節因子[7]，缺血缺氧是該因子表達的強烈誘導因素。研究顯示，血栓在動靜脈交叉或篩板處形成后，可使視網膜發生缺氧，視網膜毛細血管在結構和功能上隨即發生改變，血-視網膜屏障發生破壞使大分子物質和離子等從毛細血管進入視網膜組織，從而發生視網膜水腫，視網膜缺氧缺血時，可誘發VEGF表達增加，血管通透性增加，黃斑水腫形成。

本研究中發現，同一海拔人群，患病人群的ET-1及VEGF的表達明顯升高，提示視網膜靜脈阻塞氣虛血瘀證的ET-1及VEGF的表達確實產生增加，參與了血管病變的發生；不同海拔正常人群ET-1及VEGF的水平未見統計學意義的差異，但是在患病人群中，高海拔地區者ET-1及VEGF的表達明顯升高，這也從另外一個側面提示外環境低氧參與了氣虛血瘀證視網膜靜脈阻塞的形成，并且加劇了靜脈阻塞后的局部缺血缺氧，從而誘導高表達。

高原低氧、低氣壓、寒冷的自然環境造成了生活在高原的人群身體狀況、疾病特點等方面都與平原地區的人群有很大差別[8]。高原低氧環境對人體臟腑功能、能量物質代謝等諸多方面具有廣泛的影響[9]。“氣為血之帥，血為氣之母。”氣旺，則可推動血液運行周身；若氣虛，則氣不行血，導致血瘀。氣虛血瘀證的病機是氣虛為本，在先；血瘀是標，生于后。高原氣虛血瘀證是指由于高原地區空氣稀薄，清氣化源不足，宗氣匱乏，不能助肺以行呼吸，貫心脈，導致人體機能下降，加之高原寒冷的氣候特點，易使血液出現“濃、黏、稠、聚”等氣虛血瘀證的表現。高原寒冷可使血流緩慢，進一步加重缺氧，使氣虛血瘀證更加嚴重，從而形成具有高原特點的“氣虛血瘀證”[10]。ET-1及VEGF的水平與視網膜靜脈阻塞的范圍以及程度有沒有直接關系，在靜脈阻塞的不同階段如何變化，另外其他證型有無如此的表現，外周血的水平與視網膜組織中的表達有無差異都值得進一步探索。因而，深入探討微血管變化的調控機制成為尋找阻塞后改善微循環障礙的切人點，這些對于深入研究高原疾病以及對于中醫在高原病領域的探究意義重大。