青光安Ⅱ號方對慢性高眼壓大鼠視網膜熱休克蛋白的影響

劉悅，周亞莎，徐劍，彭俊，張又葦，戴宗順，覃艮艷，王英，彭清華，陳向東

青光眼（glaucoma）是指當眼壓超過眼內組織、特別是視神經所能承受的限度，引起視杯凹陷，視神經萎縮及視野缺損的眼病[1]。其損害機制目前尚不明確，大量研究表明，異常升高的眼壓是導致青光眼性視神經損害的最主要因素。流行病學研究表明，青光眼總發病率1%，45歲以后，發病率上升到2%，根據世界衛生組織收集的資料統計，21世紀初全球青光眼患者已達7280萬，其中超過10%的患者最終失明。關于青光眼的治療，目前主要是通過藥物及手術的方法將眼壓降至安全的靶眼壓范圍，但是目前仍然沒有一種藥物可以有效的恢復由高眼壓造成的視網膜神經節細胞死亡而導致的視力喪失、視野缺損等視功能損害。因此，青光眼的治療不僅要重視降眼壓，同時也要注重保護視功能[2]。熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是一種因熱休克、生理逆境、組織損傷、病原體感染等應激條件下表達提高的應激蛋白。大量研究表明[3-6]，HSP在抗凋亡中有非常重要的作用，在視神經損傷時，其在視網膜中的表達量會應激性上升，起到保護視神經的作用。

本實驗采用烙閉上鞏膜靜脈的方法建立大鼠慢性高眼壓模型，運用青光眼Ⅱ號方對實驗性慢性高眼壓（elevated intraocular pressure,EIOP）大鼠進行干預，觀察慢性EIOP大鼠視網膜中HSP表達的變化，為中醫藥治療視網膜視神經疾病提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物藥物試劑及儀器

質量檢驗合格 （合格證編號：43004700016136）的雄性SD大鼠40只，體質量180～200 g，SPF級，遠交系，由湖南中醫藥大學動物實驗中心提供。青光安Ⅱ號方：由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。加水提取2次。一煎加8倍量水提取1.5 h；二煎加6倍量水提取1 h；合并提取液，過濾，濃縮，制成浸膏，4℃冰箱中保存備用。益脈康分散片：湖南湘雅制藥有限公司，國藥準字：Z20080073。HSP27抗體由美國bioworld公司提供，HSP60、HSP70抗體均由美國proteintech公司提供。接觸式眼壓筆Tono-Pen，由美國Reichert公司提供，型號：AVIA。

1.2 實驗分組、模型建立及給藥

將40只大鼠隨機抽取6只作為空白組，剩余34只采用燒灼鞏膜表淺靜脈法建立大鼠慢性高眼壓模型。造模前1 d，除空白組外，其余所有大鼠術前8 h禁水禁食。選用對眼壓無明顯影響的1%苯巴比妥鈉3.5 mL/kg腹腔注射麻醉。麻醉滿意后，用眼壓計測得雙眼基礎眼壓并記錄。參照文獻方法[7]，選擇大鼠雙眼鼻側鞏膜表淺靜脈2條及顳側鞏膜表淺靜脈1條，將其與周圍眼組織分離后，使用眼科一次性燒灼器燒灼此3條表淺靜脈，直至血流中斷，術中需小心細致操作，以免損傷臨近眼部組織。術畢術眼涂復方妥布霉素（典必舒）眼膏，術后第2天開始，每日滴復方妥布霉素（典必舒）滴眼液3次，每次1滴，持續1周預防感染。術后眼壓連續56 d均持續在25 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）以上視為造模成功。若術后眼壓未見上升，或上升后回降，則進行二次造模，方法為：再一次燒灼2根鞏膜表面靜脈。若第二次造模也失敗，則將造模失敗鼠剔除本次實驗研究范圍。將造模成功的大鼠30只按隨機數字表法分為5組，每組6只，分別為：模型組、青光安Ⅱ號方低、中、高劑量組、益脈康組。

給藥方法：根據人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值表，折算系數為0.018，計算出灌胃劑量為：空白組、模型組：生理鹽水 12 mL/（kg·d）；青光安Ⅱ號方低、中及高劑量組：青光安Ⅱ號方浸膏6.75g/（kg·d）（相當于成人等效劑量）、13.5g/（kg·d）（相當于成人 2 倍等效劑量）及 27g/（kg·d）（相當于成人 4 倍等效劑量）。益脈康組：益脈康分散片 0.22 g/（kg·d）。每只大鼠根據體重，按以上灌胃量每日灌胃1次。所有實驗大鼠每周稱1次體重，重新計算給藥劑量以免因大鼠體重的增加影響實驗結果。

1.3 取材及HE染色

分別于造模后14、28 d進行取材：1%苯巴比妥鈉腹腔注射麻醉（麻醉劑量同前），麻醉滿意后摘除雙眼眼球，斷頸處死。每組隨機選取1只眼球，行常規病理切片，光鏡下觀察視網膜形態學改變。將行病理切片的眼球保存于4%多聚甲醛溶液中固定待用，余下眼球摘除后在解剖顯微鏡下去除眼前節組織，用顯微鑷仔細剝離出視網膜組織（注意盡量保存視網膜的完整性），保存于-80℃的冰箱中待用。

HE染色：從固定液中取出視網膜標本，梯度酒精脫水，二甲苯浸泡，浸蠟，包埋，切片成5 μm厚，烘干，脫蠟，然后行常規HE染色，400倍光學顯微鏡下觀察HE染色標本視網膜各層結構的形態學變化。

1.4 檢測HSP27、HSP60及HSP70的表達

Western blot法：（1）樣品制備：剪取0.25 g組織，勻漿，裂解，離心后取上清液。（2）蛋白濃度檢測：根據BCA蛋白定量試劑盒的使用說明書進行操作，測定樣品的蛋白濃度。（3）western blot：電泳，轉膜，封閉，一抗孵育，二抗孵育后將ECL化學發光液與膜孵育3 min，用吸水紙把液體吸盡，用保鮮膜包裹雜交膜，在暗盒中和X膠片曝光幾秒至數分鐘；顯影沖洗。

1.5 統計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行實驗數據分析，所有數據以均數±標準差（xˉ±s）表示。原始計量資料進行正態性分布及方差齊性檢驗，若滿足正態性和方差齊性，多組比較采用方差分析；不滿足正態性和方差齊性時，則用 Dunnett’s T3比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 眼壓

造模后第56天，68只鼠眼中有13只眼眼壓正常，55只眼維持高眼壓，造模成功率為81%。造模前6組大鼠眼壓組間比較，P＞0.05，差異無統計學意義。造模后第1天，各組大鼠眼壓與空白組比較，P＜0.01，差異有統計學意義，說明手術后第1天，各組大鼠眼壓均有明顯上升。造模后第56天，各組大鼠眼壓值與空白組比較，P＜0.01，差異有統計學意義，說明術后第56天，各組大鼠眼壓值仍持續在較高水平。手術后不同時期各組眼壓值與該組術前比較：除空白組外，其余各組大鼠眼壓值在術后第1天和術后第56天與術前比較，P＜0.01，差異均有統計學意義；術后第56天和術后第1天比較，P＞0.05，差異無統計學意義，說明除空白組外，各組大鼠造模后第1天及造模后第56天眼壓均較手術前明顯上升，且維持在高眼壓狀態（表1）。

表1 手術前后不同時間各組大鼠眼壓平均值(xˉ±s,mm Hg)

2.2 HE染色

空白組視網膜神經節細胞層、內外核層等各層結構排列有序，形態規則（圖1）。灌胃后第14天：模型組視網膜神經纖維層水腫，排列疏松，形態欠規則，神經節細胞層及內核層細胞減少（圖2A）。青光安Ⅱ號方高、中、低劑量組及益脈康組視網膜神經纖維層稍有水腫，排列較疏松，形態尚規則，神經節細胞層及內核層細胞較空白組有所減少（圖2B~2E）。灌胃后第28天：模型組視網膜神經纖維層水腫加重，排列疏松，形態不規則，神經節細胞層及內核層萎縮，細胞明顯減少（圖3A）。青光安Ⅱ號方低及中劑量組視網膜神經纖維層水腫稍有減輕，排列較整齊，形態較規則，神經節細胞層及內核層未見明顯萎縮，神經節細胞數量較2周前無明顯減少（圖3B~3C）；而高劑量組視網膜神經纖維層水腫明顯減輕，視網膜各層排列較整齊，形態較規則，神經節細胞層及內核層未見萎縮，神經節細胞較2周前未見減少（圖3D）。益脈康組視網膜神經纖維層水腫未見明顯加重，視網膜各層排列較整齊，形態尚規則，神經節細胞層及內核層未見明顯萎縮，神經節細胞較14天前略有減少（圖 3E）。

圖1 空白組視網膜結構，光鏡下可見視網膜各層結構排列有序，形態規則 圖2 灌胃后14 d光鏡下各組視網膜結構。2A模型組視網膜神經纖維層水腫，神經節細胞層及內核層細胞減少。2B~2E為青光安Ⅱ號方高、中、低劑量組及益脈康分散片組，可見視網膜神經纖維層稍有水腫，排列較疏松，形態尚規則，神經節細胞層及內核層細胞較空白組有所減少 圖3 成模后28 d光鏡下觀察視網膜結構。3A模型組視網膜神經纖維層水腫加重，神經節細胞層及內核層萎縮；3B~3C青光安Ⅱ號方低及中劑量組視網膜神經纖維層水腫稍有減輕，而高劑量組（3D）視網膜神經纖維層水腫明顯減輕。3E益脈康組視網膜神經纖維層水腫未見明顯加重，視網膜各層排列較整齊，形態尚規則 HE染色 ×400

2.3 Western blot結果

將曝光后的底片掃描，并用quantity one專業灰度分析軟件進行分析。三種熱休克蛋白無論是灌胃14 d還是28 d，各組與模型組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05）。

視網膜HSP27表達的相對灰度值比較：灌胃14 d，青光安Ⅱ號方低、中劑量組與益脈康組比較，P低=0.365、P中=0.231，差異均無統計學意義；而高劑量組與益脈康組比較，P=0.032，差異有統計學意義。青光安Ⅱ號方低劑量組與中、高劑量組比較，P中=0.760、P高=0.180；中劑量組與高劑量組比較，P=0.292，差異均無統計學意義。灌胃28 d，青光安Ⅱ號方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.018、P中=0.010、P高=＜0.001，差異均有統計學意義。青光安Ⅱ號方低、中劑量組與高劑量組比較，P低=0.002、P中=0.003，差異有統計學意義；青光安Ⅱ號方低劑量組與中劑量組比較，P=0.764，差異無統計學意義。說明青光安Ⅱ號方各濃度及益脈康灌胃均可促進EIOP大鼠視網膜HSP27的表達，其中以青光安Ⅱ號方高劑量組效果最優。

視網膜HSP60表達的相對灰度值比較：灌胃14 d，青光安Ⅱ號方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.517、P中=0.116、P高=0.063， 差異均無統計學意義。青光安Ⅱ號方低劑量組與中、高劑量組比較，P中=0.033、P高=0.017，差異均有統計學意義；而中劑量組與高劑量組比較，P=0.745，差異無統計學意義。灌胃28 d，青光安Ⅱ號方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.025、P中=0.010、P高＜0.001， 差異均有統計學意義。青光安Ⅱ號方低、中劑量組與高劑量組比較，P低=0014、P中=0.033，差異均有統計學意義；而低劑量組與中劑量組比較，P=0.671，差異無統計學意義。說明青光安Ⅱ號方各濃度及益脈康灌胃均可促進EIOP大鼠視網膜HSP60的表達，其中以青光安Ⅱ號方高劑量組效果最優。

視網膜HSP70表達的相對灰度值比較：灌胃14d，青光安Ⅱ號方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.603、P中=0.794、P高=0.130，差異無統計學意義。青光安Ⅱ號方低劑量組與高劑量組比較，P=0.048，差異有統計學意義；而低劑量組與中劑量組、中劑量組與高劑量組比較，P低=0.438，P中=0.202， 差異均無統計學意義。灌胃28 d，青光安Ⅱ號方低、中及高劑量組與益脈康組比較，P低=0.012、P中＜0.001、P高＜0.001， 差異均有統計學意義；青光安Ⅱ號方低劑量組與高劑量組比較，P=0.023，差異有統計學意義；而低劑量組與中劑量組、 中劑量組與高劑量組比較，P低=0.079、P中=0.542，差異均無統計學意義。說明青光安Ⅱ號方各濃度及益脈康灌胃均可促進EIOP大鼠視網膜HSP70的表達，其中以青光安Ⅱ號方高、中劑量組效果最優（表2）。

表2 各組大鼠視網膜HSP表達的相對灰度值(xˉ±s,%)

3 討論

青光眼屬于中醫學 “五風內障”的范疇，公元752年的《外臺秘要》一書中，最早提出了“烏風”“綠翳青盲”等概念。導師彭清華教授在數年的理論研究及臨床實踐中發現，除神水淤積之外，脈絡瘀滯(血瘀)亦是其重要的病理改變，兩者互為因果、并相互影響，從而加重病情；而慢性高眼壓引起的視神經損傷多發生在青光眼疾病的后期，病程較長，久病多虛多瘀。流行病學調查表明，該病老年患者發病率較高，故多有肝腎虧虛、氣陰不足的病理機制，且肝腎的功能與眼病的發生有著密切的聯系，因此，導師認為慢性高眼壓引起的視神經損傷的病因病機為：肝腎虧虛，氣虛血瘀，治療上當以滋補肝腎為主，兼以益氣活血，基于該治則創立了青光眼Ⅱ號方。

近年來，眾多的研究表明青光眼引起的視神經損傷主要與視網膜神經節細胞（retinal ganglion cell,RGC）的凋亡有關，因此，阻斷或減少RGC凋亡的途徑成為了防治青光眼視神經損傷的焦點。HSP是一個應激性蛋白家族，其分子量為10-90kDa，常作為一種分子伴侶參與到蛋白質的折疊、修復與退變中，它在抗凋亡中有非常重要的作用，在視神經損傷時，其在視網膜中的表達量會應激性上升，起到保護視神經的作用。HSP主要通過以下幾個途徑來發揮抗凋亡的作用[8]：（1）對線粒體功能的保護作用；（2）對SAPK/JNKs激活的抑制作用；（3）抑制凋亡激活基因p53、Bax 的表達；（4）抑制自由基的生成；（5）抑制凋亡信號轉導中的蛋白水解酶。根據HSP分子量的大小， 可分為 HSP25、HSP27、HSP60、HSP70 和 HSP90等不同分子量的亞群。HSP27被證實在視網膜神經節細胞及視網膜神經纖維層中有表達，且在實驗性高眼壓大鼠模型中表達增加[9]。Tezel等[10]對正常人尸體眼睛視網膜中的HSP分布進行了研究，結果表明，HSP60主要存在于視網膜神經節細胞中。Yamaguchi等[11]通過對大鼠視網膜中HSP70的分布進行動態研究，結果發現HSP70首先在視網膜神經膠質細胞中表達，隨后開始在視神經纖維中開始表達。本實驗主要研究青光安Ⅱ號方對慢性高眼壓大鼠模型視網膜中 HSP27、HSP60、HSP70的影響。

本實驗成功建立了慢性EIOP大鼠模型，維持高眼壓狀態56 d后開始用青光安Ⅱ號方不同劑量及益脈康分散片進行干預，并與模型組進行比較，灌胃14d及28 d后分時段取材。結果表明：（1）正常大鼠視網膜中有HSP27、HSP60及HSP70的表達，造成慢性EIOP模型后，其表達增加，說明造模后，該三種熱休克蛋白會應激性增高，可能與RGC凋亡有關。（2）與EIOP模型組比較，青光安Ⅱ號方能促進實驗性EIOP大鼠HSP27、HSP60、HSP70的表達，說明青光安Ⅱ號方可能對慢性EIOP大鼠視神經損傷有保護作用。