維生素D受體基因Apa1、Taq1多態性與肺鱗癌易感性的關系

楊雁鴻，吳劍冬，周文文，侯燕燕，尹端端，王真真

(1.河北省秦皇島市第一醫院腫瘤科，河北 秦皇島 066000；2.承德醫學院研究生院，河北 承德 067000)

維生素D受體基因Apa1、Taq1多態性與肺鱗癌易感性的關系

楊雁鴻1，吳劍冬1，周文文1，侯燕燕1，尹端端1，王真真2

(1.河北省秦皇島市第一醫院腫瘤科，河北 秦皇島 066000；2.承德醫學院研究生院，河北 承德 067000)

目的探討維生素D受體(vitamin D receptor,VDR)Apa1、Taq1兩基因位點的多態性與肺鱗癌易感性之間的關系。方法采集288例肺鱗癌患者和284例健康對照個體肘靜脈血5 mL，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術方法，對VDR Apa1、Taq1兩基因位點行基因型檢測。 結果VDR Taq1位點基因多態性是肺鱗癌發生的危險因素，其中tt+Tt基因型攜帶者發生肺鱗癌的風險是TT基因型攜帶者的0.556倍(OR=0.556，95%CI=0.393～0.785)。按是否吸煙分層分析：吸煙人群中，Taq1位點基因多態性在病例組與對照組間差異有統計學意義，tt+Tt基因型攜帶者發生肺鱗癌的風險是TT基因型攜帶者的0.049倍 (OR=0.049，95%CI=0.259～0.929)；t等位基因攜帶者發生肺鱗癌的風險是T等位基因攜帶者的0.444倍(OR=0.444，95%CI=0.241～0.817)。而VDR Apa1位點多態性與肺鱗癌易感性無相關性。結論VDR Taq1基因多態性與肺鱗癌的遺傳易感性相關，tt+Tt基因攜帶者肺鱗癌發病風險降低；t等位基因與患肺鱗癌風險呈負相關；吸煙者中tt+Tt基因攜帶者肺鱗癌的發病風險顯著降低。

肺腫瘤；維生素D；基因

肺癌是發病率高、治療效果差、病死率高、嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，其中肺鱗癌在肺癌中占1/3。維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)普遍存在于機體各組織細胞中，其中淋巴細胞、結腸、肺等部位表達量較高，具有抗腫瘤增殖、使腫瘤體積減小和數量減少等功能。本研究探討VDR Apa1、Taq1兩基因位點的多態性與肺鱗癌易感性之間的關系，旨在找出肺鱗癌的易感因素，為臨床探索提供新的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年12月—2014年12月河北省秦皇島市第一醫院收治的肺鱗癌患者288例為病例組，均有病理學診斷依據，男性170例，女性118例，年齡52～73歲，平均(62.3±10.2)歲。選擇同期健康體檢者284例為對照組，男性162例，女性122例，年齡50～79歲，平均(63.0±10.3)歲。2組性別、年齡差異均無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法 記錄研究對象一般信息、疾病史和有關臨床資料。采集288例肺鱗癌患者和284例健康對照個體肘靜脈血5 mL(經枸櫞酸鈉抗凝處理)，在提取外周血的白細胞DNA之后，采用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)技術方法，對VDR Apa1、Taq1兩基因位點行基因型檢測。

1.3 統計學方法 應用SPSS 17.0統計軟件處理數據。計數資料比較采用χ2檢驗；危險因素分析采用Logistic多因素回歸分析肺；以比值比(odds ratio，OR)和95%可信區間(confidence interval，CI)表示相對危險度。P<0.05為差異有統計學意義

2 結 果

2.1 Apa1位點基因分型結果 Apa1位于3′端第8內含子區，其多態性是由于堿基A→C的突變，PCR產物電泳及測序證實(圖1～4)：C等位基因純合子命名為aa基因型，電泳中產生148 bp和190 bp 2個條帶；A等位基因純合子命名為AA基因型，電泳中產生338 bp 1個條帶；雜合子命名為Aa基因型，電泳中產生338 bp，148 bp和190 bp 3個條帶。

2.2 Taq1位點基因分型結果 Taq1位于3′端第9外顯子區，其多態性是由于堿基T→C的突變，PCR產物電泳及測序證實(圖5～8)：C等位基因純合子命名為tt基因型，電泳中產生110 bp和228 bp 2個條帶；T等位基因純合子命名為TT基因型，電泳中產生338 bp 1個條帶；雜合子命名為Tt基因型，電泳中產生338 bp、110 bp和228 bp 3個條帶。

2.3 Logistic回歸分析 選用非條件Logistic回歸分析肺鱗癌的易感危險因素，以是否發生肺鱗癌為因變量，以性別(男=1，女=2)、年齡(<60歲=1，≥60歲=2)、吸煙(是=1，否=2)、Apa1(aa =1，Aa=2，AA=3)、Taq1(TT =1，Tt+ tt=2)的基因型為自變量，結果顯示VDR Taq1位點基因多態性、吸煙是肺鱗癌發生的主要危險因素。其中tt+Tt基因型攜帶者發生肺鱗癌的危險是TT基因型攜帶者的0.556倍；吸煙者發生肺鱗癌的危險是非吸煙者的2.392倍。見表1。

按是否吸煙進行分層分析。吸煙人群中，Apa1位點基因多態性在病例組與對照組間差異無統計學意義(χ2=0.547，P=0.459)；Taq1位點基因多態性在病例組與對照組間差異有統計學意義(χ2=4.908，P=0.027)， tt+Tt基因型攜帶者發生肺鱗癌的風險是TT基因型攜帶者的0.049倍(OR=0.049，95%CI=0.259～0.929)；t等位基因、T等位基因在病例組與對照組間差異有統計學意義，t等位基因攜帶者肺鱗癌的發病風險是T等位基因攜帶者的0.444倍(OR=0.444，95%CI=0.241～0.817)。非吸煙人群中，Apa1、Taq1位點基因多態性在病例組與對照組間差異均無統計學意義(χ2=3.104、0.071，P=0.078、0.790)。見表2，3。

圖1 采用PCR-RFLP技術方法分析VDR-Apa1單核苷酸多態性基因型

條帶1：PCR產物；條帶2：AA純合子；條帶3：Aa雜合子；條帶4：aa純合子;M:標記物

Figure 1 The genotype analysis of SNP VDR-Apa1 by PCR-RFLP method

圖2 VDR-Apa1 aa位點基因型測序

Figure 2 Sequencing of VDR-Apa1 site aa genotype

圖3 VDR-Apa1 Aa位點基因型測序

Figure 3 Sequencing of VDR-Apa1 site Aa genotype

圖4 VDR-Apa1 AA位點基因型測序

Figure 4 Sequencing of VDR-Apa1 site AA genotype

圖5 采用PCR-RFLP技術方法分析VDR-Taq1單核苷酸多態性基因型

條帶1：PCR產物；條帶2：TT純合子；條帶3：Tt雜合子；條帶4：tt純合子;M:標記物

Figure 5 The genotype analysis of SNP VDR-Taq1 by PCR-RFLP method

圖6 VDR-Taq1 tt位點基因型測序

Figure 6 Sequencing of VDR-Taq1 site tt genotype

圖7 VDR-Taq1 Tt位點基因型測序

Figure 7 Sequencing of VDR-Taq1 site Tt genotype

圖8 VDR-Taq1 TT位點基因型測序

Figure 8 Sequencing of VDR-Taq1 site TT genotyp

表1 肺鱗癌易感危險因素非條件Logistic回歸分析Table 1 Logistic regression analysis of risk factors for SCC

表2 吸煙人群中病例組與對照組基因型和等位基因比較Table 2 The comparison of genetypes and alleles beween patient group and control group in smokers (例數，%)

表3 非吸煙人群中病例組與對照組基因型和等位基因比較Table 3 The comparison of genetypes and alleles beween patient group and control group in non-smokers (例數，%)

3 討 論

肺癌的疾病演變是多基因參與、多因素交互、眾多階段變化相互作用的結果。吸煙是肺癌的重要致病因素，隨著每天吸煙量的增加以及吸煙年數的延長，罹患肺癌的危險也隨之增加[1]。暴露于相同致病環境中的個體，并非都會發生肺癌，表明個體之間罹患肺癌的風險存在差異，而這一差異正是由于遺傳因素所決定的。單核苷酸突變、缺失及基因多態性等遺傳因素決定了不同個體對遺傳易感性的差異[2-3]。個體之間外顯性的不同、疾病易感性和藥物反應性不同的最重要遺傳學基礎就是存在于整個基因組的單核苷酸多態性[4-5]。

維生素D是目前研究的一個熱點課題，因其除了參與鈣的代謝外，還調節惡性腫瘤細胞的增殖和分化。維生素D在與VDR結合后具有調節腫瘤細胞的增殖和分化，抑制其生長甚至誘導腫瘤細胞凋亡的作用[6-7]。VDR是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族成員之一，本質為親核蛋白，是一種配體依賴因子[8]，VDR基因的多態性影響了維生素D效應的發揮。有關肺癌組織和肺癌前病變VDR表達的報道中，VDR在60%肺正常組織和61%肺化生組織中呈中-高度核表達。在肺癌組織中，VDR核表達為79%，62%的細胞質缺乏表達[9]。另外，一項關于人類癌癥的初步研究，應用免疫熒光技術測量VDR的表達，發現當正常細胞發生惡變時，VDR的表達數量也在發生改變，由此推測這一變化可以作為預測疾病發生的標志[10]。

已有薈萃分析顯示：VDR Taq1與患肺癌風險呈負相關，吸煙者中CC /TC(相對于本研究中的tt+Tt)基因攜帶者顯著降低了肺癌的發生風險，Taq1基因在肺部致癌因素特別是吸煙患者中起保護作用[11]；維生素D Apa1 AA基因型與亞洲人患肺癌的風險相關，Taq1 t等位基因和TT基因型與白種人患肺癌風險相關[6]；Apa1可能是肺癌發生的危險因素之一[12]；Apa1、Taq1酶切位點的多態性可能與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)的遺傳易感性無關[13]；Dogan等[14]學者對VDR Apa1、Taq1與肺癌易感性關系的研究中，證實Taq1多態性可能是肺癌患者致病的危險因素之一，且年齡、吸煙、性別等可能加重這一因素的影響。本研究重點探討肺鱗癌患者與VDR基因Apa1、Taq1可能的相關性，選用非條件Logistic回歸分析得出VDR Taq1位點多態性、吸煙是肺鱗癌易感的危險因素，tt+Tt基因攜帶者肺鱗癌發病風險降低，t等位基因與患肺鱗癌風險呈負相關，吸煙者中tt+Tt基因攜帶者顯著降低了肺鱗癌的發病風險，而未得出VDR Apa1位點多態性與肺鱗癌易感性相關的結論。也有研究表明，維生素D基因多態性可能對NSCLC晚期患者人群的存活率沒有真正的影響[15]。既往研究結論尚有爭議，出現不同結果的原因可能是：①不同地理環境、不同種族間基因多態性存在差異；②VDR基因與其他基因存在相互作用，各研究結果的差異與不同人群連鎖不平衡類型的差異有關；③選取的樣本較片面，可能造成一定程度的結果差異。

綜上所述，遺傳因素在肺癌發病中所起的重要作用，雖然目前未有確定的結論，但基因位點多態性重要影響仍舊存在。在今后進一步的研究中，應考慮多方面因素加以探討，以便為腫瘤的早期診斷、個體化治療和預后評價提供新的思路。

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(本文編輯：劉斯靜)

Association of vitamin D receptor gene Apa1 and Taq1 polymorphisms with susceptibility to lung squamous cell carcinoma

YANG Yan-hong1， WU Jian-dong1， ZHOU Wen-wen1， HOU Yan-yan1, YIN Duan-duan,WANG Zhen-zhen2

(1.Department of Oncology, the First Hospital of Qinhuangdao City, Hebei Province, Qinhuangdao 066000, Chian; 2.Graduate School, Chengde Medical College, Chengde 067000, China)

Objective To investigate the relationship between polymorphism of vitamin D receptor(VDR) gene(including Apa1, Taq1) and susceptibility of squamous cell carcinoma of lung cancer(SCC). Methods The blood samples were collected from 288 patients with SCC and 284 healthy individuals. Leukocyte DNA from peripheral blood was extracted. The method of polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP) was applied to test the genotype of Apa1, Taq1 in VDR gene. Results VDR Taq1 gene polymorphisms is the risk factor of SCC. The SCC risk of tt+Tt genotype carriers is 0.556 times than the TT genotype carriers(OR=0.556， 95%CI=0.393-0.785). Based on stratification analysis of smoking: In smoking group, there is statistical significance in Taq1 gene polymorphisms. The SCC risk of tt+Tt genotype carriers is 0.049 times than the TT genotype carriers(OR=0.049， 95%CI=0.259-0.929). There is statistical significance in t allele and T allele. The SCC risk of t allele carriers is 0.444 times than the T allele carriers(OR=0.444， 95%CI=0.241-0.817). Conclusion Taq1 polymorphism is related to genetic susceptibility of SCC. The tt+Tt gene reduces the risk of SCC. The t allele is negatively correlated with the risk of SCC. Smokers with tt+Tt gene are significantly reduced the risk of SCC.

lung neoplasms; vitamin D; gene

2016-08-07；

2015-12-05

秦皇島市科學技術研究與發展計劃(201101A259)

楊雁鴻(1966-)，女，河北秦皇島人，河北省秦皇島市第一醫院主任醫師，醫學碩士，從事惡性腫瘤診治研究。

R734.2

A

1007-3205(2017)01-0020-05

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.01.005