不同融合參數(shù)對小鼠圓形精子細胞與卵母細胞融合胚胎發(fā)育的影響

楊愛軍，于春娜，牛煥付，王雪楠，劉樹真，魏澤鋒，郝翠芳

(1.青島大學，青島 266071； 2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，濟寧 272029;3.山東師范大學生命科學學院，濟南 250014)

·實驗研究·

不同融合參數(shù)對小鼠圓形精子細胞與卵母細胞融合胚胎發(fā)育的影響

楊愛軍1#，于春娜2#，牛煥付2，王雪楠2，劉樹真3，魏澤鋒2，郝翠芳1*

(1.青島大學，青島 266071； 2.濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學科，濟寧 272029;3.山東師范大學生命科學學院，濟南 250014)

目的 利用手工克隆 (handmade cloning， HMC) 技術對小鼠圓形精子細胞與去透明帶卵母細胞進行電融合，以研究電融合參數(shù)對融合胚胎發(fā)育潛能的影響。 方法 選取549枚卵母細胞與圓形精子細胞融合，根據電融合參數(shù)分為三組：A組(n=186)采用電場強度60 V/mm、脈寬30 μs、脈沖次數(shù)為 2次的直流電脈沖；B組(n=188)采用電場強度80 V/mm、脈寬20 μs、脈沖次數(shù)為2次的直流電脈沖；C組(n=175)采用電場強度100 V/mm、脈寬10 μs、脈沖次數(shù)為2次的直流電脈沖。觀察記錄不同電融合參數(shù)下圓形精子細胞與無透明帶卵母細胞的融合率、融合胚胎卵裂率以及囊胚形成率。 結果 (1)A組圓形精子細胞與去透明帶卵母細胞的平均融合率為(84.87±3.84)%，與其他兩組[(74.93±5.46)%、(73.60±5.48)%]相比平均融合率顯著升高(P<0.05)；(2)A組融合胚胎的平均卵裂率為(77.37±3.97)%，與B組、C組融合胚胎的卵裂率[(67.74±7.32)%、(66.17±9.87)%]相比顯著升高(P<0.05)；(3)A組的平均囊胚形成率為(41.28±6.50)%，顯著高于C組[(31.03±6.09)%](P<0.05)。 結論 A組采用電場強度60 V/mm、脈寬30 μs、脈沖次數(shù)為2的直流電脈沖是圓形精子細胞與去透明帶卵母細胞融合的最佳方案，有利于提高胚胎的發(fā)育潛能。

電融合參數(shù); 圓形精子細胞; 去透明帶卵母細胞

(JReprodMed2017，26(1)：53-58)

手工克隆(HMC)技術是一種新的核移植技術，與SCNT技術相比，無需借助價格昂貴的顯微操作儀器，簡化了核移植程序，降低了醫(yī)療費用。Selokar等[4]利用HMC技術獲得牛-水牛、水牛-水牛、山羊-水牛、大鼠-水牛胚胎，并且利用HMC技術已成功獲得了牛[5]、馬[6]以及豬[7]等幾種家畜的克隆后代。由于去除了卵母細胞最外層的透明帶，因此卵母細胞與圓形精子細胞的融合無需再借助于顯微操作儀器， HMC技術方法簡單，且能降低患者的治療費用。在HMC技術中最關鍵的環(huán)節(jié)是圓形精子細胞與去透明帶卵母細胞有效的電融合，可以通過選擇電場強度和脈沖寬度兩個重要的電融合參數(shù)來提高融合率[8]。本研究旨在尋求小鼠圓形精子細胞與去透明帶卵母細胞融合的最適電壓強度和脈沖寬度，以獲得較高的融合率和囊胚形成率，提高融合胚胎的發(fā)育潛能，同時為男性原發(fā)性無精子癥或非梗阻性無精子癥患者的治療提供參考方法。

材料與方法

一、材料

1. 實驗動物：昆明白雌性及雄性小鼠(清潔級)均購買于山東大學新藥評價中心(SCXK(魯)20130009)，雌性小鼠4～6周齡，雄性小鼠10周齡。飼養(yǎng)條件：溫度為20～22℃，濕度為40%～60%，光照周期(白天光照12 h，夜間黑暗12 h)。自由飲水取食，飼料為小鼠生長飼料，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。

2. 儀器和試劑：電融合儀CF-150B(BLS，匈牙利)；體視顯微鏡K-400及倒置顯微鏡AE31(Motic，美國)；培養(yǎng)箱MCO-15AC(SANYO，日本)；胚胎聚集針DN-10(BLS，匈牙利)；自制口吸管；孕馬血清促性腺激素(PMSG)和HCG(寧波三生藥業(yè))；KSOM培養(yǎng)液(Millipore，美國)；牛血清白蛋白(BSA)(Roche，美國)；其他試劑均購自美國Sigma公司。

3. 溶液配制：(1)CZB培養(yǎng)液：稱取NaCl 477.0 mg，KCl 36.0 mg，KH2PO416.0 mg，MgSO4·7H2O 29.0 mg，NaHCO3211.0 mg，CaCl2·2H2O 25.0 mg，60%乳酸鈉584.0 mg，丙酮酸鈉3.0 mg，EDTA·Na24.1 mg，L-谷氨酰胺14.6 mg，青霉素6.0 mg，鏈霉素5.0 mg，葡萄糖110.0 mg，BSA 500 mg溶于100 ml三蒸水中，過濾除菌分裝，-20℃冰箱內保存；(2)H-CZB：稱取238.31 mg Hepes溶于100 mL CZB中；(3)酸性CZB溶液(pH 2.5)：將10 μl的10 mol/L HCl加入1 ml CZB中；(4)SrCl2(100 mmol/L)：2.666 g SrCl2·6H2O溶于98 ml三蒸水中。激活處理前用含L-谷氨酰胺CB的無鈣CZB稀釋得到濃度為10 mmol/L的工作液；(5)電融合液：甘露醇2 732.7 mg，MgSO4·7H2O 1.232 mg，CaCI2·2H2O 0.368 mg，BSA 50 mg，溶于50 ml三蒸水中過濾除菌分裝，保存于4℃冰箱內；(6)植物凝集素(PHA)溶液(200 μg/ml)：將1 mg PHA粉末溶于5 ml H-CZB，每個EP管分裝200 μl，-20℃保存。

二、研究方法

1. WOW培養(yǎng)皿的制作：用無菌的胚胎聚集針在60 mm培養(yǎng)皿上壓制小凹，每排5個小凹相鄰，用預平衡的KSOM培養(yǎng)液覆蓋小凹，覆蓋石蠟油，放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內過夜平衡。

2.圓形精子細胞準備：圓形精子細胞的準備參照Ogura等[9]的方法：采用頸椎脫臼法處死昆明白雄鼠，取出一側睪丸將被膜剝離，用兩個1 ml無菌注射器將曲細精管劃碎，置Hepes-CZB中離心2次 (1 000 r/min， 5 min/次)， 最后用生理鹽水重懸沉淀物。在顯微鏡下可看到圓形精子細胞中央有明顯的球形區(qū)(染色質團構成的輪廓)，體積比其它生精細胞小(直徑約為10 μm)，因此在顯微鏡下可根據其大小與其他生精細胞區(qū)分開來。

每一個心理學派的心理隱喻都存在著巨大的差異，這些差異使得心理治療模式得到不斷的改善。從第一個心理學治療模式——經典精神分析模式開始，就開啟了人們對于心理治療的探究里程，直至目前的后現(xiàn)代心理治療，中間經歷了不斷的變革、更改，這些心理治療模式的差異也暗示了人類社會地位、生活環(huán)境在不斷改變。為了幫助人們對心理治療理論及方法具有更深層次的理解，提高對心理治療的關注程度，筆者對心理隱喻的變遷進行調查分析，總結了心理學發(fā)展研究的特點，并對其精華進行分析總結，以便運用至我國心理治療中。

3.卵母細胞激活：選擇發(fā)情間期的昆明白雌鼠每只腹腔注射10 U的PMSG，48 h后每只注射10 U的HCG，于13～14 h后用頸椎脫臼法處死小鼠，在無菌條件下取出輸卵管壺腹部，放入H-CZB中，用無菌注射針刺破輸卵管壺腹部，將取出的卵丘卵母細胞復合體放入0.1%透明質酸酶中消化1 min，以便脫去顆粒細胞，共取得549枚卵母細胞，然后將卵母細胞在H-CZB溶液中清洗5次，移入融合液中放置1～2 min。每5個卵母細胞一組，施以120 V/mm，10 μs×1的直流電脈沖激活卵母細胞，將激活后的卵母細胞在H-CZB溶液中清洗5次后，移入CZB培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h。

4.卵母細胞透明帶去除：激活的卵母細胞在CZB培養(yǎng)液中培養(yǎng)1 h后，移入酸性H-CZB中，觀察到卵母細胞透明帶去除時，將卵母細胞移到H-CZB溶液中清洗5次。

5.電融合及分組：將去透明帶卵母細胞和圓形精子細胞加入到PHA中，用玻璃針將卵母細胞推到圓形精子細胞上，粘附形成卵母細胞-圓形精子細胞對，將卵母細胞-圓形精子細胞對在融合液中清洗3次，然后在融合液中平衡1～2 min，把圓形精子細胞-卵母細胞對放入充滿融合液的融合槽中，使兩者的切面與電流方向垂直，根據融合參數(shù)不同，分為A、B、C三組：施加電場強度分別為60 V/mm、80 V/mm、100 V/mm，脈沖寬度分別為30 μs、20 μs、10 μs，脈沖次數(shù)為2的直流電脈沖。每組試驗重復7次，計算7次實驗的平均值。

每次試驗頸椎脫臼法處死2～3只昆明白小鼠，每次獲卵數(shù)是20枚或者30枚左右，A、B、C三組總獲卵數(shù)分別為186枚、188枚和175枚。融合后的卵放入KSOM中洗3遍，然后移入覆蓋KSOM培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內，15～20 min后觀察融合情況，統(tǒng)計融合率。

6.融合胚胎的激活：將融合后的胚胎移入10 mmol/L SrCl2內激活3 h，將激活后的融合胚胎移入覆蓋石蠟油的KSOM小凹培養(yǎng)皿(圖1)中，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。

7.觀察指標：每24 h觀察胚胎的發(fā)育情況，詳細記錄卵裂胚胎的數(shù)目和形成囊胚的數(shù)目，統(tǒng)計卵裂率和囊胚形成率。

圖1 WOW培養(yǎng)皿培養(yǎng)的融合胚胎(100×)

三、統(tǒng)計分析

結 果

一、不同融合參數(shù)下各組的融合胚胎融合率、卵裂率及囊胚形成率比較

A、B、C三組試驗共獲取549枚卵母細胞。其中，A組(n=186)在電場強度為60 V/mm、脈沖寬度為30 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，有158枚卵母細胞與圓形精子細胞發(fā)生融合、122枚融合胚胎發(fā)生卵裂、65枚胚胎發(fā)育至囊胚；B組(n=188)在電場強度為80 V/mm、脈沖寬度為20 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，有142枚卵母細胞與圓形精子細胞發(fā)生融合、98枚融合胚胎發(fā)生卵裂、60枚胚胎發(fā)育至囊胚；C組(n=175)在電場強度為100 V/mm、脈沖寬度為10 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，有130枚卵母細胞與圓形精子細胞發(fā)生融合、87枚融合胚胎發(fā)生卵裂、42枚胚胎發(fā)育至囊胚；A組的平均胚胎融合率、卵裂率均高于B、C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；A組的囊胚形成率顯著高于C組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表1)。

表1 不同參數(shù)下各組融合胚胎融合率、卵裂率及囊胚形成率比較(%)

組別作用卵數(shù)融合率卵裂率囊胚形成率A組1868487±3847737±3974128±650B組1887493±546?6774±732?3475±524C組1757360±548?6617±987?3103±609?

注：數(shù)值是實驗重復7次的均數(shù)結果；與A組相比，*P<0.05

二、圓形精子細胞與卵母細胞融合中的胚胎發(fā)育形態(tài)

圓形精子細胞(圖2A)與激活的無透明帶卵母細胞(圖2C)融合后，卵子恢復減數(shù)分裂，釋放第二極體，隨后圓形精子細胞染色質去濃縮，形成雄原核，卵子的染色體轉變成為雌原核，一般授精后16～18 h評估原核，最晚不超過20 h，雌雄原核相互靠近(圖2D)，核膜破裂，雙方的遺傳物質混合，啟動有絲分裂。在受精24 h后進行第一次卵裂，形成2-細胞，之后每間隔約12 h進行一次卵裂，分別形成4-細胞、8-細胞(圖2E)。在卵裂至16細胞期時，發(fā)生致密化(compaction)，致密化發(fā)生后胚胎細胞開始具有極性，內部細胞和外部細胞之間發(fā)生了很大的變化，胚胎發(fā)育到桑椹胚時，大約具32個細胞。以后胚胎的外部細胞開始分泌液體，逐漸出現(xiàn)胚泡腔，標志著囊胚(圖2F)的形成(圖2)。

A：圓形精子細胞(箭頭所示)(40×)；B：激活的MII期卵母細胞(20×);C：激活的無透明帶卵母細胞(10×)；D：融合胚胎出現(xiàn)雌雄原核(20×)；E：融合胚胎發(fā)育至8-細胞(10×)；F：融合胚胎發(fā)育至囊胚(20×)圖2 小鼠圓形精子細胞與去透明帶卵母細胞融合胚胎的發(fā)育

討 論

在臨床實踐中，利用卵胞漿內單精子注射 (ICSI) 技術將精子注射入發(fā)育成熟度欠佳的卵母細胞后，受精卵易發(fā)生退化，患者獲得可利用的胚胎很少，甚至有的患者無可利用胚胎。由于顯微操作儀器價格昂貴，對操作人員的技術要求非常高，因此患者需要繳納昂貴的手術費用。而HMC技術與ICSI 技術相比，不僅操作簡單，而且節(jié)約成本，因此可以作為男性原發(fā)性無精子癥、非梗阻性無精子癥或女性卵母細胞發(fā)育成熟度欠佳患者治療的一種參考方法。

在HMC過程中，卵母細胞的預激活不僅能夠增加卵細胞膜內離子的交換，而且能提高細胞膜的融合[10]。因此，本實驗在圓形精子細胞與無透明帶卵母細胞電融合之前預先采120 V/mm、10 μs×1次電脈沖激活卵母細胞。在三組電融合參數(shù)作用下使圓形精子細胞-卵母細胞對融合。研究表明利用電融合技術聯(lián)合化學激活方法更有利于無透明帶卵母細胞重構胚胎的發(fā)育[11-12]。因此本實驗在圓形精子細胞與卵母細胞融合后，將融合胚胎移入10 mmol/L SrCl2內激活3 h。實驗結果顯示：在A組電場強度為60 V/mm、脈沖寬度為30 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，圓形精子細胞-卵母細胞對的平均融合率及平均卵裂率均顯著高于B組、C組兩組電融合參數(shù)作用下圓形精子細胞與無透明帶卵母細胞的融合率、卵裂率；A組的囊胚形成率顯著高于C組的囊胚形成率。研究發(fā)現(xiàn)將圓形精子細胞注射入激活的卵母細胞后融合胚胎的卵裂率為54%～64%，而其中只有2%～7%的胚胎發(fā)育至囊胚[13-14]。李子義等[15]研究表明，將圓形精子細胞注入經電激活處理的卵母細胞的透明帶下， 注射卵的融合率為34.6%，卵裂率為28.3%。通過比較可以得出，本實驗融合胚胎的囊胚形成率比圓形精子細胞注射入激活的卵母細胞的融合胚胎的囊胚形成率高。其原因可能是小鼠卵母細胞透明帶薄而且脆性較大，卵胞漿內注射圓形精子細胞后卵容易發(fā)生退化，而本研究采用HMC技術降低了對卵母細胞的損傷，大大提高了融合胚胎的卵裂率及囊胚形成率。Suo等[16]研究表明，小鼠2-細胞胚胎在0.8 kv/cm電場作用下胚胎的融合率及囊胚形成率較高；周川等[17]研究表明在電場強度為80 V/mm、脈沖寬度為80 μs、脈沖次數(shù)為2的電融合參數(shù)下，2-細胞胚胎的融合率(92.5%)及融合胚胎的卵裂率(97.3%)較高。而本實驗結果顯示A組(60 V/mm、30 μs×2)電融合參數(shù)下，圓形精子細胞與卵母細胞的融合率、融合胚胎的卵裂率以及囊胚形成率較高，這可能是由于不同的細胞間融合所需要的融合參數(shù)不同。另外本實驗采用WOW培養(yǎng)系統(tǒng)[10， 18]，可以為胚胎發(fā)育提供穩(wěn)定的微環(huán)境，從而得到較高的囊胚形成率。

因此，本實驗結果得出：采用WOW培養(yǎng)系統(tǒng)，在電場強度60 V/mm、脈沖寬度30 μs、脈沖次數(shù)為2的直流電融合參數(shù)下，更適合小鼠圓形精子細胞與卵母細胞融合胚胎的發(fā)育，有助于提高胚胎的發(fā)育潛能。本研究也為男性原發(fā)性無精子癥、非梗阻性無精子癥患者獲得自身后代提供了參考方法。

[1] Kimura Y， Yanagimachi R. Mouse oocytes injected with testicular spermatozoa or round spermatids can develop into normal offspring[J]. Development， 1995， 121：2397-2405.

[2] Haigo K， Yamauchi Y， Yazama F， et al. Full-term development of hamster embryos produced by injection of round spermatids into oocytes[J]. Biol Reprod， 2004， 71：194-198.

[3] Tesarik J， Mendoza C， Testart J. Viable embryos from injection of round spermatids into oocytes[J]. N EnglJ Med， 1995， 333：525-525.

[4] Selokar N， George A， Saha A. Production of interspecies handmade cloned embryos by nuclear transfer of cattle， goat and rat fibroblasts to buffalo (Bubalus bubalis) oocytes[J]. Anim Reprod Sci， 2011， 123：279-282.

[5] Tecirlioglu RT， French AJ， Lewis IM， et al. Birth of a cloned calf derived from a vitrified hand-made cloned embryo[J]. Reprod Fertil Dev， 2003， 15：361-366.

[6] Lagutina I， Lazzari G， Duchi R， et al. Somatic cell nuclear transfer in horses： effect of oocyte morphology， embryo reconstruction method and donor cell type[J]. Reproduction， 2005， 130：559-567.

[7] Du Y， Kragh PM， Zhang Y， et al. Piglets born from handmade cloning， an innovative cloning method without micromanipulation[J].Theriegenol， 2007， 68：1104-1110.

[8] Zhu J， Telfer EE， Fletcher J， et al. Improvement of an electrical activation protocol for porcine oocytes[J]. Biol Reprod， 2002， 66：635-641.

[9] Ogura A， Yanagimachi R. Round spermatid nuclei injected into hamster oocytes form pronuclei and participate in syngamy[J]. Biol Reprod， 1993， 48： 219-225.

[10] Booth PJ， Tan S， Reipurth R， et al. Simplification of bovine somatic cell nuclear transfer by application of a zona-free manipulation technique[J]. Cloning Stem Cells， 2001， 3：139-150.

[11] George A， Shah R， Sharma R， et al. Activation of zona-free Buffalo (Bubalus bubalis) oocytes by chemical or electrical stimulation， and subsequent parthenogenetic embryo development[J]. Reprod Domest Anim， 2011， 46：444-447.

[12] Hajian M， Kiani M， Hosseini MS， et al. Specific activation requirements of zona-free sheep oocytes before and after somatic cell nuclear transfer[J]. Cell Reprogram， 2013， 15：247-257.

[13] Ock SA， Kwack DO， Lee SL， et al. In vitro development of bovine oocytes reconstructed with round spermatids[J].Theriegenol， 2006， 65：1242-1253.

[14] Goto K， Kinoshita A， Nakanishi Y， et al. Blastocyst formation following intracytoplasmic injection of in-vitro derived spermatids into bovine oocytes[J]. Hum Reprod， 1996， 11：824-829.

[15] 李子義， 譚景和. 小鼠精子和球形精子細胞顯微注射受精研究[J]. 解剖學報， 1999， 30：147-151.

[16] Suo L， Wang F， Zhou GB， et al. Optimal concentration of calcium and electric field levels improve tetraploid embryo production by electrofusion in mice[J]. J Reprod Dev， 2009， 55：383-385.

[17] 周川，趙云程. 不同電融合參數(shù)及融合液對昆明小鼠2-細胞胚胎融合及囊胚率的影響[J]. 動物醫(yī)學進展， 2012， 33：56-59.

[18] Vajta G， Peura T， Holm P， et al. New method for culture of zona-included or zona-free embryos： The Well of the Well (WOW) system[J]. Mol Reprod Dev， 2000， 55：256-264.

[編輯：辛玲]

Effects of different electrocution parameters on development of embryos fused by round spermatids and oocytes

YANG Ai-jun1#，YU Chun-na2#，NIU Huan-fu2， WANG Xue-nan2， LIU Shu-zhen3， WEI Ze-feng2，HAO Cui-fang1*

1.QingdaoUniversity，Qingdao266071 2.CenterofReproductiveMedicine，TheAffiliatedHospitalofJiningMedicalUniversity，Jining272029 3.CollegeofLifeScience，ShandongNormalUniversity，Jinan250014

Objective： To explore the effects of different electrofusion parameters on the developmental potential of embryos which were fused by round spermatids and zona-free oocytes with handmade cloning (HMC).Methods： A total of 549 oocytes and round spermatids were fused by handmade cloning. The electric fusion parameters were divided into three groups according to the different electrofusion parameters. The electric field intensity was 60， 80 and 100V/mm in group A (n=186)， group B (n=188)and group C(n=175)respectively. The pulse width was 30， 20， 10 μs of pulse width in group A， B， C respectively， and all number of direct current (DC) was 2. The electric fusion rates， cleavage rate and blastocyst formation rate of embryos fused by round spermatids and zona-free oocytes of mouse under the different electrofusion parameters were measured and recorded.Results： The results showed that the fusion rate of group A [(84.87±3.84)%]was significantly higher than that of the other two groups [(74.93±5.46)%， (73.60±5.48)%， respectively] (P<0.05). The cleavage rate of group A [(77.37±3.97%] was significantly higher than that of group B or group C [(67.74±7.32)%， (66.17±9.87)%， respectively] (P<0.05). The blastocyst rate of group A [(41.28±6.50)%] was significantly higher than that of group C [(31.03±6.09) %] (P<0.05).Conclusions： The best electrofusion parameters are 60 v/mm and 30 μs×2. It is beneficial to improve the developmental potential of embryo.

Electrofusion parameter； Round spermatids； Zona-free oocytes

10.3969/j.issn.1004-3845.2017.01.010

2016-07-01；

2016-09-13

濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院苗圃計劃項目(JYFY-MP-2013-MS-013)；濟寧醫(yī)學院科研計劃項目(JY2013KJ016)；濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院苗圃計劃項目(MP-2014-003)；濟寧市科技局(2013jnwk132)

楊愛軍，女，山東濟寧人，博士研究生，主任醫(yī)師，生殖醫(yī)學專業(yè)；于春娜，女，山東煙臺人，碩士，初級技師，生殖醫(yī)學專業(yè).(#并列第一作者；*