復合微生物固態發酵整粒菜籽的研究

劉倚帆， 王星凌， 岳壽松，錢 鑫， 萬發春*， 趙紅波， 劉曉牧

（1.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南250100；2.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東濟南250100；3.山東省農業科學院生物技術研究中心，山東濟南250100；4.山東農業大學動物科技學院，山東泰安271018）

資源開發利用

復合微生物固態發酵整粒菜籽的研究

劉倚帆1，2， 王星凌1，2， 岳壽松3，錢 鑫1，4， 萬發春1，2*， 趙紅波1，2， 劉曉牧1，2

（1.山東省畜禽疫病防治與繁育重點實驗室，山東濟南250100；2.山東省農業科學院畜牧獸醫研究所，山東濟南250100；3.山東省農業科學院生物技術研究中心，山東濟南250100；4.山東農業大學動物科技學院，山東泰安271018）

為研究復合微生物固態發酵對整粒菜籽霉變、營養成分、氨基酸組成等的影響，利用米曲霉和酵母菌對整粒菜籽進行固態有氧發酵，利用乳酸菌和酵母菌進行厭氧發酵，然后在發酵第7、14、21、28天測定發酵產物霉變比例、pH值、常規營養成分以及氨基酸組成。結果表明：米曲霉和酵母菌固態有氧發酵菜籽在發酵期間霉變比例顯著降低。發酵第7天，發酵組粗蛋白質、粗脂肪、鈣含量比對照組分別提高了7.89%、3.76%、20.45%，且比發酵前提高了6.59%、6.34%、15.22%，能量也比發酵前提高了19.82%，必需氨基酸及總氨基酸含量比對照組分別提高了12.89%、7.72%，比發酵前分別提高了13.80%、9.28%。乳酸菌和酵母菌復合固態厭氧發酵菜籽在發酵期間有效降低霉變比例和pH值，發酵組干物質、粗蛋白質、粗脂肪比發酵前提高了1.86%、8.69%、10.96%。酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維比對照組分別降低了4.59%、6.99%，發酵組必需氨基酸及總氨基酸含量比對照組分別提高了11.68%、8.72%，且比發酵前提高了12.58%、10.13%。由此可知，米曲霉和酵母菌復合固態有氧發酵整粒菜籽及乳酸菌和酵母菌復合固態厭氧發酵整粒菜籽隨著發酵時間的延長均能通過降低霉變比例，提高粗蛋白質、粗脂肪等營養成分含量，提高必需氨基酸及總氨基酸含量，達到保存飼料及改善飼料品質的目的。

米曲霉；酵母菌；乳酸菌；菜籽；發酵

菜籽含油率高達35%～45%，蛋白質含量高達36%～38%，其營養價值與豆粕相近，是良好的精飼料，被廣泛應用于養殖業 （李建凡等，1995）。張杰杰（2014、2013）研究表明，飼糧中添加不同水平的油菜籽對牛瘤胃發酵參數無顯著影響，但添加17.6%的油菜籽能顯著提高肉牛生產性能和肉品質。由于菜籽自身含有有毒有害物質如硫代葡萄糖苷，以及纖維素、低聚糖等抗營養因子，且蛋白質品質較差，蛋氨酸等必需氨基酸含量低且不平衡等限制了其在飼料中的應用。而目前通過微生物發酵方法脫毒及提高飼用品質的報道多數針對菜籽粕，而對整粒菜籽發酵鮮見報道。因此，本試驗旨在研究整粒菜籽經微生物有氧或厭氧發酵后營養成分、pH、氨基酸含量的變化，觀察和評估菜籽的發酵效果和營養價值，從而為菜籽在反芻動物飼料中的應用提供有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 整粒菜籽：市售。米曲霉（含5億孢子粉）、馬克思克魯維酵母菌以及乳酸菌（嗜酸乳酸菌和糞腸球桿菌按1∶1混合）均由某實驗室提供。

1.2 試驗設計 菜籽有氧發酵采用固態發酵的方式，米曲霉和酵母菌分別以0.8%和0.2%的接種量接種于7 kg菜籽中，水分含量為30%，發酵溫度為30℃；菜籽厭氧發酵采用固態發酵的方式，乳酸菌和酵母菌分別以0.8%和0.2%的接種量接種于7 kg菜籽中，水分含量為30%，厭氧發酵溫度為35℃，在第7、14、21、28天取樣，一份65℃烘干測定初水分，用于常規飼料成分檢測；一份-20℃保存用于鮮樣測定。具體試驗設計見表1。

表1 菜籽發酵試驗設計

1.3 試驗方法

1.3.1 菜籽形態、氣味及霉變比例測定 每次取樣前先觀察記錄菜籽的形態及揮發出的氣味，并測定霉變比例。

1.3.2 pH測定 在規定取樣時間，選取對照組和發酵組樣品各10 g，加蒸餾水90mL，于搖床上100 r/min振蕩30min，使用pH計測定其pH。

1.3.3 常規營養成分測定

干物質 （DM）：采用失重法測定；粗蛋白質（CP）：采用凱氏定氮法測定；粗脂肪（EE）：采用殘余法測定；有機物（OM）：灰化法測定；能量（GE）：采用氧彈熱量計法測定；Ca、P：原子吸收光譜法測定；酸性洗滌纖維 （ADF）：采用NY/T 1459-2007測定；中性洗滌纖維 （NDF）：采用GB/T 20806-2006測定。

1.3.4 氨基酸組成的測定 參考GB/T 18246-2000，采用氨基酸自動分析儀測定。

2 試驗結果

2.1 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽霉變比例、pH、營養成分、氨基酸組成的影響

2.1.1 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽霉變比例的影響 由表2可知，與對照組相比，米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵能有效降低整粒菜籽在發酵過程中的霉變產生。

表2 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽霉變比例的影響%

2.1.2 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽pH的影響 由表3可知，發酵組pH呈現先降低后升高的趨勢，而對照組pH則持續下降。發酵第21天開始，發酵組pH顯著高于對照組，與發酵前相比，差異不顯著。

表3 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽pH的影響

2.1.3 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽營養成分的影響 由表4可知，米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵整粒菜籽第7天，粗蛋白質、粗脂肪、鈣含量比對照組分別提高了7.89%、3.76%、20.45%，且比發酵前提高了 6.59%、6.34%、15.22%，能量也比發酵前提高了19.82%。隨著發酵時間的延長，粗蛋白質、鈣、磷含量升高，干物質、粗脂肪、ADF和NDF含量先升高后降低。

2.2.4 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽氨基酸組成的影響 由表5可知，米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵整粒菜籽第7天，發酵組必需氨基酸及總氨基酸含量比對照組分別提高了12.89%、7.72%，比發酵前分別提高了13.80%、9.28%。其中，蛋氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸分別提高了59.38%、16%、11.66%、20.43%。但隨著發酵時間的延長，必需氨基酸及總氨基酸含量逐漸降低。

表4 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽營養成分的影響

表5 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽氨基酸組成的影響 g/100 g

2.2 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽霉變比例、pH、營養成分、氨基酸組成的影響

2.2.1 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽霉變比例的影響 由表6可知，與對照組相比，乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵能有效降低整粒菜籽在發酵過程中的霉變產生。

2.2.2 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽pH的影響 由表7可知，隨著發酵時間的延長，對照組和發酵組的pH明顯下降，對照組在發酵第7天變化迅速，pH值從6.97降到5.87，而發酵組下降緩慢，但在發酵14 d后，發酵組pH下降迅速，到發酵28 d，pH降到4.83。

2.2.3 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽營養成分的影響 由表8可知，乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵整粒菜籽第14天，營養成分如干物質、粗蛋白質、粗脂肪比對照組略有提高，但比發酵前提高了1.86%、8.69%、10.96%。ADF 和NDF比對照組分別降低了4.59%、6.99%。隨著發酵時間的延長，干物質、粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分、鈣、磷含量逐漸降低。

表7 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽pH的影響

2.3.4 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽氨基酸組成的影響 由表9可知，乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵整粒菜籽第14天，發酵組必需氨基酸及總氨基酸含量比對照組分別提高了11.68%、8.72%，且比發酵前提高了12.58%、10.13%。其中，蛋氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸含量比對照組分別提高了 40%、11.7%、15.32%、10.12%、16.84%，且比發酵前分別提高了36.11%、6.06%、14.4%、13.5%、19.35%。但隨著發酵時間的延長，必需氨基酸及總氨基酸含量逐漸降低。

表8 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽營養成分的影響

表9 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽氨基酸組成的影響 g/100 g

3 討論

3.1 米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵對整粒菜籽霉變比例、pH、營養成分、氨基酸組成的影響本試驗采取復合菌種發酵模式，分別利用米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵及乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵方式對整粒菜籽進行發酵。菌種是微生物發酵取得良好效果的關鍵，原料經發酵后氣味芳香、適口性好，并且發酵過程中可產生多種水解酶，富含B族維生素等。黑曲霉、米曲霉、根霉、木霉等霉菌可以分泌豐富的酶類，如淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶、果膠酶等，這些酶能夠促進原料中的淀粉、纖維素等高分子化合物分解為單糖，供微生物生長需要；且菌體中蛋白質含量也較高，達到20%～30%，因此，在蛋白質飼料的生產中這些種類霉菌得到廣泛應用。pH是發酵工藝中的一個重要因素，不同的微生物都有一個適宜其生長和發揮活性功能的最適pH范圍。一般情況下，真菌生長的pH范圍為3.5～6.0，酵母菌為4.5～7.0（吳偉偉，2009）。本試驗在發酵第一周（7 d內），對照組和發酵組pH均在正常范圍內，而到發酵第28天，發酵組pH值為7.49，高于米曲霉和酵母菌最適生長pH范圍，這也可能是導致發酵后期霉菌大量繁殖的原因。

固態發酵改善發酵底物營養價值，降低抗營養因子含量，主要是由于微生物產生功能性酶的作用。付敏等（2013）研究發現，隨著發酵時間的延長，有效氮、小肽和游離氨基酸含量都呈線性增加，而硫苷和纖維類物質呈線性降低。到發酵后期，小肽和游離氨基酸含量變化趨于穩定，菌落進入衰亡期，次級代謝產物分泌增加，培養基溫度升高，蛋白酶產量降低導致小肽和游離氨基酸含量增加速度變慢。一般來說，霉菌的最佳培養時間較細菌長，達到產酶高峰期的時間也較長。胡永娜等（2012）選用枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌、啤酒酵母、畢赤酵母及黑曲霉對菜籽粕進行單菌或復合菌株發酵，結果表明，復合菌株發酵效果明顯優于單菌株發酵，以枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌和啤酒酵母三種菌種組合發酵效果最好，粗蛋白質含量增加5.37%，并有效降低硫苷、單寧等抗營養因子的含量。本試驗中，米曲霉、酵母菌混合固態有氧發酵整粒菜籽第7天，營養成分如粗蛋白質、粗脂肪、鈣、磷含量均高于對照組，且高于發酵前菜籽。隨著發酵時間的延長，粗蛋白質、鈣、磷含量逐漸升高，但干物質、粗脂肪、ADF和NDF含量逐漸降低。在發酵第7天，發酵組必需氨基酸及總氨基酸含量達到最高值，不僅高于對照組氨基酸含量，且高于發酵前菜籽氨基酸含量。但隨著發酵時間的延長，必需氨基酸及總氨基酸含量逐漸降低。表明發酵后菜籽的蛋白質品質得到顯著提高，發酵后氨基酸含量發生變化，主要與微生物復雜的分解合成代謝過程有關，由于發酵后微生物菌體蛋白中蛋氨酸含量較高，所以使發酵后棉籽的蛋氨酸含量也提高了近60%，但具體機理還需要進一步研究。

3.2 乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵對整粒菜籽霉變比例、pH、營養成分、氨基酸組成的影響在對菜籽進行有氧發酵的同時，利用乳酸菌對其進行了厭氧發酵研究，以探討利于整粒菜籽發酵的最佳模式。植物蛋白質的結構大都十分緊密，分子質量較大，不易消化吸收，吸收率往往低于動物蛋白質。乳酸菌在發酵過程中，需要利用底物中的營養物質來滿足其能量需要和生長繁殖，底物中碳水化合物是乳酸菌生長繁殖所需能量的主要供應者，同時也為微生物蛋白質、脂肪和核酸等大分子物質的合成提供碳源。與此同時，在乳酸菌發酵過程中產生的酶類能降解底物中纖維素、半纖維素、淀粉和果膠等大分子物質（孫宏，2009）。因此，植物蛋白原料經微生物發酵后，其蛋白質絕對含量不變或略有下降，但由于碳水化合物的降解導致粗蛋白質相對含量上升。

乳酸菌在發酵過程中會產生乳酸、乙酸、丙酸和細菌素等多種物質，這些物質除具有抑菌作用外，還對維持腸道內微生物平衡、抑制病原菌生長、調節胃腸道功能等具有一定的作用。同時，飼料經乳酸菌發酵后，有特殊的酸甜芳香氣味，pH下降，能有效改善飼料的適口性。魏炳棟等（2014）利用乳酸菌和酸性蛋白酶為發酵劑，對豆粕、棉籽粕和菜籽粕進行固態厭氧發酵，結果表明，能有效提高粗蛋白質含量，降低pH，并能有效降解棉籽粕和菜籽粕中的抗營養因子，改善飼料品質。孫林等（2009）利用植物乳酸菌、枯草芽孢桿菌、蠟樣芽胞桿菌、酪酸梭狀芽孢桿菌對菜籽粕進行單菌和混菌固態發酵，結果表明，混菌發酵效果優于單菌發酵，發酵48 h后粗蛋白質含量提高4.37%。王剛等（2011）利用酵母菌、枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌對菜籽粕進行固態發酵，使粗蛋白質含量從39.99%提高到45.85%，氨基酸的組成和含量也有一定的變化和提高。本試驗利用乳酸菌、酵母菌混合固態厭氧發酵整粒菜籽，在發酵第14天，營養成分如干物質、粗蛋白質、粗脂肪、鈣、磷和能量高于發酵前，ADF和NDF低于發酵前菜籽。發酵組必需氨基酸及總氨基酸含量高于對照組，且高于發酵前棉籽氨基酸含量。但隨著發酵時間的延長，干物質、粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分、鈣、磷含量逐漸降低，必需氨基酸及總氨基酸含量也逐漸降低。

近年來，越來越多的研究報道了益生菌菌體或其代謝產物可以降解黃曲霉毒素。Nagendra等（1999）研究表明，乳酸菌對黃曲霉毒素B1的去除能力在20%～50%，主要是通過吸附黃曲霉毒素來發揮作用。王濤（2010）在對發酵豆制品中黃曲霉毒素控制的研究中，通過利用植物乳桿菌與米曲霉互補和協同作用，有效控制了由于雜菌污染而產生的黃曲霉毒素。本試驗中，不論是對照組還是發酵組均未檢測出黃曲霉毒素B1，這可能與菜籽本身的結構與特征有關，乳酸菌對控制黃曲霉毒素的產生還需要進一步的研究。

4 結論

4.1 米曲霉和酵母菌復合固態有氧發酵整粒菜籽，以及乳酸菌和酵母菌復合固態厭氧發酵整粒菜籽，能夠提高植物性蛋白質飼料中粗蛋白質、粗脂肪、粗灰分、鈣等營養物質的含量，并提高必需氨基酸及總氨基酸含量，從而改善飼料品質，提高營養價值。

4.2 米曲霉和酵母菌復合固態有氧發酵整粒菜籽，以及乳酸菌和酵母菌復合固態厭氧發酵整粒菜籽，能有效降低發酵過程中植物性蛋白質飼料的霉變比例，延長飼料保存期限。

4.3 米曲霉和酵母菌復合固態有氧發酵整粒菜籽的最佳時間為7 d，接種量為1%，含水量30%，發酵溫度30℃；乳酸菌和酵母菌復合固態厭氧發酵整粒菜籽的最佳時間為14 d，接種量為1%，含水量30%，發酵溫度35℃。

[1]付敏，何軍，余冰，等.混菌固態發酵對菜籽餅營養價值及抗營養因子含量的影響[J].動物營養學報.2013，25（7）：1579～1586.

[2]胡永娜，李愛科，王之盛，等.微生物固態發酵中菜籽粕營養特性的研究[J].中國糧油科學.2012，27（3）：76～80.

[3]李建凡，高振川，姜云俠，等.中國菜籽餅的營養成分和抗營養因子[J]. 1995，26（3）：193～199.

[4]孫宏.微生物發酵法對菜粕脫毒及蛋白品質改良的研究：[碩士學位論文][D].湖北武漢：華中農業大學.2009：7～8.

[5]孫林，李呂木，張邦輝，等.多種固態發酵菜籽粕的研究[J].中國糧油學報. 2009，24（1）：85～89.

[6]王剛，蔡國林，陸健.微生物發酵改善菜籽粕品質的研究[J].中國油脂，2011，36（7）：24～28.

[7]王濤.發酵豆制品中黃曲霉毒素的控制：[碩士學位論文][D].四川成都：西華大學.2010：42～43.

[8]吳偉偉.復合微生物固態發酵棉籽餅粕的研究：[碩士學位論文][D].江蘇無錫：江南大學.2009：31～32.

[9]魏炳棟，黨修利，邱玉朗，等.乳酸菌固態發酵酶解對豆粕、棉籽粕和菜籽粕粗蛋白質、pH、酸度及抗營養因子含量的影響 [J].中國畜牧獸醫，2014，41（11）：107～114.

[10]張杰杰，萬發春，宋恩亮，等.精飼料油菜籽水平對肉牛生產性能及肉品質的影響[J].動物營養學報，2013，25（3）：527～533.

[11]張杰杰，趙紅波，游偉，等.飼糧油菜籽添加水平對肉牛生長性能、瘤胃發酵及血液生化指標的影響[J].中國農業科學，2014，47（11）：2233～3341.

[12]Nagendra S，Wu X R.Aflatoxin B1 binding abilitiesof probiotic bacteria [J].Bioscience M icroflora，1999，18（1）：43～48.

This experiment was conducted to investigate the effect of solid-state aerobic and anaerobic fermentation of whole rapeseed with Aspergillus oryzae，Kluyveromyces marxianus and lactobacillus on mouldy proportion，pH，nutrients，amino acid concentration.The results showed that using solid-state aerobic fermentation with Aspergillus oryzae and Kluyveromyces marxianus，the mouldy proportion of whole rapeseed was decreased during whole course，crude protein （CP），ether extract（EE），calcium，essential amino acid and total amino acid were increased and acid detergent fiber （ADF）and neutral detergent fiber（NDF）were decreased at 7 d，compared with the control group.Ussing solid-state aerobic fermentation with Lactobacillus and Kluyveromycesmarxianus，themouldy proportion and pH of whole rapeseed were decreased during whole course，CP，EE，calcium，essential amino acid and total amino acid were increased，while ADF and NDF decreased at 14 d，compared with control group.The results indicated that the feeding velue of whole rapeseed were greatly improved after fermentation.

Aspergillus oryzae；Saccharomycete；Lactobacillus；rapeseed；fermentation

S816.6

A

1004-3314（2017）01-0036-05

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20170108

現代農業（肉牛牦牛）產業技術體系建設專項資金 （CARS-38）；“十二五” 國家科技支撐計劃（2012BAD39B05-02）；山東省現代農業產業技術體系創新團隊建設項目（SDAIT-09-07）

*通訊作者