番茄醬中單氰胺檢測衍生化條件的研究

趙華鋒，王瑞蓮，周嘉明，孫晶

(1.青島市華測檢測技術有限公司，山東 青島 266101；2.德國海德堡大學 經濟系，德國 海德堡 999035)

番茄醬中單氰胺檢測衍生化條件的研究

趙華鋒1，王瑞蓮1，周嘉明1，孫晶2

(1.青島市華測檢測技術有限公司，山東 青島 266101；2.德國海德堡大學 經濟系，德國 海德堡 999035)

建立了柱前衍生化高效液相色譜串聯質譜法檢測番茄醬中單氰胺的最佳衍生化條件；在衍生化試劑丹磺酰氯濃度為10 mg/mL，反應溫度為60 ℃，反應時間為1 h，緩沖體系的pH值為10.5時，衍生效果最佳，單氰胺最低檢測濃度為0.00005 mg/kg，衍生產物在48 h內穩定。

單氰胺；柱前衍生；丹磺酰氯；液相色譜串聯質譜

丹磺酰氯是檢測一、二級氨基酸的著名衍生化試劑，生成的氨基酸衍生物可用反相液相色譜法進行測定[1]。單氰胺分子量小、極性大，無法直接進行色譜分析，單氰胺結構中含有氨基，嘗試采用丹磺酰氯衍生化反應后進行液相色譜串聯質譜法測定。

目前單氰胺的檢測還沒有國家標準和行業標準，關于單氰胺殘留檢測方法的報道也很少[2]。本文以丹磺酰氯作為柱前衍生化試劑，液相色譜串聯質譜法作為檢測手段，對番茄醬中的單氰胺進行檢測。研究了丹磺酰氯作為柱前衍生試劑使用的條件：衍生試劑的濃度、衍生化反應的時間和溫度及緩沖體系的pH值對衍生化反應的影響，并得到了最佳的衍生化條件，同時考察了衍生產物的穩定性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

單氰胺標準品(98%) 上海安譜科學儀器有限公司；甲醇、丙酮、甲酸 均為色譜純；碳酸鈉、碳酸氫鈉、丹磺酰氯 均為優級純；超高效液相色譜-質譜/質譜聯用儀 Waters I-Class液相-XEVO TQ質譜；KQ-500DE型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CTK80離心機 湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 儀器條件

1.2.1 液相色譜條件

色譜柱：Waters UPLC BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；色譜柱溫度：40 ℃；流動相A：0.1%甲酸/水；流動相B：甲醇；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.2 質譜條件

電噴霧正離子(ESI+)；母離子：276.2；定量離子：156.2；定性離子：171.2；錐孔電壓：32 V；定量、定性離子的碰撞能量分別為30，20 eV。

1.3 標樣溶液的配制

精確稱取單氰胺標準品0.01 g(精確至0.00001 g)，用水溶解并定容至10 mL，制得1000 μg/mL標樣溶液，備用。使用前根據需要稀釋成不同濃度的標準工作液。

1.4 樣品預處理

稱取10.00 g混勻的番茄醬樣品于均質器鋼杯中，加入30 mL甲醇，均質2 min，10 mL甲醇分2次清洗均質棒，減壓抽濾，濾液轉移到100 mL的容量瓶中，并用甲醇定容到100 mL，混勻，從容量瓶中準確移取5～10 mL至具塞刻度試管中，加入碳酸鈉、碳酸氫鈉混合溶液和丹磺酰氯丙酮溶液，混勻后在恒溫水浴振蕩中反應，冷卻至室溫，用甲醇定容到10 mL，混合均勻后用0.22 μm的有機濾膜過濾，LC-MS/MS測試。

2 結果與分析

2.1 衍生化條件的確認

單氰胺和丹磺酰氯的反應方程式見圖1，這一反應中起決定作用的因素有4個，分別為緩沖體系的pH值、反應溫度、反應時間和丹磺酰氯濃度，考察這4個因素對衍生化反應的影響，確定出最佳的衍生化條件。

圖1 單氰胺和丹磺酰氯的反應方程式

2.1.1 反應體系pH值的確定

單氰胺和丹磺酰氯的反應要在堿性條件下進行，調節碳酸鈉、碳酸氫鈉緩沖溶液的pH值為8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0。分別進行衍生化反應的實驗，結果表明: pH值為10.5時，反應效果最好，于是確定緩沖溶液的pH值為10.5。

2.1.2 反應溫度和時間的確定

分別采用反應溫度為40，50，60，70 ℃進行衍生化反應，均取得了成功，但從節能省時方面考慮，故選擇60 ℃反應1 h，既快速又反應完全。

2.1.3 丹磺酰氯濃度的確定

測定了丹磺酰氯濃度在1～14 mg/mL 范圍內對番茄醬樣品中單氰胺衍生效果的影響，每組做3個平行，取3次測定結果的平均值。單氰胺衍生物的峰面積隨丹磺酰氯濃度變化的情況見圖2。

圖2 丹磺酰氯濃度與單氰胺衍生物生成量的關系

由圖2可知，丹磺酰氯濃度為10 mg/mL時，單氰胺的衍生基本完全；大于10 mg/mL時，單氰胺衍生物的生成量基本無變化，已趨于平衡，番茄醬中含有大量的氨基酸，會競爭和丹磺酰氯反應。因此，丹磺酰氯的濃度升高到一定程度時，才能保證單氰胺的反應正常進行，最終選擇丹磺酰氯的濃度為10 mg/mL。

2.2 液質條件的優化

衍生質量濃度為0.5 mg/L的單氰胺的標準溶液，衍生產物分子量為275，質譜通過針泵連續進樣，采用MS Scan方式進行掃描，調節錐孔電壓，得到較強的[M+H]峰母離子276.2，對選定的母離子進行子離子掃描，調節碰撞能量，得到豐度較好的2個子離子，分別為156.2和171.2，根據MRM的色譜峰形及靈敏度，確定156.2為定量離子，171.2為定性離子。采用最佳的衍生化條件進行衍生反應后單氰胺標準溶液和番茄醬樣品加標的色譜圖見圖3和圖4。

圖3 0.05 mg/L單氰胺的標準溶液色譜圖

圖4 番茄醬中單氰胺的色譜圖(添加濃度為0.05 mg/kg)

2.3 衍生產物的穩定性及最低檢測濃度

2.3.1 衍生產物的穩定性

采用最佳的衍生化條件衍生0.0002 mg/L的單氰胺標準溶液，衍生后1，12，24，36，48 h分別進行測定，測定結果表明48 h內穩定。

2.3.2 衍生產物的儀器最低檢測濃度

番茄醬中添加0.0002 mg/kg單氰胺的色譜圖信噪比(S/N)為12，按照S/N=3計算儀器的最低檢測濃度，則單氰胺在番茄醬中的最低檢測濃度為0.00005 mg/kg。

3 結論

本文成功建立了柱前衍生化高效液相色譜串聯質譜法檢測番茄醬中單氰胺的最佳衍生化條件：衍生化試劑丹磺酰氯濃度為10 mg/mL、反應溫度為60 ℃、反應時間為1 h、緩沖體系pH值為10.5時，衍生效果最佳，單氰胺最低檢測濃度為0.00005 mg/kg，衍生產物在48 h內穩定。

[1]Negro A, Garbisa S, Gotte L, et al. The use of reverse-phase high-performance liquid chromatography and pre-column derivatization with dansyl chloride for quantitation of specific amino acids in collagen and elastin[J]. Analytical Biochemistry,1987,160(1):39-46.

[2]張春濤,張玲,劉維娟,等.基質固相分散-高效液相色譜法檢測葡萄和土壤中的單氰胺[C].第十七屆全國色譜學術報告會論文集,2009:163-164.

Study on Derivatization Condition of Cyanamide Detection in Tomato Sauce

ZHAO Hua-feng1, WANG Rui-lian1, ZHOU Jia-ming1, SUN Jing2

(1.Center Testing International (Qingdao) Co., Ltd., Qingdao 266101, China;2.Department of Economics,University of Heidelberg,Heidelberg 999035, Germany)

To establish the optimal pre-column derivatization UPLC-MS/MS method for the detection of cyanamide in tomato sauce. The most suitable derivatization conditions are determined as follows: dansyl chloride concentration is 10 mg/mL, reaction temperature is 60 ℃, reaction time is 1 h, pH of buffer system is 10.5; the limit of quantification is 0.00005 mg/kg, the derivative products are stable within 48 hours.

cyanamide; pre-column derivatization; dansyl chloride; ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry

2016-07-15

趙華鋒(1981-)，男，山東臨沂人，工程師，碩士，研究方向：食品安全檢測。

TS207.4

A

10.3969/j.issn.1000-9973.2017.01.033

1000-9973(2017)01-0142-02