基于風味改善的食醋自吸式半連續釀造工藝優化

洪厚勝，趙 敏，駱海燕，竇冰然

基于風味改善的食醋自吸式半連續釀造工藝優化

洪厚勝1,2，趙 敏1，駱海燕1，竇冰然3

（1.南京工業大學生物與制藥工程學院，江蘇 南京 210009；2.南京匯科生物工程設備有限公司，江蘇 南京 210009；3.南京工業大學理學院，江蘇 南京 210009）

采用自吸式發酵罐液態深層半連續法發酵食醋，該方法生產效率高、生產周期短，但食醋風味不足。在傳統液態法食醋發酵工藝基礎上，通過篩選原料、添加糖化曲和多菌協同酒精發酵，可以提高食醋不揮發酸的含量，改善食醋風味。研究結果表明：以小麥為原料調漿液化完成后，加入6.5%（質量分數）增香糖化曲，35℃保溫糖化1 h，接種5%（體積分數）乳酸菌與0.28 g/100 mL酵母菌共同酒精發酵，控制溫度32℃發酵4 d，最后接種醋酸菌。將該工藝應用在搖瓶水平上液態法發酵食醋，得到的食醋中不揮發酸含量可達0.47 g/100 mL。將該工藝應用于5 L自吸罐液態半連續發酵得到的食醋成品，總酸度≥6 g/100 mL，不揮發酸含量≥0.5 g/100 mL，達到了國標對固態醋不揮發酸含量的要求。

自吸式；半連續發酵；食醋；風味

食醋是人們日常生活中必不可少的調味品，國內市場上食醋的生產主要分為傳統固態發酵工藝與液態深層法發酵工藝兩類[1-3]。傳統固態發酵的食醋風味獨特，酸味柔和，迎合了中國人的口感需求。傳統固態工藝有著勞動強度大、生產效率低、生產周期長的缺點[4-7]。液態深層發酵食醋工藝是借鑒抗生素、氨基酸等其他發酵工業的經驗，應用現代發酵工程等技術建立起來的一類先進的新型制醋生產技術，正好彌補了固態制醋工藝的不足，具有自動化程度高、產量穩定等優點。隨著人們生活水平的不斷提高和食醋保健功能的深入研究[8]，“少鹽多醋”已成為新型健康飲食的潮流，醋產業已經步入了發展的快車道[9-11]。因此，液態深層發酵法將更加適應制醋工業的科學化、機械化與大型化發展方向。但是，液態深層發酵法得到的食醋產品，無法滿足中國人對食醋風味的需求。如何改善液態法釀造醋的風味問題，已經成為液態法釀醋工藝推廣應用的關鍵因素。最直接影響食醋風味中的成分就是不揮發酸含量，不揮發酸含量高可以有效緩和液態醋的刺激性酸味，使食醋產品口感柔和，風味改善[12-20]。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與培養基

釀酒高活性干酵母 安琪酵母股份有限公司；醋酸菌實驗室保藏；乳酸菌（徳氏乳桿菌保加利亞亞種） 中國工業微生物保藏中心；α-淀粉酶（酶活≥40 000 U/g）、糖化酶（酶活≥100 000） 國藥集團化學試劑有限公司；增香糖化曲 武漢佳成生物制品有限公司；糧食原料、大曲、紅曲、麩曲 市售。

醋酸菌斜面培養基：葡萄糖1%、酵母膏1%、碳酸鈣1.5%、瓊脂2%，121 ℃滅菌20 min，降溫至60 ℃加入3.5%無水乙醇；醋酸菌活化培養基：葡萄糖1%、酵母膏1%，121 ℃滅菌20 min，降溫至60 ℃加入3.5%無水乙醇；乳酸菌斜面培養基：蛋白胨1%、牛肉浸膏1%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸二銨0.2%、吐溫80 0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、七水合硫酸鎂0.058%、七水合硫酸錳0.025%、瓊脂2%、碳酸鈣1%，121 ℃滅菌20 min；乳酸菌活化培養基：蛋白胨1%、牛肉浸膏1%、酵母提取物0.5%、葡萄糖2%、乙酸鈉0.5%、檸檬酸二銨0.2%、吐溫80 0.1%、磷酸氫二鉀0.2%、七水合硫酸鎂0.058%、七水合硫酸錳0.025%， 121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

BSA124電子天平 賽多利斯科學儀器有限公司；PHS-3C pH計 上海精密科學儀器有限公司；UVmini-1240紫外分光光度計 日本島津有限公司；YSQ-LS-50S11立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司醫療設備廠；HH-2恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏華儀器廠；SW-CJ-1D超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；15L自吸式發酵罐 南京匯科生物工程設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

1.3.1.1 釀酒高活性干酵母

稱取所需量的活性干酵母，加入2%蔗糖水，在35～40 ℃條件下處理15～20 min，將溫度降至34 ℃繼續活化1～2 h，活化過程中有大量氣泡產生，需攪拌消泡。1.3.1.2 醋酸菌

配制醋酸菌活化培養基，以裝液量10%分裝于若干三角瓶中，滅菌降溫至30 ℃，每10 mL活化培養基從醋酸菌斜面上挑取2 環進行接種，30 ℃、200 r/min條件下搖床振蕩培養30 h，得到醋酸菌種子液。

1.3.1.3 乳酸菌

配制乳酸菌活化培養基，以30%裝液量裝入三角瓶，滅菌后降溫至35 ℃，每10 mL活化培養基從乳酸菌斜面上挑取2 環進行乳酸菌接種，37 ℃條件下密封、靜置擴培48 h，得到乳酸菌種液。

1.3.2 分析檢測指標測定

葡萄糖值：參照GB/T 5009.7—2008《食品中還原糖的測定》；光密度：紫外分光光度法；還原糖含量（以葡萄糖計）：快速費林法；殘糖檢測：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法；酒精含量：蒸餾法；總酸含量（以醋酸計）：氫氧化鈉滴定法；pH值檢測：酸度計法；不揮發酸含量：單沸式蒸餾法；總菌群計數：參照GB 47892—2010《食品微生物學檢驗 菌落總數測定》。

1.3.3 釀造工藝

1.3.3.1 工藝流程

本實驗釀造小麥醋的工藝流程如下[18,21]：

1.3.3.2 操作要點

1）調漿液化

稱取所需量原料，以原料質量分數22%加適量水配制成原料醪液，向醪液中加入12～14 U/g干物料的α-高溫淀粉酶，控制溫度90～95 ℃至液化完全后煮沸降溫待用[22]。

2）醪液糖化及酒精發酵

待醪液液化完全后，降溫至35～45 ℃，加入適量曲保溫1～2 h后降溫，向糖化醪液中接種活化好的酒精發酵階段菌種，30 ℃進行酒精發酵。每隔12 h檢測發酵液的糖度、酒精度，當酒精度不再上升則發酵完成。將發酵完全的酒醪靜置沉降數天，取上層較清醪液備用。

3）醋酸發酵

采用深層液態半連續發酵，發酵罐空罐滅菌后加入適量乙酸作為發酵初始底酸，向罐中加入酒醪，一般控制初始酒精度不超過4%，初始酸度不超過4 g/100 mL，開啟自動控溫，并開始通氣。當罐內溫度穩定在30 ℃左右，接入酒醪體積分數10%的醋酸菌種子液，測定發酵液的酒精度和酸度；在發酵周期的末期，當酒精度值達到卸料點0.5%時，放出部分醋酸發酵液；同時，向罐中補充相同體積的酒醪，下一周期隨即開始。每隔4 h檢測發酵液的酸度、酒精度[23-27]。

1.3.4 工藝優化設計

為改進液態法釀造食醋的風味，研究不同原料進行制醋、原料糖化階段采用多種糖化曲替代糖化酶進行糖化、酒精發酵階段通過添加乳酸菌與酵母菌共酵這3 種主要措施對食醋風味的影響。根據這3 種措施的單因素試驗結果，確定制醋工藝參數的適宜范圍，在L9（34）水平設計正交試驗，試驗設計的各因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table1 Coded levels and corresponding actual levels for independent variables used in orthogonal array design

根據發酵過程中的單因素試驗結果及相關文獻[28-30]，選取糖化曲添加量（A）、酵母菌接種量（B）、發酵溫度（C）作為響應面法考察因素，以1、0、－1代表其高、中、低水平，以酒精發酵后的酒精度（%）為響應值，設計三因素三水平17個試驗點的響應面分析試驗（表2）。

表2 Box-Behnken試驗因素與水平Table2 Coded levels and corresponding actual levels for independent variables used in Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 液態法釀醋風味改良單因素試驗結果

2.1.1 原料種類對食醋風味的影響

以原料質量分數22%加各種原料和水調漿，加入16 U/g高溫淀粉酶90 ℃液化100 min，降溫加入3%（質量分數）增香糖化曲，35 ℃保溫糖化1 h，活化0.35 g/100 mL酵母菌并接種，30 ℃酒精發酵4 d，在三角瓶中分別加入等量的各種糧食酒醪、乙酸和水，控溫30 ℃，接種10%（體積分數）的醋酸菌種，220 r/min搖瓶至酸度不再上升，醋酸發酵結束，各種原料產酸量（總酸度減去乙酸含量）與不揮發酸含量見圖1，可以看出，以玉米和小麥為原料的液態醋風味較好，其中小麥最優；糯米和高粱為原料的液態醋不揮發酸含量差別不大，但糯米為原料的液態醋產酸量優于高粱。

圖1 原料種類對食醋風味的影響Fig. 1 Influence of different raw materials on the flavor of vinegar

2.1.2 糖化曲種類對食醋風味的影響

圖2 糖化曲種類對食醋風味的影響Fig. 2 Influence of different saccharification agents on the flavor of vinegar

以小麥為原料，按原料質量分數22%加水調漿，加入16 U/g高溫淀粉酶90 ℃液化100 min，降溫加入適量各種曲，35 ℃保溫糖化1 h，活化0.35 g/100 mL酵母菌并接種，30 ℃酒精發酵4 d，在三角瓶中分別加入等量的各種曲糖化發酵后酒醪、乙酸和水，控溫30 ℃，接入10%的醋酸菌種，220 r/min搖瓶至酸度不再上升，醋酸發酵結束。從圖2可以看出，增香糖化曲替代糖化酶糖化后經發酵出的液態醋不揮發酸含量最高，紅曲和麥曲替代糖化酶糖化后經發酵出的液態醋的不揮發酸含量與產酸量綜合都優于麩曲。

2.1.3 乳酸菌添加量對食醋風味的影響

以小麥為原料，按原料質量分數22%加水調漿，加入16 U/g高溫淀粉酶，90 ℃液化100 min，降溫加入3%的增香糖化曲，35 ℃保溫糖化1 h，活化0.35 g/100 mL酵母菌并接種，同時分別接種不同體積分數的乳酸菌共酵，30 ℃酒精發酵4 d，在三角瓶中分別加入等量酒精發酵后酒醪、乙酸和水，控溫30 ℃，接種10%的醋酸菌種，220 r/min搖瓶至酸度不再上升，醋酸發酵結束。從圖3可以看出，不揮發酸含量隨著乳酸菌添加量不斷上升后趨于穩定，產酸量隨著乳酸菌的添加呈下降趨勢，綜合發酵效率與風味效果，乳酸菌添加量控制在3%～5%之間。

圖3 乳酸菌添加量對食醋風味的影響Fig. 3 Influence of Lactobacillus inoculum size on the flavor of vinegar

2.2 液態法釀醋風味改良正交試驗結果

對影響液態法釀造食醋風味改良的原料種類、糖化曲種類、乳酸菌添加量這3 個因素在L9（34）水平正交試驗，并確定最佳組合，正交試驗結果見表3。

表3 正交試驗設計及結果Table3 Orthogonal array design with experimental results

由表2中極差值可以得出，在整個液態法醋酸發酵過程中，影響食醋風味較大的是原料種類，糖化曲種類與乳酸菌添加量對酒精發酵的過程影響相差不大。由各因素均值的大小得出，因素優水平組合為A3B1C3，即液態法食醋風味改良工藝的最優化條件為：以小麥為原料、糖化過程用增香糖化曲替代糖化酶、酒精發酵過程加入5%乳酸菌與酵母菌共酵，最終可以使食醋成品的不揮發酸含量達到0.50 g/100 mL。經3 次驗證實驗發現，醋品中平均不揮發酸含量達0.47 g/100 mL，與以大米為原料經雙酶液態法發酵所得的醋品提高了3 倍，風味改良效果明顯。2.3 液態醋風味改良工藝確定后酒精發酵階段單因素試驗結果

2.3.1 糖化保溫時間對酒精發酵的影響

以小麥為原料，按原料質量分數22%加水調漿，加入16 U/g高溫淀粉酶，90℃液化100 min，降溫加入3%的增香糖化曲，分別于35℃條件下保溫糖化30、60、90、120、150 min，活化0.35 g/100 mL酵母菌并接種，同時接種5%的乳酸菌共酵，30 ℃酒精發酵4 d。從圖4可以看出，糖化保溫時間對酒精度的影響較小，將不會作為響應面優化設計因素。

圖4 糖化保溫時間對酒精發酵的影響Fig. 4 Influence of saccharification time on alcohol fermentation

2.3.2 糖化曲添加量對酒精發酵的影響

以小麥為原料，按原料質量分數22%加水調漿，加入16 U/g高溫淀粉酶，90 ℃液化100 min，降溫后分別加入2%、4%、6%、8%、10%的增香糖化曲，35 ℃條件下保溫糖化120 min，活化0.35 g/100 mL酵母菌并接種，同時接種5%的乳酸菌共酵，30 ℃酒精發酵4 d。從圖5可知，糖化曲添加量對酒精發酵有一定影響，隨著糖化曲添加量的增加，酒精度不斷上升并趨于平緩，較優的糖化曲添加量為6%。

2.3.3 發酵溫度對酒精發酵的影響

圖6 發酵溫度對酒精發酵的影響Fig. 6 Influence of temperature on alcohol fermentation

以小麥為原料，按原料質量分數22%加水調漿，加入16 U/g高溫淀粉酶，90 ℃液化100 min，降溫后分別加入3%的增香糖化曲，35 ℃條件下保溫糖化120 min，活化0.35 g/100 mL酵母菌并接種，同時接種5%的乳酸菌共酵，分別在30、32、34、36、38℃酒精發酵4 d。從圖6可知，在一定范圍內，隨著發酵溫度上升酒精度增大，但發酵溫度過高也會使酒精度下降，較優的發酵溫度為32 ℃。

2.3.4 酵母菌接種量對酒精發酵的影響

圖7 酵母菌接種量對酒精發酵的影響Fig. 7 Influence of yeast inoculum size on alcohol fermentation

以小麥為原料，按原料質量分數22%加水調漿，加入16 U/g高溫淀粉酶，90 ℃液化100 min，降溫后分別加入3%的增香糖化曲，35℃條件下保溫糖化120 min，分別活化0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/100 mL酵母菌并接種，同時接種5%的乳酸菌共酵，30 ℃酒精發酵4 d。從圖7可知，酒精度隨著酵母菌接種量的增加不斷增大并趨于穩定，為了節省成本，將接種量定為0.3 g/100 mL。

2.4 液態醋風味改良工藝確定后酒精發酵階段響應面試驗結果

利用軟件對表4中的17組試驗數據進行二次多項式回歸擬合，得到二次多元回歸方程為：

Y=8.74＋0.050A－0.045B＋0.035C－0.055AB－0.01AC＋0.025BC－0.13A2－0.13B2－0.098C2

對上述回歸方程進行方差分析，結果見表5。

表4 Box-Behnken試驗設計與結果Table4 Box-Behnken design with experimental results

表5 回歸方程的方差分析Table5 Analysis of variance for regression model

由表5可知，對回歸方程結果分析：由失擬項P值為0.276 6說明失擬不顯著，模型預測值與實際值在誤差允許范圍內。而模型P值為0.000 1表明該模型有極顯著意義，可使用該方程模擬全麥粉酒精發酵階段分析。由結果可知，對酒精度的影響排序為糖化曲添加量＞酵母菌接種量＞發酵溫度。且模型的復相關系數R2為0.976 6，大于90%，說明酒精度和糖化曲添加量、酵母菌接種量、發酵溫度存在線性相關，模型擬合程度高。變異系數值為0.36%，其值比較小，表明試驗結果可靠性較高。

回歸方程分析表明：一次項A、B，二次項A2、B2、C2，交互項AB為極顯著因素（P＜0.01），說明酒精度不但受糖化曲添加量、酵母菌接種量、發酵溫度影響很大，也受到糖化曲添加量與酵母菌接種量交互作用影響；一次項C為顯著因素（P＜0.05），說明發酵溫度對酒精發酵的酒精度有顯著影響；交互項BC、AC為不顯著因素（P＞0.05），說明發酵溫度與糖化曲添加量和發酵溫度與酵母菌接種量的交互作用對酒精產量幾乎不影響。

為了直觀反映各因素及其交互作用對響應值的影響結果，固定其他因素為0水平，對上述回歸方程繪制三維響應面圖及其等高線圖，見圖8。

圖8 各因素交互作用響應面圖Fig. 8 Response surface plots showing the effect of various factors on alcohol fermentation

從圖8a可見，在本試驗水平范圍內，隨著酵母菌接種量的增加，酒精度上升，但接種量超出一定量時，反而會使酒精度下降。因此，當酵母菌接種量在0.2～0.35 g/100 mL時，酒精度可達到8.7%。糖化曲的添加量并不是越高越好，只有添加量控制在5～8 g/100 g干物料時，才能獲得酒精度8.7%。由圖8b可知，當發酵溫度控制在30～34℃時，酒精度隨著糖化曲添加量適量增加而上升，當糖化曲添加量超過7%，對酒精度影響減小。由圖8c可知，酵母菌接種量控制在0.225～0.35 g/100 mL，發酵溫度控制在31～34 ℃時可達到較高酒精度8.7%。

通過軟件分析得到最佳酒精發酵條件為糖化曲添加量6.5%、酵母菌接種量0.28 g/100 mL、發酵溫度32℃，預計酒精度可達8.75%。為檢驗響應面優化結果的可靠性，采用上述條件進行全麥粉酒精發酵，3次平行實驗得到的實際平均酒精度為8.69%，相對誤差小于1%，因此，響應面優化得到的參數具有實際應用價值。

2.5 5 L自吸式發酵罐驗證液態法食醋風味改良新工藝

圖9 小麥醋半連續發酵過程Fig. 9 Time-course curves of semi-continuous vinegar fermentation

圖9 顯示：5 L自吸式發酵罐深層液態法半連續發酵食醋過程，共分割9 次，穩定發酵后生產6 g/100 mL食醋共5 L，3 次測得不揮發酸含量均不小于0.5 g/100 mL。與以大米為原料經雙酶液態法發酵所得的醋品相比，不揮發酸含量提高了3 倍，風味改良效果明顯[31]。

3 結 論

通過正交試驗 和響應面優化試驗，對傳統深層液態法食醋發酵過程進行了研究和改進，確定了改良液態醋風味的深層液態食醋發酵新工藝。具體工藝條件為：以小麥為原料，調漿液化完成后，加入6.5%的增香糖化曲，35 ℃保溫糖化1 h，接種5%乳酸菌與0.28 g/100 mL酵母共同酒精發酵，控制溫度32 ℃發酵4 d。將酒醪經5 L自吸式發酵罐上罐發酵后得到食醋，成品總酸度（以醋 酸計）不小于6 g/100 mL，不揮發酸含量不小于0.5 g/100 mL，達到了GB 18187—2000《釀造食醋》對固態醋不揮 發酸含量的要求。

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Optimization of Self-Suction Semi-Continuous Vinegar Fermentation for Flavor Improvement

HONG Housheng1,2, ZHAO Min1, LUO Haiyan1, DOU Bingran3
(1. College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China; 2. Nanjing Highke Bioengineering Equipment Co. Ltd., Nanjing 210009, China; 3. College of Sciences, Nanjing Tech University, Nanjing 210009, China)

Semi-continuous submerged vinegar fermentation in a self-suction fermentor has the advantages of high production efficiency and short production cycle. However, the taste of the produced vinegar is not as good as desired. For increased non-volatile acid content and improved vinegar f avor, the traditional liquid-state fermentation process for vinegar production was modif ed by raw material selection, addition of saccharif cation agent and mixed-culture alcoholic fermentation. The vinegar production process was determined as follows: After addition of water, ground wheat was liquef ed and saccharif ed by addition of 6.5% (m/m) f avor-enhancing saccharif cation agent at 35 ℃ for 1 h; afterwards, the substrate was inoculated with a mixture of 5% (V/V) lactic acid bacteria and 0.28 g/100 mL yeast, fermented at 32 ℃ for 4 d, and f nally inoculated with acetic acid bacteria. The liquid-state fermentation carried out in shaking f asks yielded a product containing 0.47 g/100 mL non-volatile acids. The total acidity of vinegar produced in a 5 L self-suction fermentor by the semi-continuous submerged fermentation process was no less than 6 g/100 mL, and the volatile acid content was no less than 0.5 g/100 mL, both of which reached the requirements of the Chinese national standard.

self-suction; semi-continuous fermentation; vinegar; f avor

10.7506/spkx1002-6630-201702012

TS26

A

1002-6630（2017）02-0075-07

洪厚勝, 趙敏, 駱海燕, 等. 基于風味改善的食醋自吸式半連續釀造工藝優化[J]. 食品科學, 2017, 38(2): 75-81. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201702012. http://www.spkx.net.cn

HONG Housheng, ZHAO Min, LUO Haiyan, et al. Optimization of self-suction semi-continuous vinegar fermentation for flavor improvement[J]. Food Science, 2017, 38(2): 75-81. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201702012. http://www.spkx.net.cn

2016-03-31

國家高技術研究發展計劃（863計劃）項目（2012AA021201）

洪厚勝（1965—），男，教授，博士，研究方向為生物過程裝備。E-mail：hhs@njtech.edu.cn