模擬微重力與普通環境下小球藻耐酚性能比較與馴化研究

汪鐵林，張志忍，王成成，王為國，王存文

(武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430073)

模擬微重力與普通環境下小球藻耐酚性能比較與馴化研究

汪鐵林，張志忍，王成成，王為國，王存文

(武漢工程大學化工與制藥學院，湖北 武漢 430073)

為探究小球藻在普通環境和模擬微重力環境下對苯酚耐受性能的變化幅度以及馴化培養對小球藻耐酚及降酚能力的影響，從而明確在微重力環境下利用含酚廢水大規模培養小球藻的可行性，比較了小球藻在普通環境和模擬微重力環境下的耐酚與降酚能力，并對其進行了馴化培養。結果表明，普通環境下小球藻最大苯酚耐受濃度為600 mg·L-1，而在模擬微重力環境下的最大苯酚耐受濃度提高到700 mg·L-1，且苯酚完全降解所需時間也明顯縮短。通過馴化培養得到的小球藻耐酚性能提高，馴化后的小球藻在普通環境下最大苯酚耐受濃度為800 mg·L-1，在模擬微重力環境下最大苯酚耐受濃度達1 000 mg·L-1，同時小球藻在模擬微重力環境下降酚能力也顯著提高。

模擬微重力；小球藻；苯酚；馴化

苯酚及其衍生物是水體中最常見的有機污染物之一，主要來源于煉油、農藥、印染以及酚醛樹脂等工業廢水[1-4]，對人體、動植物以及微生物均有毒害作用。目前，對含酚廢水的處理主要有吸附、萃取、離子交換等物理化學法和生物降解法，相對于前者，生物降解法由于具有成本低、操作簡便、不造成二次污染等優點而得到了廣泛應用[5-8]。雖然苯酚對生物的生長具有一定毒害作用，但有一些生物卻對苯酚表現出一定耐受性并可將酚類物質加以降解[9]，如某些細菌[10]、真菌[11]、酵母[12]以及微藻[13]均表現出一定的耐酚能力。

微藻生物質由于具有光合作用效率高、油脂含量高、生長周期短、生長速度快、生態分布廣、不占耕地等優勢，作為生物質能源原料倍受關注。采用含酚廢水培養富油微藻，一方面利于環境保護，另一方面可以收獲生物質能源原料。而苯酚分子的疏水作用會破壞微藻細胞膜結構，導致微藻生長受到抑制，因此關于耐酚藻種的篩選與馴化是利用微藻降解含酚廢水的關鍵[1]。雖然多種微藻均能在含酚溶液中生長，但僅有Chlorellaspp.、Scenedesmus obliquus 和 Spirulina maxima等數種微藻對苯酚具有良好的降解能力[14-16]，且經過馴化后的微藻對苯酚的耐受和降解能力均能得到較大幅度的提高[5]。

微重力環境可能會對輪藻、杜氏鹽藻等微藻的代謝、發育、生殖、衰老等生理生化過程產生影響，使微藻的生長加快[17-19]。太空飛行和地面回轉器的實驗結果表明，微重力改變了微藻機體與介質環境的相互聯系，從而影響微藻的代謝。為探索在微重力環境下利用含酚廢水高密度、短耗時的大規模培養微藻的可行性，作者以小球藻為研究對象，比較了在普通環境和模擬微重力環境下小球藻的耐酚與降酚能力，并對小球藻進行了耐酚馴化培養實驗。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

實驗中使用的藻種為小球藻(Chlorellasp.)，其編號為FACHB-9，由中國科學院武漢水生生物研究所提供。采用BG-11培養基作為基礎培養基。所用試劑均為分析純。

UV-6000型紫外可見分光光度儀，上海元析儀器有限公司；旋轉細胞培養系統，美國Synthecon INC公司；LRH-300-GSIT型二氧化碳人工氣候箱，上海銀澤儀器設備有限公司；托馬細胞計數器，上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小球藻的培養

用經過高壓滅菌后的BG-11培養基將處于成熟期的小球藻藻液稀釋10倍，再將藻液均分為多個組別，分別向其中添加不同濃度苯酚后用于實驗。

將預處理后含不同濃度苯酚的藻液分別注入RCCS的回轉器中作為實驗組，同時將等體積藻液注入100 mL錐形瓶中作為對照組。將實驗組與對照組置于人工氣候箱中培養，每24 h測定一次細胞密度和苯酚濃度。

根據初次培養實驗結果，分別在普通環境和模擬微重力環境下對小球藻進行耐酚馴化培養實驗。

以上實驗培養條件均為：溫度(25±2) ℃、冷白熒光光照強度4 000 lx·cm-2、光照時間比12 h∶12 h。

1.2.2 苯酚濃度的測定

采用4-氨基安替比林顯色法[20]測定苯酚濃度。

1.2.3 苯酚降解率的計算

測定苯酚濃度后，按式(1)計算特定時間內的苯酚降解率。

(1)

式中：D為苯酚降解率；ct、c0分別為時間t時刻和起始時刻的苯酚濃度，mg·L-1。

2 結果與討論

2.1 普通環境下苯酚對小球藻生長的影響

研究表明，在普通環境下未馴化的小球藻的最大苯酚耐受濃度為600mg·L-1，并且苯酚濃度為100～200mg·L-1時，苯酚對小球藻的生長起到輕微的刺激作用[5]。因此，本實驗在普通環境下分別在培養基中添加濃度為0～600mg·L-1的苯酚對小球藻進行培養，結果如圖1和圖2所示。

圖1 普通環境下小球藻在含不同濃度苯酚 培養基中的生長曲線Fig.1 Growth curves of Chlorella sp.cultivated with differentconcentrations of phenol under general condition

由圖1可知,當苯酚濃度低于600 mg· L-1時，小球藻能正常生長，生長前2 d為適應期，生長速度緩慢。相對于對照組，苯酚濃度為200 mg· L-1時，小球藻的生長表現出輕微的刺激作用，在第4 d時生物量超過對照組，這與文獻[5]報道結果基本一致。隨著苯酚濃度的增大，小球藻的生長速度逐漸減緩。當苯酚濃度過高，達到600 mg· L-1時，小球藻細胞在短時間內迅速減少，直至生長停止，藻細胞全部死亡。

圖2 普通環境下小球藻培養液中苯酚濃度的變化Fig.2 Phenol concentration changes of Chlorella sp. culture medium under general condition

由圖2可知，當苯酚濃度低于600 mg· L-1時，培養基中的苯酚均能在9 d內被小球藻幾乎完全降解。值得指出的是，在長時間觀測過程中由于苯酚揮發擴散到空氣中從而導致其濃度下降，但考慮到在一個培養周期內苯酚揮發量相對于生物降解量較小，因此在本實驗中未考慮自然揮發的苯酚量。

2.2 模擬微重力環境下苯酚對小球藻生長的影響

研究表明，在微重力環境下，植物細胞的生長代謝、形態結構等多種特性均會發生改變，尤其是藻細胞的生長速率會明顯加快[21]。圖3為模擬微重力環境下小球藻在含不同濃度苯酚培養基中的生長曲線。

圖3 模擬微重力環境下小球藻在含不同 濃度苯酚培養基中的生長曲線Fig.3 Growth curves of Chlorella sp.cultivated with different concentrations of phenol under simulated microgravity condition

由圖3可知，與普通環境相比，在模擬微重力環境下小球藻對苯酚的耐受性明顯提高，小球藻的最大耐受苯酚濃度由600 mg·L-1提高到700 mg·L-1，說明微重力環境對小球藻的耐酚能力起到了促進作用。

圖4為模擬微重力環境下小球藻培養液中苯酚濃度的變化。

圖4 模擬微重力環境下小球藻培養液中苯酚濃度的變化Fig.4 Phenol concentration changes of Chlorella sp.culture medium under simulated microgravity condition

由圖4可知，模擬微重力環境對小球藻的苯酚降解速率也產生了明顯的影響，培養液中不同濃度的苯酚被完全降解所需時間比在普通環境下明顯縮短。當苯酚濃度為500 mg·L-1時，完全降解時間由普通環境下的9 d縮短為模擬微重力環境下的6 d。原因可能是，模擬微重力環境下小球藻生長代謝加快，培養液中碳源消耗加速，從而加快苯酚的降解。

2.3 不同環境下苯酚對馴化后小球藻生長的影響

為探究馴化過程對小球藻耐酚及降酚能力的影響，根據初次培養實驗結果對小球藻進行了耐酚馴化培養。分別對初次實驗中普通環境下苯酚濃度為400 mg·L-1及微重力環境下苯酚濃度為500 mg·L-1的條件下生長到對數期的兩種小球藻進行馴化培養。

2.3.1 普通環境下苯酚對馴化后小球藻生長的影響

普通環境下的小球藻馴化培養實驗結果如圖5和圖6所示。

圖5 普通環境下馴化后的小球藻在含不同 濃度苯酚培養基中的生長曲線Fig.5 Growth curves of domesticated Chlorella sp. cultivated with different concentrations of phenol under general condition

對比圖1和圖5可知，在普通環境下，在含不同濃度苯酚的培養基中培養的小球藻最大細胞密度在馴化前后變化不大，如苯酚濃度為400 mg·L-1時，最大藻細胞密度在馴化前后均約為1.2×107cell·mL-1。在普通環境下馴化后的小球藻在苯酚濃度為0～500mg·L-1的培養基中生長速率基本與馴化前保持一致，均經過2 d的適應期后生長速度加快。而馴化后小球藻的最大苯酚耐受濃度明顯提高，未經馴化的小球藻在苯酚濃度達到600 mg·L-1時生長受到完全抑制，在第9 d全部死亡，而經過馴化的小球藻在苯酚濃度達到800 mg·L-1時生長才表現出完全抑制，于培養第6 d才全部死亡。小球藻的最大苯酚耐受濃度較未馴化時提高了約三分之一，說明馴化過程雖未改變低濃度苯酚中小球藻的生長速率，但能顯著提高其對苯酚的耐受能力。

圖6 普通環境下馴化后小球藻培養液中苯酚濃度的變化Fig.6 Phenol concentration changes of domesticatedChlorella sp.culture medium under general condition

對比圖2和圖6可知，馴化培養實驗中苯酚的降解速率明顯增大。普通環境下未馴化的小球藻在苯酚濃度分別為400 mg·L-1、500 mg·L-1、600 mg·L-1的培養基中培養4 d后，培養基中的苯酚濃度分別為128 mg·L-1、298 mg·L-1、365 mg·L-1，苯酚降解率分別為68.0%、40.4%和39.2%；而經過馴化的小球藻在對應的第4 d苯酚降解率分別達到74%、65%和62%。表明馴化過程不僅增強了小球藻的耐酚能力，同時也增強了其降酚能力。藻類對苯酚的降解可能是由于在苯酚的誘導下形成酶的作用，因此經過馴化后藻體降解苯酚的能力有所提高[5]。

2.3.2 模擬微重力環境下苯酚對馴化后小球藻生長的影響

模擬微重力環境下的小球藻耐酚馴化培養實驗結果如圖7和圖8所示。

對比圖3和圖7可知，模擬微重力環境下，小球藻在含不同濃度苯酚的培養基中馴化后最大細胞密度較馴化前均有一定提升，在苯酚濃度為600 mg· L-1的培養基中，馴化后的小球藻最大細胞密度從馴化前的9.8×107cell·mL-1增長到1.29×108cell·mL-1，增長了31.6%。表明在模擬微重力環境下，馴化過程不僅改變了小球藻對苯酚的耐受性，同時也加快了小球藻的生長速率。但隨著苯酚濃度的進一步增大，小球藻生長速率逐漸減緩。當苯酚濃度達到1 000 mg· L-1時，小球藻生長受到完全抑制，與未馴化的小球藻相比，最大苯酚耐受濃度提高了300 mg· L-1。微重力環境下馴化過程對小球藻耐酚能力的提高和生長代謝的加速要比普通環境下更為顯著。

圖7 模擬微重力環境下馴化后的小球藻在含不同 濃度苯酚培養基中的生長曲線Fig.7 Growth curves of domesticated Chlorella sp. cultivated with different concentrations of phenol under simulated microgravity condition

圖8 模擬微重力環境下馴化后小球藻培養液中苯酚濃度的變化Fig.8 Phenol concentration changes of domesticatedChlorella sp.culture medium under simulated microgravity condition

對比圖2和圖8可知，當苯酚濃度為400 mg·L-1、500 mg·L-1時，模擬微重力環境下經過馴化的小球藻在第4 d苯酚降解率分別為75%和 67%,說明小球藻馴化后在模擬微重力環境下的苯酚降解速率較普通環境下亦有所提高。模擬微重力環境下苯酚降解速率提高的原因在于，一方面小球藻生長速率加快導致碳源消耗速率加快，另一方面由于模擬微重力下細胞膜脂質層分子之間的距離有所增大，提高了膜的流動性和通透性[22]，導致苯酚能夠更快地滲透入細胞內部，從而加快了苯酚的降解。

3 結論

比較了小球藻在普通環境和模擬微重力環境下的耐酚與降酚能力，并對其進行了馴化培養。結果表明，普通環境下小球藻最大苯酚耐受濃度為600 mg· L-1，而在模擬微重力環境下的最大苯酚耐受濃度提高到700 mg· L-1，且苯酚完全降解所需時間也明顯縮短。通過馴化培養后的小球藻耐酚能力明顯提高，馴化后的小球藻在普通環境下最大苯酚耐受濃度為800 mg· L-1，而在模擬微重力環境下最大苯酚耐受濃度達1 000 mg· L-1。同時小球藻在模擬微重力環境下降酚能力也顯著提高，馴化后的小球藻在苯酚濃度為600 mg· L-1的培養基進行培養，其最大細胞密度比未馴化時增長了31.6%。馴化過程能有效增強小球藻的耐酚與降酚能力，但其具體機理尚待進一步研究。

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Phenol-Tolerant Characteristic and Domestication ofChlorellasp.under Simulated Microgravity and General Conditions

WANG Tie-lin，ZHANG Zhi-ren，WANG Cheng-cheng，WANG Wei-guo，WANG Cun-wen

(SchoolofChemicalEngineeringandPharmacy，WuhanInstituteofTechnology，Wuhan430073，China)

InordertomakeclearthefeasibilityofcultivationofChlorellasp.onalargescaleusingphenolicwastewaterundermicrogravitycondition,thevariationrangeofphenoltoleranceofChlorellasp.aswellasthepotentialinimprovingthephenol-tolerantandphenol-degradingabilitiesbydomesticationcultureundergeneralconditionandsimulatedmicrogravityconditionwereinvestigated.Theresultsshowedthat,themaximumphenoltoleranceconcentrationwas600mg·L-1undergeneralcondition,whilethemaximumphenoltoleranceconcentrationincreasedto700mg·L-1undersimulatedmicrogravitycondition,andthecompletedegradationtimeofphenolshortenedobviously.Thephenol-tolerantabilityofChlorellasp.improvedbydomesticationculture.ThemaximumphenoltoleranceconcentrationofChlorellasp.was800mg·L-1undergeneralcondition,whilethemaximumphenoltoleranceconcentrationreachedupto1 000mg·L-1undersimulatedmicrogravitycondition.Meanwhile,thephenol-degradingabilityofChlorellasp.improvedsignificantlyundersimulatedmicrogravitycondition.

simulatedmicrogravity;Chlorellasp.;phenol;domestication

湖北省自然科學基金資助項目(2015CFB580)，湖北省科技支撐計劃資助項目(2013BHE001)

Q 949.217

A

1672-5425(2017)01-0039-05

汪鐵林，張志忍，王成成，等.模擬微重力與普通環境下小球藻耐酚性能比較與馴化研究[J].化學與生物工程，2017，34(1)：39-43.