小鼠肝切除使紅細胞內血紅蛋白的電泳釋放增強

韓麗紅 ，閆斌 ，高麗君 ，蘇燕 ，楊文杰 ，秦文斌

1.包頭醫學院生物化學教研室，內蒙古包頭 014060；2.包頭醫學院第一附屬醫院普外二科，內蒙古包頭 014010

肝臟對人體的重要性眾所周知。關于肝病時紅細胞(red blood cell,RBC)和血紅蛋白（hemoglobin ，Hb）變化的研究表明，肝臟病變會造成紅細胞系統異常，出現不同程度的貧血現象。肝臟是造血的主要器官，以生成紅細胞為主，那么肝切除時紅細胞會怎樣，籠統來說，肯定有變化，但查不到這方面的文獻報道。包頭醫學院血紅蛋白研究室長期從事紅細胞電泳釋放血紅蛋白的研究[1-6]，該文中利用這種技術研究了小鼠肝切除后紅細胞釋放血紅蛋白的情況，取2016年12月—2017年4月于包頭醫學院生物化學與分子生物學實驗室行小鼠肝切除術后0～7、14 d的血紅細胞做血紅蛋白釋放電泳，與未做手術小鼠及假手術組的小鼠的血紅蛋白釋放試驗進行對比，每組3～5只小鼠，觀察其多帶釋放情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的來源

C57小鼠，SPF級，雄性，體重20～25 g。由軍事醫學科學院動物部提供。小鼠稱重后4%水合氯醛(0.01 mL/g)腹腔注射麻醉小鼠，仰臥固定其四肢于手術板上。常規切口處剃毛備皮。碘伏消毒，無菌紗布覆蓋，取劍突至恥骨上方腹部正中切口逐層入腹。按Higgins等經典方法，于腹部正中做切口，擠出肝臟左葉和中葉于肝蒂部結扎后切除，關閉腹腔，按層縫合切口。肝部分切除手術均在上午進行，嚴格按照無菌手術操作，術后保溫并自由進食及飲水。

1.2 實驗方法

用小鼠的全血或分離得到的紅細胞做淀粉-瓊脂糖凝膠電泳。先普泳，電勢梯度6 V/cm，泳2 h，停電15 min。前進再釋放即電勢梯度6 V/cm，再通電30 min。后退再釋放即電勢梯度 6 V/cm，倒正負極再通電15 min。電泳后先染麗春紅染液過夜，取出、照相、晾干。再染聯苯胺染液，加3%過氧化氫直到血紅蛋白變成藍黑顏色，轉入漂洗液漂洗兩次，5 min/次，取出晾干。

2 結果

2.1 第一批肝切除后小鼠紅細胞的單向多帶再釋放電泳結果

由圖1可以看出這一批標本中假手術標本再釋放明顯弱于肝切除1 d者，肝切除14 d標本出現梯帶增強。

圖1 第一批肝切除后小鼠紅細胞的單向多帶再釋放電泳結果

2.2 第二批肝切除后小鼠紅細胞的單向多帶再釋放電泳結果

由圖2可以看出，這一批標本中，與未切除標本比較，肝切除1、3、4 d標本都顯示出梯帶增強。

圖2 第二批肝切除后小鼠紅細胞的單向多帶再釋放電泳結果

2.3 肝切除后6 h與14 d小鼠紅細胞的雙向多帶再釋放電泳結果

由圖3可以看出，肝切除后電泳釋放出來的多帶是與主要帶（箭頭↑所指處）相平行，說明它們是來自再釋放[7-9]。另外，14 d小鼠紅細胞的多帶再釋放明顯大于6 h者，支持單向電泳時的結果。

圖3 肝切除后6 h與14天小鼠紅細胞的雙向多帶再釋放電泳結果

2.4 小鼠肝切除后標本的綜合結果

由此可以看出全部小鼠肝切除實驗結果，它來自五批標本，綜合起來包括了肝切除實驗的全部過程0～7 d。從綜合結果來看，未做手術和做過假手術的標本再釋放強度較低，其他肝切除后不同時間標本的再釋放強度幾乎都明顯提高，個別結果偏低可能與標本量太少有關。

圖4 小鼠肝切除后標本的綜合結果

3 討論

紅細胞內血紅蛋白釋放試驗 （hemoglobin releasing test，HRT）是將紅細胞加在淀粉-瓊脂糖混合凝膠中進行電泳，一次通電完成電泳，此時有 Hb釋放出來，稱為“初釋放”；在電泳釋放過程中進行“斷電-再通電”，又會有Hb從原點釋放出來，稱為“再釋放”。正常情況下，初釋放時，紅細胞內的大部分 Hb都釋放出來，殘留較少；再釋放時，殘留Hb再次離開紅細胞，出現新的Hb區帶。關于人類疾病與血紅蛋白釋放關系進行了一系列研究[8-10]。HRT是該研究室提出的一種實驗方法,用來觀察各種條件下紅細胞釋放血紅蛋白的情況。釋放的動力是電泳,這是共同因素,不同釋放結果則取決于紅細胞以及其與血漿環境之間的相互作用。

該研究室研究過人類肝硬化時血紅蛋白釋放的變化，發現肝硬化患者的血紅蛋白的再釋放增強[9]。共篩查了38例全血標本的HRT，利用等低滲全程試驗和雙層對角線電泳技術，比較了肝硬化患者和肝功正常血液標本的 HRT，發現肝硬化患者標本的“前進”和“后退”再釋放都增強。選取電泳效果最明顯的等低滲標本做對角線電泳，可以看到 Hb后退成分，說明了肝硬化患者紅細胞中 Hb的存在狀態異常，前進再釋放釋放很多Hb后，后退再釋放又釋放出較多Hb。因此，得出結論肝功異常會影響到紅細胞膜上成分，這一點早有研究，但肝再生時紅細胞內血紅蛋白的電泳釋放情況尚無人研究，該文從血紅蛋白電泳釋放角度研討紅細胞內的變化。

肝臟有很強的再生能力，小鼠肝部分切除術后大約兩周肝臟既可以完成再生。研究發現，肝部分切除后肝再生的過程中，小鼠紅細胞血紅蛋白釋放試驗發生了改變，未做手術和做過假手術的標本再釋放強度較低，其它肝切除后不同時間標本的再釋放強度幾乎都明顯提高，個別結果偏低可能與標本量太少有關。肝臟再生的過程中，肝功能受到一定影響，紅細胞的血紅蛋白也發生了改變。血紅蛋白釋放實驗增強，今后的研究可以從血清化驗指標入手，進行進一步研究。

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[1]韓麗紅,楊文杰,高麗君,等.血紅蛋白F與血紅蛋白A2之間的交叉互作[J].中國醫藥指南,2015,13(5):62-63.

[2]韓麗紅,閆斌,高麗君,等.腫瘤患者紅細胞的血紅蛋白釋放實驗初步研究[J].中國醫藥指南,2015,13(8):12-13.

[3]喬姝,高麗君,寶勿仁必力格,等.ABO血型的雙向全程釋放電泳圖譜[J].包頭醫學院學報,2016,32(7):5-7.

[4]Caili Wang,Liping Liu,Lihong Han,et al.The effect of plasma components on hemoglobin release test in red blood cells (RBC)[J].Toxicological&Environmental Chemistry,2017,99(3):448-459.

[5]Yan Su,Lisha Han a,Lijun Gao,et al.Abnormal increased re-released Hb from RBCs of an intrahepatic bile duct car cinoma patient was detected by electrophoresis release test[J].Bio-Medical Materials and Engineering,2015,26:S2049-S2054.

[6]Yaqiong Gao,Lijun Gao,Jianmin Ren,et al.The clinical significance of different re-released electrophoresis types in RBC suspension and whole blood[J].Journal of Residuals Science&Technology,2016,13(5):2841-2849.

[7]秦文斌.活體紅細胞內血紅蛋白的電泳釋放[J].中國科學生命科學,2011,41（8）：597-607.

[8]Su Yan,Jing Shen,Lijun Gao,et al.Molecular interaction of released proteins in electrophoesis of human erythrocytes[J].Electrophoresis,2012,33:1042-1045.

[9]寶勿仁必力格,王翠峰.肝硬化患者血紅蛋白釋放試驗明顯異常[J].臨床和實驗醫學雜志,2011,10（24）：1915-1917.

[10]Yan Su,Lijun Gao,Wenbin Qin.Interactions of hemogl obin in lived red blood cells measured by the electrophoesis release test[J].Protein Electrophoresis Methods and Protocols,Methods in Molecular Biology,2012,869:393-402.