pAdKDR/CD/TK雙自殺基因系統對肝癌細胞的殺傷作用的試驗研究

谷 洋，劉志毅，金 虎，劉 明，孫鐵梁

(吉林大學第四醫院 普通外科，吉林 長春130011)

pAdKDR/CD/TK雙自殺基因系統對肝癌細胞的殺傷作用的試驗研究

谷 洋，劉志毅*，金 虎，劉 明，孫鐵梁

(吉林大學第四醫院 普通外科，吉林 長春130011)

目的 探討含KDR啟動子的雙自殺基因CD/TK對肝癌HepG2細胞的殺傷作用。方法 觀察不同前藥對HepG2細胞、血管內皮細胞ECV304和LST174細胞的殺傷作用，評估KDR啟動子的靶向殺傷作用。觀察不同前藥對轉染不同自殺基因的HepG2細胞的殺傷作用，及旁觀者效應。結果 轉染腺病毒的HepG2細胞及血管內皮ECV304細胞對前藥具有較高的敏感性，而感染腺病毒的LST174細胞對前藥不敏感(P<0.05)。當轉染細胞混合比例為50%時，應用前藥后，轉染CD/TK,CD,TK的HepG2細胞生存率分別為11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3%(P<0.05)。結論 含KDR啟動子的雙自殺基因CD/TK對肝癌HepG2細胞具有高度靶向殺傷作用；聯合用藥對轉染雙自殺基因的肝癌HepG2細胞具有協調增強殺傷作用。

雙自殺基因； KDR啟動子；肝癌細胞;基因

(ChinJLabDiagn,2017,21:0132)

肝癌是我國常見的惡性腫瘤，惡性程度高，外科手術治療效果差。近年來，隨著基因治療腫瘤的深入研究，自殺基因治療腫瘤成為研究熱點，雙自殺基因能夠產生兩種基因的互補增效的作用，我們聯合應用TK/GCV,CD/5-FC，研究KDR啟動的雙自殺基因系統對肝癌細胞的殺傷作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

重組腺病毒(吉林大學)，肝癌細胞HepG2(北京細胞研究所)，轉染試劑PolyFect (Qiagen 公司) GCV (Roche Pharma 公司) DMEM、RPMI 1640、MTT、小牛血清( Gibco 公司),5-FC(Sigma 公司)。

1.2 HepG2細胞的培養

①10 ml PRMI1640細胞生長液，37℃水浴，體積分數70%乙醇浸泡去除污染。將細胞懸液離心(200×g)，5 min，加入5 ml新鮮細胞生長液。新鮮PRMI 1640細胞培養液10 ml，細胞懸液5 ml，37℃，5%CO2；細胞70%時行1∶3傳代。用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)10 ml清洗細胞，滅活Tyrosine，新鮮PRMI 1640細胞生長液8.5 ml，新鮮PRMI 1640細胞液9 ml，細胞懸液1 ml，37℃下孵育，體積分數5%CO2。細胞70%匯合傳代。

1.3 重組腺病毒對HepG2細胞、LST174細胞和血管內皮細胞ECV304的感染率測定

取對數生長期的上述三種細胞培養板，體積分數5%，CO2，37℃，加入不同感染復數的目的腺病毒pAdKDR/CD/TK ，3 d后在熒光顯微鏡下計數GFP陽性細胞百分比。

1.4 前藥不同濃度對細胞的殺傷作用

將HepG2細胞、LST174細胞和ECV304(血管內皮細胞)以接種培養板，用100M0I的重組腺病毒進行轉染。將不同濃度的前藥GCV和5-FC加入含5%小牛血清培養基，設GCV組、5-FC組和GCV+5-FC組，72 h，MTT法檢測細胞生長抑制率。

1.5 pAdEasy-KDR-CD pAdEasy-KDR-TK pAdEasy-KDR-CD/TK重組腺病毒的轉染

HepG2細胞培養，體積分數5%CO2，37℃培養，再分別加入10 μl重組腺病毒KDR-CD KDR-TK KDR-CD/TK質量濃度為8 μg/ml，37℃，體積分數5%CO2，熒光顯微鏡下觀察轉染效果。

1.6 旁觀者效應

取對數生長期的HepG2細胞(轉基因和未轉基因)，以1×104個細胞/孔接種于96孔培養板中，24 h后不同濃度混合，MTT法檢測細胞的存活率。

1.7 藥物濃度對腺病毒的HepG2細胞的殺傷效應

1.7.1 將轉染和未轉染pAdKDR/CD/TK HepG2細胞培養，加入不同濃度的前藥5-FC、GCV，設5-FC組、GCV組和GCV+5-FC組，72 h以后，MTT法檢測細胞生長抑制率。

1.7.2 將HepG2細胞培養重組腺病毒感染。24 h后，加入不同濃度的5-FC 和GCV，設GCV組、5-FC組和GCV+5-FC組，72 h以后，用MTT法檢測細胞生長抑制率。

1.8 統計學方法

實驗數據用SPSS11.5軟件處理，采取單因素方差分析，組間比較用SNK法，獨立樣本t檢驗。

2 結果

2.1 重組腺病毒的酶切PCR鑒定

重組腺病毒質粒經PCR鑒定，目的基因片段均有表達。為證實外源基因導入靶細胞，應用特異基因引物KDR、TK、CD、CD/TK分別進行PCR片段擴增。結果：蛋白電泳分別切出特異性片段，分別為KDR、TK、CD及TK/CD，證實目的基因片段成功導入HepG2細胞(圖1)。電鏡下可見熒光蛋白GFP的表達，說明重組質粒轉染HepG2細胞成功(圖2)。

2.2 重組腺病毒對三種細胞(HepG2,ECV304,LST174)感染率的測定

MOI=10時，觀察到含熒光的細胞比較少；MOI=100時，含熒光細胞量大于90%；MOI=200，幾乎全部為含熒光細胞，說明隨腺病毒滴度的變化影響細胞的感染率，細胞的感染率隨滴度升高而升高，重組腺病毒對三種細胞的感染效率相似(圖3)。通過RT-PCR檢測可以發現，除LST174細胞外，均檢測到目的基因的表達(圖4)。

圖1 重組KDR/CD，KDR/TK，KDR/CD/TK質粒酶切鑒定

圖2 電鏡下可見熒光蛋白GFP的表達

圖3 重組腺病毒(AdKDRP-CD/TK)對三種細胞的感染率測定

圖4 感染AdKDR-CD/TK細胞的鑒定

2.3 前藥對三種細胞(HepG2，LST174，ECV304)的殺傷作用

感染腺病毒的HepG2和ECV304細胞對前藥有較高的敏感性；而LS T 174細胞對前藥敏感性較差，后者與前二者相比，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖5)。顯示KDR啟動子與MCV啟動子一樣，具有靶向性殺傷作用。

2.4 旁觀者效應

從結果看，旁觀者效應明顯，隨轉基因細胞所占比例的增加旁觀者效應隨之增強(圖6)。HepG2細胞轉染TK和轉染CD的旁觀者效應相似，轉染TK/CD基因的HepG2細胞與之比較，旁觀者效應明顯增強。當50%為轉染細胞時，三者細胞生存率分別為(11.8±1.2)%、(41.3±3.7)%、(43.1±2.3)%，前者與后二者比較(P<0.05)差異均有統計學意義。

2.5 藥物的不同濃度對轉染腺病毒的HepG2細胞的殺傷敏感性

2.5.1 按照生長的曲線計算出IC50，實驗組與對照組GCV分別為50 μg/ml和720 μg/ml，敏感性升高了14.3倍；5-FC的IC50分別為450 μg/ml和14 500 μg/ml，敏感性升高了28倍。而GCV+5-FC IC50分別為GCV15 μg/ml，5-FC75 μg/ml，敏感性是單獨用藥的3.4和6.8倍，是對照組敏感性的47倍和198倍。提示雙自殺基因對前藥的協同殺傷作用，對聯合用藥作用更加顯著(圖7)。

2.5.2 根據生長曲線計算IC50，GCVIC50和5-FCIC50分別為70 μg/ml和1 000 μg/ml，GCV+5-FCIC50為20/100 μg/ml，聯合用藥分別是單獨用藥GCV的3.5倍、5-FC的10倍。提示單用GCV和單用5-FC殺傷作用較強。而GCV+5-FC聯合用藥則有更強的抑制作用，差異有統計學意義(P<0.01)，提示聯合用藥有協同殺傷作用(圖8)。

圖5 前藥對三種細胞的殺傷作用

圖6 HepG2細胞轉染不同基因的旁觀者效應

圖7 不同前藥濃度對pAdKDR/CD/TKS HepG2細胞對不同前藥濃度的殺傷作用

圖8 轉染KDR-TK/CD基因的HepG2細胞對GCV/5-FC的殺傷敏感性

3 討論

3.1 KDR啟動子的靶向作用

肝癌的生物治療是近來的研究較多的領域，自殺基因的治療成為研究熱點，但仍有一些問題沒有解決，如表達不穩定，轉染效率偏低，殺傷效果較差，靶向性不高等。如何高效地將目的基因片段導入靶細胞，而獲得比較有效穩定的表達是目前基因治療的關鍵。腺病毒載體對來源于上皮細胞具有很高的親和力，因而大部分實體腫瘤細胞轉染率較高[1，2]。研究發現，腫瘤發生轉移的原因是因為腫瘤生長具有跟強的血管依賴性，新生血管為腫瘤細胞提供生長所需的氧和養分，促進腫瘤細胞增殖分裂，而使腫瘤細胞通過微循環浸潤到周圍組織臟器[3，4]。既往對于肝癌的靶向治療研究較多的是AFP,并且證實AFP驅動子能夠增強HSV-TK自殺基因系統對肝癌細胞的特異性殺傷作用[5]。研究表明KDR在許多惡性腫瘤組織內有較高表達，其中包括肝癌組織。腫瘤組織的KDR主要表達在血管內皮細胞，胞膜和(或)胞漿，腫瘤組織中的血管內皮細胞的增殖速度是正常組織的50-100倍，其表達水平隨血管內皮細胞更新速度加快及腫瘤惡性程度升高而升高[6，7]，因此抑制AFP表達、抑制腫瘤血管生成可以大大增強抗腫瘤效果。有研究表明[8]構建含有KDR啟動子的雙自殺基因，既能殺傷腫瘤細胞本身，又能抑制血管生長的雙重靶向作用。

PCR酶切方法鑒定顯示，TK/CD目的基因在HepG2 和ECV304細胞中有表達，而在LST174細胞無表達。提示KDR啟動子特異性選擇殺傷作用及度靶向性。

3.2 雙自殺基因系統

本實驗構建轉染pAdKDR-TK/CD、pAdKDR-TK、pAdKDR-CD的HepG2細胞，觀察到明顯的旁觀者效應，混合比例為50%時，細胞生存率分別為11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3%，提示雙自殺基因TK/CD比單自殺基因CD,TK細胞生存率明顯下降，具有更強的旁觀者效應，差異具有統計學意義(P<0.05)。分別給予GCV、5-FC、GCV+5-FC，根據生長曲線計算IC50，觀察前藥的殺傷作用。敏感性是實驗組單獨用藥的3.4倍和6.8倍。是對照組的47倍和198倍。結果顯示單獨用藥時，細胞生存率差異無統計學意義；而轉染雙自殺基因的HepG2細胞，聯合用藥分別是單獨用藥的3.5倍和10倍。前者與后二者相比差異具有統計學意義。數據表明單獨應用前藥時無論是GCV還是5-FC，轉染單自殺基因TK、CD和雙自殺基因TK/CD的HepG2細胞的殺傷率相似。而聯合應用時，轉染雙自殺基因的細胞比轉染單自殺基因細胞的殺傷率升高明顯，差異具有統計學意義。聯合用藥比單獨用藥抑制作用明顯增強。雙自殺基利用二者的作用互補，前藥應用劑量減少，耐藥性降低，減少前藥的毒副作用，放大殺傷效果。加之旁觀者效應以及KDR基因的高度選擇性，更加增強殺傷的效果。

本實驗研究含KDR啟動子的雙自殺基因對HepG2細胞的殺傷作用，結果提示：KDR啟動子具有高度的靶向性，雙自殺基因比單自殺基因具有更強的殺傷作用，而且聯合用藥效果更好。本研究為細胞體外實驗，還需進一步的動物實驗驗證，我們相信隨著生物技術的不斷發展進步，雙自殺基因有可能成為未來一種新的肝癌生物治療的有效方法。

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The study on killing effect of KDR promoter driving double suicide gene on human hepatic cancer HepG2 cells

GUYang,LIUZhi-yi,JINHu,etal.

(TheGeneralSurgeryDepartment,TheFourthHospitalofJilinUniversity,Changchun130011,China)

Objective To investigate the killing effect of KDR promoter driving double suicide gene on human hepatic cancer HepG2 cells.Methods To observe the killing effect of different kind of pre-drug on HepG2 cells,ECV304cells and LS174T cells,and evaluated the targeted killing effect of KDR.To observe the killing effect and standby effect of different kind of pre-drug on HepG2 cells.Results The HepG2 cells and ECV304 cells transfected with recombined adenovirus had high sensitivity to pre-drug.And the LS17T4 cells transfected with recombined adenovirus had no sensitivity to pre-drug(P<0.05).The HepG2 cells which transfected CD/TK,CD and TK genes,the survival rate of are 11.8±1.2%、41.3±3.7%、43.1±2.3% respectively(P<0.05) after using the pre-drug.Conclusion KDR promoter driving double suicide gene had high targed killing effect on human hepatic cancer HepG2 cells.There were enhanced killing effect on transfected double suicide genes of human hepatic cancer HepG2 cells when used combined pre-drugs.

Suicide Gene;KDR Promoter;Hepatic Cancer Cell;Gene

1007-4287(2017)01-0132-04

吉林省科技廳自然科學基金面上項目(201115117)

R735.7

A

2016-05-15)

*通訊作者