纖維蛋白膠介導大鼠內皮祖細胞移植干預大鼠急性腦缺血的實驗研究

權 哲，宋 薇，韋 博，胡國章

(1.上海市奉賢區中心醫院 神經二科，上海201400；吉林大學中日聯誼醫院 2.急診科；3.神經外二科)

纖維蛋白膠介導大鼠內皮祖細胞移植干預大鼠急性腦缺血的實驗研究

權 哲1，宋 薇2*，韋 博3，胡國章2

(1.上海市奉賢區中心醫院 神經二科，上海201400；吉林大學中日聯誼醫院 2.急診科；3.神經外二科)

1 材料和方法

1.1 實驗材料

冰箱(Hisense)，超凈工作臺(蘇州凈化)，CO2恒溫培養箱(Thermo Scientific)，熒光倒置顯微鏡(OLYMPUS) ，電熱恒溫干燥箱(常州潤華儀器)，超純水純化儀(四川優普科技)，高壓蒸汽滅菌鍋(山東博科)，動物大腦立體定位儀(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。M199培養基(Life公司)，胎牛血清(BI)，大鼠淋巴細胞分離液(上海生工生物)，纖維蛋白膠(sigma公司)，CD34/CD133熒光標記的抗體(BD公司)，VEGF/FGF-2單克隆抗體(Bioworld公司)。

1.2 大鼠骨髓 EPCs的分離、培養和鑒定

將健康 Wistar 大鼠用乙醚麻醉后脫臼處死，75%酒精中浸泡5 min，超凈臺內剝離肌肉并離斷兩端骨骺，預冷PBS潤洗，加入淋巴細胞分離液離心后收集沉淀，用M199培養基重懸細胞，計數后接種到24孔板中，置于恒溫培養箱培養。CD34/CD133陽性的細胞通過免疫熒光鑒定獲得。

1.3 內皮祖細胞與纖維蛋白膠形成復合物

將適量的CD34/CD133陽性內皮祖細胞用內皮細胞培養基重懸后，種植在纖維蛋白膠表面，定期更換新的培養基，置于37 ℃、5%CO2培養箱中，大約經過7 d后形成載有內皮祖細胞的纖維蛋白膠復合物。

1.4 大鼠急性腦卒中模型的建立

式中：Eb為泵站運行費用，元/m3；W 為泵站裝機功率，kW；F為農業供水電價，元/（kW·h）；Q 為泵站設計流量，m3/h；η末為泵站出口 （一級計量點）至終端計量點之間的渠系水利用系數，示范區中為斗渠渠道水利用系數。

將30只SD大鼠隨機均分為3組：假手術組(A組，n=10)，對照組(B組，n=10，單獨移植大鼠內皮祖細胞)，實驗組(C組，n=10，移植大鼠內皮祖細胞-纖維蛋白膠復合物)。利用酒精消毒后的線栓制備大鼠急性腦缺血模型，假手術組除線栓處理外，其它操作均同手術組。

1.5 腦卒中模型的評定指標

1.5.1 行為學評定標準[6](見表1)

表1 神經功能評定標準

評分1分以上認為模型成功，進行后續實驗研究。

1.5.2 TTC染色評定 利用水合氯醛腹腔麻醉大鼠，快速斷頭取腦，將鼠腦平分為厚約3 mm的切片，按順序浸入1%TTC中，37℃染色30 min，正常腦組織TTC染色為鮮紅色，缺血區腦組織為白色，計算每組大鼠的腦梗死面積。

1.5.3 病理及免疫組化評定 在移植后不同時間點，將各組大鼠的腦組織浸入4%多聚甲醛中，切除小腦與延髓，平均切成等厚度的6個冠狀切片，石蠟包埋后進行HE染色，觀察腦組織病理學變化；同時進行VEGF、FGF-2免疫組化，每張切片取8個不重復視野，計數VEGF、FGF-2的陽性細胞數。

1.6 統計學方法

所有實驗數據均獨立重復檢測3次，使用SPSS19.0統計軟件對數據進行分析，計量資料比較采用t2檢驗，多個樣本的組間比較采用ANOVA，對因素分析采用多元線性回歸分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠內皮祖細胞的鑒定

內皮祖細胞表面特異性標志有CD133、CD34等，對培養的細胞進行CD133、CD34免疫熒光檢測，結果顯示收集的細胞均為CD133、CD34表達陽性(見圖1)。

圖1-1 EPCs CD133+

圖1-2 EPCs CD34+

2.2 各組大鼠的行為學評分

在3 d、7 d、14 d三個時間點，對各組大鼠的行為學進行評分，移植術3 d后，B、C兩組間評分無顯著性差異(P>0.05)，但均顯著高于A組(P<0.01)；移植后7 d，C組評分顯著低于B組(P<0.05)，移植14 d后兩組評分差異更明顯(P<0.01)。見表2。

表2 三組大鼠在不同時間點的行為學評分(n=10)

假手術A與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，與對照組B組比較，#P<0.05,##P<0.01。

2.3 TTC染色評定各組大鼠的腦梗死面積

TTC染色評定3 d、7 d、14 d三個時間點的腦梗死面積，移植術3 d后，三組間腦梗死面積無顯著性差異(P>0.05)；移植后7 d，C組腦梗死面積顯著低于B組(P<0.05)，移植14 d后兩組腦梗死面積差異更明顯(P<0.01)。組內相比，隨著移植時間的延長，A組大鼠的腦梗死面積逐漸增大，B、C兩組大鼠的腦梗死面積逐漸減小，C組大鼠降低更為明顯。見表3。

表3 三組大鼠在不同時間點的腦梗死面積(n=10)

組間比較，*P<0.05，**P<0.01；組內比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.4 HE染色檢測各組大鼠的病理學變化

HE染色結果發現A組大鼠神經細胞、膠質細胞的形態結構幾乎無變化，胞漿無紅染，B和C組大腦組織的壞死區域均發現缺失大量神經元，膠質細胞異常增生，隨著移植時間的延長，B組大鼠腦梗死周圍未出現新生的毛細血管，C組大鼠腦組織梗死體積明顯減少，且腦梗死區域周圍可見大量新生的毛細血管。

2.5 各組大鼠腦組織VEGF、FGF-2免疫組化

VEGF、FGF-2免疫組化的著色部位主要在胞漿，呈黃褐色或棕黃色。A組大鼠腦組織的VEGF、FGF-2主要表達在少量的血管內皮細胞、神經細胞和膠質細胞，各個時間點無明顯變化。B、C組在腦缺血區域中的血管內皮細胞、神經細胞和膠質細胞表達明顯增多，均在移植后7d陽性細胞數達到峰值，但C組大鼠腦組織VEGF、FGF-2的表達量在三個時間點均明顯高于B組(P<0.05)和A組(P<0.01)。見表4。

表4 三組大鼠在不同時間點的VEGF、FGF-2陽性細胞數(n=10)

與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 結論

腦卒中[7](又稱腦中風)是世界上最重要的致死性疾病之一，具有極高的病死率和致殘率，但由于藥物治療的療效欠佳，手術治療又受到各種條件的限制，急需尋求新的治療手段[8]。自從在外周血中發現內皮祖細胞(EPCs)，大量研究發現EPCs具有修復血管損傷、促進神經纖維的生長和神經功能恢復等功能，不僅更新了傳統上關于血管損傷后修復的理論，而且為防止血管再狹窄、腦血管疾病和血管創傷愈合治療提供了廣泛的臨床應用前景[9]。但由于體內EPCs的數量有限，不能充分滿足細胞組織工程的迫切需要，如何快速穩定地擴增EPCs是一個困擾廣大研究者的問題[10]。而目前仍無一個標準方案規范對大鼠外周血中的EPCs誘導培養，本實驗通過查閱大量國內外文獻[11]，并經過前期實驗條件的反復摸索，最后借助免疫熒光技術，成功分離得到能在體外穩定傳代的內皮祖細胞，為EPCs在體內的移植提供可靠的理論基礎。

伴隨細胞移植工程的研究，生物活性材料也是近年來快速發展的熱門研究領域。有文獻報道，將生物材料單獨應用或結合細胞，能夠明顯改善心梗后的心肌不良重構。生物材料的選擇具有嚴格的標準[12]，一方面需要生物可降解性和適當的物理強度，另一方面要具備膠原、纖連蛋白和層粘連蛋白的生物學特性。纖維蛋白膠是經美國FDA批準的作為血和粘合劑廣泛應用的生物材料，不僅能為傷口內細胞的生長提供細胞間質，而且通過促進成肌細胞移植物的生存和保持，減少梗死范圍，并成功誘導梗死區的血管新生。本實驗采用TTC染色法對各組大鼠的腦組織進行染色，比較不同方式移植后大鼠腦梗死面積的變化，發現與單獨移植EPCs相比，利用纖維蛋白膠介導EPCs的移植，能明顯降低大鼠的腦梗死面積，同時HE染色結果顯示纖維蛋白膠介導EPCs的移植能顯著促進大鼠腦卒中周圍的血管新生，改善腦卒中大鼠的病理學變化進程，提示纖維蛋白膠可以作為有效的生物活性材料，介導EPCs移植體內后發揮生物學功能。

VEGF 是一類促血管內皮細胞生長的關鍵因子[13]，體外能特異性結合內皮細胞，刺激內皮細胞的分裂增殖，體內可有效促進形成新生血管，能起到對神經系統直接的保護作用[14]。FGF-2是一類具有血管活性和神經營養功能的因子，在人體的神經系統和心、腎、肝等組織中廣泛分布，研究表明[15]FGF-2的上調表達有助于腦缺血后的神經保護。本實驗將EPCs單獨或結合纖維蛋白膠移植入大鼠的急性腦卒中模型，在不同時間點檢測VEGF和FGF-2的表達量，發現兩種指標在A組大鼠的腦組織神經細胞中均為少量表達，B、C兩組大鼠的表達水平均增加，且顯著高于A組，并在移植7 d后達到最大值，但C組大鼠腦組織VEGF、FGF-2的表達量在三個時間點均明顯高于B組和A組。提示EPCs移植后能促進腦組織中神經細胞分泌VEGF和FGF-2，進而促進血管新生和神經功能的恢復，而結合纖維蛋白膠后，進一步加強治療效果。

本課題通過從大鼠骨髓中成功分離收集EPCs，并結合纖維蛋白膠進行移植，發現對治療大鼠急性腦卒中有更好的療效，為臨床治療血管新生相關疾病提供了新的指導。

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1007-4287(2017)01-0145-04

上海市奉賢區區科委課題：2015-1003

權 哲(1976-)，男，副主任醫師，博士。

2016-03-10)

*通訊作者