豆科植物多花木藍抑菌活性成分研究

蘇 生, 張 莉, 杜文林, 胡華林, 楊 華,沈 玲, 韓永芬, 李

(1.貴州省草業研究所, 貴陽 550006; 2. 貴州醫科大學藥學院, 貴陽 550025; 3. 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室, 貴陽 550002; 4. 延安大學化學化工學院, 延安 716000; 5.西安工程大學環境與化學工程學院, 西安 710048)

豆科植物多花木藍抑菌活性成分研究

(1.貴州省草業研究所, 貴陽 550006; 2. 貴州醫科大學藥學院, 貴陽 550025; 3. 貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室, 貴陽 550002; 4. 延安大學化學化工學院, 延安 716000; 5.西安工程大學環境與化學工程學院, 西安 710048)

活性追蹤下,采用柱層析分離多花木藍籽石油醚提取物中的抑菌活性物質。采用生長速率法和牛津杯法,選取稻瘟病菌、辣椒枯萎病菌、油菜菌核病菌、梨黑星病菌為測試真菌,青枯菌、大腸桿菌、金黃葡萄球菌、綠膿桿菌、枯草芽胞桿菌為測試細菌,測試了一級柱層析各流分的抑菌活性,測試結果顯示:A-4和A-5流分對所有測試菌均具有一定的抑菌活性,對梨黑星病菌的抑制作用最好,抑制率分別達到77.66%和74.67%;對青枯菌的抑菌圈最大,分別為1.37 cm和1.66 cm。分離出2個活性化合物,經13C、1H NMR 波譜方法鑒定,為Balansenate Ⅰ、Ⅱ,為首次從該植物中分離得到。生測結果顯示2個化合物具有較低的抑菌活性,其對金黃葡萄球菌活性最好,但最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌(MBC)濃度均只為250 mg/L和500 mg/L。

多花木藍; 抑菌活性; 活性化合物

病蟲草鼠害對農業生產造成的經濟損失巨大,故農藥已經成為農業生產中的重要生產資料,我國則已成為農藥生產使用的世界第二大國。但是,隨著化學合成農藥的使用,農藥的負面效應越來越嚴重,如環境污染、對人體健康的影響、“三R”問題等。從植物中提取的具有農用活性的化合物與環境相容性好、對非靶標生物安全,可用于解決農業生產中出現的病蟲害等問題[1],故其研究與開發已經成為研發新農藥的熱點之一[2]。

多花木藍IndigoferaamblyanthaCraib為豆科木藍屬植物,別名野藍枝、馬黃消、野綠豆樹(羅田)等,廣泛分布于我國南北方各省,生于海拔1 000 m以下山坡或灌叢中[3-4],對土壤要求不嚴,具有較強的抗逆性,且未發現有嚴重的病蟲害,是邊坡恢復的良好物種。本實驗室報道了多花木藍籽石油醚提取物具有良好的抑菌活性,并對其粗提物的化學成分進行了分析[5],但具體的抑菌活性物質一直未見報道。故本文在此基礎上,采用活性追蹤法,提取分離了多花木藍籽中的抑菌活性物質,并鑒定了其化學結構,測試了其抑菌活性,以期為開發多花木藍為植物源抑菌劑奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物樣品

多花木藍于2013年10月采自貴州省草業研究所獨山試驗基地,經貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室顧瑋副研究員鑒定為本品,陰干備用。

1.1.2 供試菌株

真菌:稻瘟病菌Magnaporthegrisea(Hebert) Barrnov.、辣椒枯萎病菌Fusariumoxysporum、油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum(Lib.)de Bary、梨黑星病菌Venturiapyrina,均由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室提供。

細菌:青枯菌Ralstoniasolanacearum、大腸桿菌Escherichiacoli、金黃葡萄球菌Staphylococcusaureus、綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa、枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis,均由貴州省中國科學院天然產物化學重點實驗室提供。

1.1.3 培養基

馬鈴薯土豆培養基(PDA):20%馬鈴薯,2%蔗糖,2%瓊脂,水100 mL,pH 6.0。

牛肉膏蛋白胨培養基(BPA):0.5%牛肉膏,1%蛋白胨,0.5%NaCl,水100 mL,pH 7.0～7.2,2%瓊脂。

Mueller-Hinton 肉湯培養基(MHB):牛肉粉 2.0 g,可溶性淀粉 1.5 g, 酸水解酪蛋白 17.5 g,pH 7.4±0.2,水 1 000 mL。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

RE 52-99型亞榮旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);SW-CJ-2FD型超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);BIC-250型人工氣候箱(上海博訊實業有限公司);XH-C渦旋混合器(上海滬西分析儀器廠);FA2204B萬分之一電子天平(上海精密科學儀器有限公司);Agilent-NMR-inova400超導核磁共振譜儀;HP6890/5975C GC/MS聯用儀(美國安捷倫公司)。

1.2.2 試劑

石油醚(60～90℃)、甲醇、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、二甲亞砜(DMSO)均為市售分析純試劑,薄層層析硅膠、柱層析硅膠均為青島海洋化工廠產品,重蒸水。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取分離方法

將多花木藍籽1.0 kg粉碎(過20目篩),用5 000 mL石油醚超聲提取2 h,過濾,濾渣重復用5 000 mL石油醚提取2次,合并提取液,回收溶劑后得浸膏153.0 g。稱取150 g樣品進行一級柱層析,硅膠(100～200目),柱層析(80 mm×1 200 mm),以石油醚∶二氯甲烷(10∶0,9∶1,8∶2,7∶3,6∶4,5∶5,0∶10)為流動相梯度洗脫,每300 mL收集1份,TLC檢測,合并后得到A-1(1.345 2 g)、A-2(4.365 4 g)、A-3(14.368 4 g)、A-4(5.351 0 g)、A-5(6.315 2 g)、A-6(18.321 0 g)、A-7(33.234 1 g)、A-8(32.651 2 g)、A-9(5.324 6 g)、A-10(3.624 5 g)、A-11(2.369 4 g)、A-12(3.365 4 g)、A-13(1.365 2 g)。活性測試結果顯示A-4和A-5具有抑菌活性,故采用二級柱層析分離A-4和A-5流分。準確稱取A-4流分5.000 0 g,硅膠(200～300目),柱層析(20 mm×450 mm),以石油醚∶乙酸乙酯10∶1為流動相,每30 mL收集1份,TLC檢測,得到化合物1(1.635 2 g)。準確稱取A-5流分6.000 g,硅膠(200～300目),柱層析(20 mm×450 mm),以石油醚∶丙酮10∶2為流動相,每30 mL收集1份,TLC檢測,得到化合物2(1.534 6 g)。測試化合物1和 2的抑菌活性。

1.3.2 抑菌活性測試方法

抑制真菌活性測試:將一級柱層析各流分樣品用一定量的DMSO溶解,再以PDA滅菌培養基稀釋成 2 000 mg/L的濃度,采用生長速率法測定其活性[6]。用十字交叉法測量菌落直徑,計算菌絲生長抑制率。

菌落生長直徑(mm)=3次直徑平均值 -

菌餅直徑(4.0 mm);

菌絲生長抑制率(%)=

抑制細菌活性測試:將一級柱層析各流分樣品溶解在適量DMSO中,加入少許吐溫-80,加水稀釋使DMSO含量為2.5%,使各流分濃度為2 000 mg/L,采用牛津杯法測試各流分抑制細菌活性[7]。用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

采用96孔板微量稀釋法測試純品抑制細菌的活性[8-9]：將供試樣品以DMSO溶解,再以水稀釋至2 000 mg/L的質量濃度,MHB肉湯培養基進行2倍稀釋,使得DMSO含量為2.5%,以無菌水為陰性對照。無菌培養液和2.5% DMSO溶液為空白對照。微孔板振蕩混合后,置于37℃培養箱內培養18 h后觀察結果,肉湯沒有渾濁的孔中的最低藥液質量濃度為樣品對供試細菌的最低抑菌質量濃度(MIC),取沒有渾濁的孔中的肉湯,接種于未加藥的培養基平板上,37℃培養12 h后取出觀察,沒有細菌生長的最低藥液質量濃度為樣品對供試菌的最低殺菌質量濃度(MBC)。所有活性測定均重復3次。

2 結果與分析

2.1 一級柱層析各流分抑菌活性測試結果

一級柱層析各流分抑制真菌生長活性測試結果顯示A-4、A-5對測試菌具有一定的抑制作用,其余流分均沒有顯示出抑制活性。A-4、A-5流分對真菌生長的抑制活性結果見表1。當樣品濃度為2 000 mg/L時,2個樣品在3 d 和7 d 后的抑菌活性沒有明顯的區別,其中對梨黑星病菌的活性最高,3 d 的抑制率分別為77.66%和75.29%,7 d 的抑制率分別為74.67%和73.41%,對其他植物病原菌的活性在不同時間段的活性均相當。

表1 A-4和A-5流分對真菌生長的抑制活性1)

Table 1 Fungistatic activity of A-4 and A-5 fractions of the chromatography

菌種 Fungus抑制率/%(3d) Inhibitionratio(3d)A-4A-5抑制率/%(7d) Inhibitionratio(7d)A-4A-5稻瘟病菌Magnaporthegrisea61.24±0.0665.28±0.0663.88±0.0665.29±0.12辣椒枯萎病菌Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum63.61±0.0663.61±0.1259.13±0.0664.52±0.10油菜菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum68.19±0.0666.34±0.1565.94±0.0664.00±0.06梨黑星病菌Venturiapyrina77.66±0.1575.29±0.1074.67±0.7573.41±0.17

1) 表中數據為3次重復的平均值±標準誤。 Data are mean±SE from 3 replications.

一級柱層析各流分抑制細菌活性測試結果與抑制真菌生長活性相似,A-4、A-5具有一定的抑菌活性,其余流分均沒有顯示出抑制活性。A-4、A-5流分對細菌的抑制活性見表2。當樣品濃度為2 000 mg/L時,A-5流分對青枯菌的抑菌圈直徑最大,為1.66 cm,A-4流分對金黃葡萄球菌的抑菌圈直徑最小,為1.16 cm。

表2 A-4和A-5流分對細菌的抑制活性1)

Table 2 Antibacterial activity of A-4 and A-5 fractions of the chromatography

菌種Bacterialstrain抑菌圈直徑/cmDiameterofinhibitionzoneA-4A-5青枯菌Ralstoniasolanacearum1.37±0.151.66±0.12大腸桿菌Escherichiacoli1.37±0.061.37±0.12金黃葡萄球菌Staphyloccocusaureus1.16±0.151.20±0.17綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa1.43±0.151.27±0.21枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis1.33±0.061.47±0.21

1) 表中數據為3次重復之平均值±標準誤。 Data are mean±SE of 3 replications.

2.2 化合物1和2抑制細菌活性測試結果

化合物1和2抑制細菌活性測試結果見表3,由表可知,化合物1和2均具有較弱的抑菌和殺菌活性。2個化合物對金黃葡萄球菌的活性均最好,MIC和MBC值均為250 mg/L和500 mg/L,對其他測試菌的MIC和MBC值均為500 mg/L和1 000 mg/L。

2.3 化合物1和2的結構

表3 化合物1和2對細菌的抑制活性測試結果

Table 3 The antibacterial activity of compound 1 and 2

菌種Bacterialstrain硫酸慶大霉素Gentamicinsulphate最小抑菌濃度/mg·L-1Minimuminhibitoryconcentration最小殺菌濃度/mg·L-1Minimumbactericidalconcentration化合物1Compound1最小抑菌濃度/mg·L-1Minimuminhibitoryconcentration最小殺菌濃度/mg·L-1Minimumbactericidalconcentration化合物2Compound2最小抑菌濃度/mg·L-1Minimuminhibitoryconcentration最小殺菌濃度/mg·L-1Minimumbactericidalconcentration青枯菌Ralstoniasolanacearum255050010005001000大腸桿菌Escherichiacoli1.563.1250010005001000金黃葡萄球菌Staphyloccocusaureus3.126.24250500250500綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa1.563.1250010005001000枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis1.566.2450010005001000

化合物1結構見圖1,其波譜數據與文獻一致[10], 名稱為6,8,11-三甲基十二酸(2E)-3′-甲基-十六-2-烯酯,分子式為C32H62O2,該化合物首次從多花木藍中分離得到。

圖1 化合物1和2的化學結構圖Fig.1 Structures of compounds 1 and 2

化合物2結構見圖1,其波譜數據與文獻一致[10], 名稱為17,18,19-三甲基十六酸(2E)-3′-甲基-十六-2-烯酯,分子式為C36H70O2,該化合物首次從多花木藍中分離得到。

3 討論

多花木藍籽石油醚提取物濃度為4 000 mg/L時,其對多種植物病原真菌表現出較好的抑菌活性,抑制率均可達到70%以上[5]。一級柱層析后,當A-4、A-5流分濃度為2 000 mg/L時,除梨黑星病菌外,對其他測試菌的抑制率均低于70%。一級柱層析后,活性化合物集中于A-4和A-5流分,然而其活性并未有顯著的提高。另外,2個酯類的活性化合物的MIC和MBC值也主要集中在500 mg/L和1 000 mg/L,其抑菌活性較弱。推測可能多花木藍籽石油醚提取物中存在一些具有增效作用的化合物,隨著分離程度的提高,增效物質的含量降低,故其抑菌活性也降低,但是其具體的原因還有待進一步驗證。

本試驗前期曾報道了豆科植物多花木藍籽石油醚提取物具有一定的抑菌活性[5],在此基礎上,本實驗室在活性追蹤下分離出2個酯類活性化合物,它們的化學結構較簡單,但其表現出的抑菌活性較弱,故改造其化學結構,以期提高抑菌活性,是本課題組下一步將要研究的內容。

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(責任編輯：田 喆)

Antimicrobial constituents ofIndigoferaamblyantha

Su Sheng1, Zhang Li1, Du Wenlin2, Hu Hualin3, Yang Hua4, Shen Ling5, Han Yongfen1, Li Yan3

(1.GuizhouInstituteofPrataculture,Guiyang550006,China; 2.SchoolofPharmacyofGuizhouMedicalUniversity,Guiyang550025,China; 3.TheKeyLaboratoryofChemistryforNaturalProductsofGuizhouProvinceandChineseAcademyofSciences,Guiyang550002,China; 4.SchoolofChemical&ChemicalEngineering,Yan’anUniversity,Yan’an716000,China; 5.SchoolofEnvironmentalandChemicalEngineering,Xi’anPolytechnicUniversity,Xi’an710048,China)

Antimicrobial constituents of the seeds ofIndigoferaamblyanthaCraib were isolated by using bioactivity-guided fractionation. The antimicrobial activity assays were designed against the fungiMagnaporthegrisea,Fusariumoxysporum，SclerotiniasclerotiorumandVenturiapyrinaby using the hyphal growth inhibition method and the bacteriaRalstoniasolanacearum,Escherichiacoli,Staphyloccocusaureus,PseudomonasaeruginosaandBacillussubtilisby using the disc method. The results showed that A-4 and A-5 fractions had higher bioactivity than others. Their inhibition ratios againstV.pyrinawere 77.66% and 74.67 %, respectively. The diameters of inhibition zone againstR.solanacearumwere 1.37 cm and 1.66 cm, respectively. Two compounds with antimicrobial activity were isolated and elucidated as Balansenate Ⅰ and Ⅱ mainly by1H and13C NMR spectral data. The results of bioassay showed that the MIC values and the MBC values of the two compounds againstS.aureuswere 250 and 500 mg/L, respectively.

Indigoferaamblyantha; antimicrobial activity; antimicrobial compound

2016-02-22

2016-03-29

貴州省自然科學基金(黔科合J字[2013]2154號);西安工程大學博士科研啟動項目(BS1310)

S482.2 92

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.020

* 通信作者 E-mail:liyan1612@163.com