番茄青枯病病原菌拮抗菌株的篩選及其田間防控作用研究

王麗麗, 周旭東, 李國安, 姚紅燕, 汪 峰

(1.寧波市農業科學研究院,寧波 315040; 2.寧波致富寶生物科技有限公司,寧波 315324)

番茄青枯病病原菌拮抗菌株的篩選及其田間防控作用研究

王麗麗1, 周旭東2, 李國安1, 姚紅燕1, 汪 峰1

(1.寧波市農業科學研究院,寧波 315040; 2.寧波致富寶生物科技有限公司,寧波 315324)

從番茄青枯病發病嚴重田塊的健康植株根際土壤中分離篩選得到2株高效拮抗菌株,命名為W12和W118,經16S rDNA基因鑒定均屬芽胞桿菌屬;用PCR擴增的方法擴增脂肽類抗生素合成基因,結果表明W12和W118含有合成bacillomycin、iturin和fengycin三種抗生素的基因;將2株拮抗菌用于田間試驗,結果表明混合菌株防控效果最好,3次灌菌后防控效果達到62.3%,單獨施用菌株W118較單獨施用W12防控效果好,3次灌菌后防控效果達到56.7%。

番茄青枯病; 拮抗菌; 抗生素合成基因

青枯病是一種滅絕性的土傳細菌病害,它是由茄科勞爾氏菌Ralstoniasolanacearum入侵植株根部組織而引起的,其大規模分布于熱帶、亞熱帶以及溫帶地區,在我國南方地區番茄上最為流行[1-2]。該病可造成被侵染作物大面積萎蔫直至死亡,發病嚴重的田塊青枯病的發病率高達80%以上,使得番茄產量急劇下降,嚴重制約了我國南方地區番茄產業的發展。

目前防控番茄青枯病常用的方法主要有:施用化學農藥、利用土壤改良劑、選育具有抗病性能的品種、嫁接及與禾本科作物輪作等,但效果均不穩定[3-4]。此外,施用化學農藥還會引起一系列的環境污染和食品安全問題。因此生物防治將會是一條環保、經濟、有效的防控途徑。

番茄青枯病的生物防治主要是應用拮抗微生物及其代謝產物來控制病原菌。從土壤中分離篩選到高效拮抗病原微生物的拮抗菌是生物防治成功的前提。芽胞桿菌產生的芽孢具有耐高溫性,而且還能在輻射、高酸堿等逆境下存活,因此,篩選出高效拮抗芽胞桿菌備受重視。丁傳雨等[5]用篩選得到的2株芽胞桿菌的菌液防控馬鈴薯青枯病,防控效果分別為85.1%和82.1%。鄭新艷等[6]用篩選得到的拮抗菌株防控馬鈴薯青枯病,發現其不但能夠有效拮抗青枯菌,還能提高馬鈴薯根系土壤微生物的多樣性,有助于克服土壤連作障礙。本試驗篩選和分離得到2株抑制番茄青枯病菌的高效芽胞桿菌菌株,并對其進行了分子鑒定和拮抗基因的擴增,檢測了拮抗菌的田間效果,旨在為番茄青枯病的生物防治工作提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試土壤

分別從寧波奉化、鄞州、江北、寧海、余姚、慈溪等青枯病發病嚴重地塊采集健康植株根際土壤35份。將植株連同根系一起連根拔起,輕輕地抖動,待植株根部大部分土壤被抖落后,將剩下緊貼根部的土壤連同須根一起收集起來,用自封袋裝好,放入4℃冰箱保存。

1.1.2 供試菌株和培養基

青枯病菌菌株為由本實驗室篩選、鑒定、保存的一株茄科勞爾氏菌。

牛肉膏蛋白胨改良培養基(NA):每1 000 mL培養基中加葡萄糖10 g,蛋白胨5 g,酵母粉0.5 g,牛肉膏3 g,瓊脂粉15 g,pH 7.0。

1.2 拮抗菌株的分離、篩選

10 g健康番茄植株根際土壤投入裝有90 mL ddH2O的錐形瓶中,在30℃搖床上劇烈振蕩30 min,靜置30 min。取上清液系列稀釋涂布于改良牛肉膏蛋白胨培養基上,每個梯度設置3次重復,放置于30℃恒溫培養箱內培養24 h后,用喉頭噴霧器將濃度為1.0×108cfu/mL青枯菌菌懸液噴于其表面,待平板上顯現明顯的抑菌圈后,用接種針選取有抑菌圈,且形態不同的菌落,在新的平板上進行畫線純化。

在改良牛肉膏蛋白胨培養基上用滅菌牙簽接種純化后的菌株,放置于30℃恒溫培養箱內培養12 h,將1.0×108cfu/mL的青枯病菌菌液均勻噴灑于平板上,48 h后測定抑菌圈直徑,每個菌株設置3次重復,選擇抑菌圈大于15 mm的菌株保存備用。

1.3 菌株16S rDNA鑒定

用市售細菌基因組DNA提取試劑盒提取拮抗菌株W12和W118的基因組DNA,采用細菌16S rDNA 基因的通用引物:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和3′-TACCTTGTTACGACTT-5′進行PCR擴增。反應程序設置如下:94℃ 5 min;94℃ 60 s,53℃60 s,72℃ 2 min,設置35個循環;72℃ 7 min;4℃保持10 min。PCR反應后的凝膠產物經試劑盒回收純化后進行測序分析,測序工作由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1.4 拮抗菌株基因組DNA中脂肽類抗生素合成基因的PCR檢測

采用PCR法檢測拮抗菌株基因組DNA中編碼脂肽類抗生素合成的基因。檢測的抗生素基因名稱、引物及其片段大小詳見表1。PCR反應體系如下:10×Taqbuffer 2.5 μL,25 mmol/L Mg2+1.5 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 1.5 μL,25 pmol/μL上下游引物各2 μL,細菌基因組DNA 1 μL, 5 U/μLTaqDNA 聚合酶0.5 μL,ddH2O 14 μL,總體積25 μL。反應程序:95℃ 5 min;95℃ 60 s, 55℃ 30 s, 72℃ 105 s, 35個循環；72℃ 10 min, 4℃保持10 min。

1.5 田間試驗設計

田間試驗在寧波市鄞州區橫溪基地內進行。以1.2小節篩選出的拮抗效果較好的菌株為供試菌株,菌株發酵液濃度為108cfu/mL。于番茄移栽后1個月(幼苗期)開始施用拮抗菌株發酵液,每隔7 d施用1次,共計4次。每株番茄苗澆灌10 mL,其中混合菌澆灌總共為10 mL。每個處理3次重復,以施用等量清水為對照。

1.6 病情調查

試驗開始前調查并記錄各處理番茄植株的發病情況,選擇病情大致相同的區域進行試驗,之后每次灌菌后統計各處理的病情指數和防控效果。根據植株葉片萎蔫程度,將發病級別分5級[7]:0級,植株正常;1級,植株葉片萎蔫程度不超過25%;2級,植株葉片萎蔫程度超過25%且不超過50%;3級,植株葉片萎蔫程度超過50%且不超過75%;4級,植株葉片萎蔫程度超過75%。

表1 基因名稱及引物序列

Table1 Name of gene and primer sequence

基因名稱Nameofgene拮抗物質Antibiotics引物名稱Primer引物序列(5'-3')Primersequence片段大小/bpLengthfenBfengycinFenB(正向)CTATAGTTTGTTGACGGGCTC1400FenB(反向)CAGCACTGGTTCTTGTCGCAituAiturinItuA(正向)ATGTATACCAGTCAATTCC1100ItuA(反向)GATCCGAAGCTGACAATAGituBiturinItuB(正向)TAAAGCAGCGGATAAAGCGT 874ItuB(反向)AATGGCGACTAACGTATCGGituCiturinItuC(正向)CCGTAATCAACCGTCTCGTT 640ItuC(反向)GGGTGAGCTGCAAACTTCTCituDiturinItuD(正向)GATGCGATCTCCTTGGATGT 647ItuD(反向)ATCGTCATGTGCTGCTTGAGbambacillomycinBam(正向)AAGAAGGCGTTTTTCAAGCA 508Bam(反向)CGACATACAGTTCTCCCGGT

病情指數=∑(病級數×該病級植株數)/

(最大病級數×植株總株數)×100;

防控效果(%)=(對照組病情指數-

處理組病情指數)/對照組病情指數×100[7]。

1.7 數據分析

數據采用DPS 7.5軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 拮抗菌株的分離、篩選

從35份土樣中共分離篩選出121株平板菌落特征不同的拮抗菌株,其中28株有抑菌效果,經過多次純化復篩,其中W118與W12菌株抑菌效果最好,且比較穩定,W118拮抗圈直徑達到30 mm以上,W12菌株拮抗圈直徑為28 mm(圖1)。

圖1 拮抗菌株對茄科勞爾氏菌的平板抑制效果Fig.1 Inhibition of W12 and W118 against Ralstonia solanacearum on NA medium

2.2 拮抗菌株的16S rDNA鑒定

將菌株W12和W118的16S rDNA序列與GenBank數據庫中相關序列進行BLAST比對與分析,然后通過MEGA 5.1軟件采用neighbour-joining繪制系統發育樹(圖2)。分析結果顯示,拮抗菌株W12和W118的16S rDNA基因序列與跟其比對的100株芽胞桿菌屬細菌的同源相似性均在99%以上。其中W12與枯草芽胞桿菌B.subtilisDSM10 (AJ276351)的同源性最高,W118與解淀粉芽胞桿菌B.amyloliquefaciensDSM7 (NC014551)的同源性最高,因此,初步鑒定菌株W12和W118均屬于芽胞桿菌屬。

圖2 W12(a)和W118(b)與芽胞桿菌屬相關菌株基于16S rDNA基因序列的進化樹Fig.2 Evolutionary tree based on 16S rDNAsequences of strain W12(a), W118(b) and related strains of Bacillus sp.

2.3 拮抗菌株脂肽類抗生素合成基因的檢測與分析

通過PCR擴增法從拮抗菌株W12基因組序列中成功擴增出6個脂肽類抗生素合成基因,分別為Bam、ItuD、ItuC、ItuB、ItuA和FenB,這些基因分別為抗生素bacillomycin、iturin和fengycin的基因組成片段,其中ItuC擴增條帶較暗,可能與引物的保守性有關。菌株W118擴增出5個抗生素合成基因,分別是Bam、ItuD、ItuB、ItuA和FenB,對應的抗生素分別是bacillomycin、iturin和fengycin。由此可知,菌株W12和W118有合成bacillomycin、iturin和fengycin的潛力(圖3)。

2.4 拮抗菌株發酵液對番茄青枯病田間防控效果

通過表2知,在田間施用拮抗菌株發酵液能有效抑制番茄青枯病的發生。W12和W118能顯著降低番茄青枯病發病率,1次灌菌后的防效分別達到19.3%和34.3%,兩菌混合的防效達到37.7%,灌菌3次后的防控效果最好,其中兩菌混合防效為62.3%,W118的防控效果略低,為56.7%。

圖3 拮抗菌株W12和W118基因組DNA中部分脂肽類抗生素合成基因的PCR擴增產物Fig.3 PCR amplification of antagonistic genes in W12 and W118

處理Treatment1次灌菌后The1stapplicationofstrains病情指數Diseaseindex防控效果/%Controleffect2次灌菌后The2ndapplicationofstrains病情指數Diseaseindex防控效果/%Controleffect3次灌菌后The3rdapplicationofstrains病情指數Diseaseindex防控效果/%ControleffectW118(7.3±1.5)a(34.3±5.1)a(8.7±0.6)bc(49.0±8.6)a(9.3±1.5)b(56.7±4.1)aW12(9.0±1.7)a(19.3±7.8)b(12.0±1.0)b(29.7±9.1)b(13.0±2.7)b(39.7±3.1)bW12+W118(7.0±1.7)a(37.7±3.8)a(7.7±2.1)c(56.0±5.6)a(8.3±3.2)b(62.3±4.8)aCK(11.3±3.2)a-(17.3±3.2)a-(21.7±5.5)a-

1) 表中數據為平均值±標準差。同列中不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。 Data in the table are mean±SD.Different small letters in the same column indicate significant difference at 0.05 level.

3 討論

茄科勞爾氏菌寄主廣泛,可以侵染200多種植物,涉及50多個科屬,其中以南方地區番茄、馬鈴薯以及煙草等作物受害最為嚴重[8]。生物防治是防控青枯病最為有效的途徑,目前主要是利用微生物對其進行防控。本試驗從寧波本地番茄青枯病發病嚴重田塊的健康植株根際土壤中通過平板對峙試驗分離篩選到2株拮抗菌株W12和W118,對番茄青枯菌都具有高效且穩定的抑菌作用。2個拮抗菌株是從植株根際處直接篩選而獲得的,對植物本身具有很強的親和能力,在植株根部接種后更易于在根際定殖存活。

利用生物防治手段防控番茄青枯病主要是利用生防菌在其生長發育過程中產生多種類型的具有拮抗性的代謝產物,其與植物通過直接或者間接作用達到抑制甚至殺死病原微生物的效果[9]。本試驗從W12和W118菌株中均能擴增得到bacillomycin、iturin和fengycin抗生素合成基因,說明其均有產生多種拮抗性代謝產物的潛力,能夠有效地抑制病原菌的生長。

有效控制田間番茄青枯病的發生是生物防治的最終目的,本試驗將篩選出的兩株高效拮抗菌經發酵后用于田間,其中單一菌株W118和W12在3次灌菌后的防控效果分別達到56.7%和39.7%,混合菌株在3次灌菌后的防控效果達到62.3%,說明在田間施用拮抗菌對番茄青枯病有較好的防控效果。

[1] Tan Hongming, Zhou Shining, Deng Zujun, et al. Ribosomal-sequence-directed selection for endophytic streptomycete strain antagonistic toRalstoniasolanacearumto control tomato bacterial wilt [J].Biological Control, 2011, 59(2):245-254.

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[7] 方中達.植病研究方法[M].第3版.北京:中國農業出版社,1998.

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(責任編輯：楊明麗)

Screening and identifying of antagonistic bacteria againstRalstoniasolanacearumand the control effects on tomato bacterial wilt in the field

Wang Lili1, Zhou Xudong2, Li Guoan1, Yao Hongyan1, Wang Feng1

(1.NingboAcademyofAgriculturalSciences,Ningbo315040,China; 2.NingboZhifubaoBiologicalScienceandTechnologyCo.,Ltd,Ningbo315324,China)

Bacterial strains W12 and W118, isolated from the rhizosphere soil of tomato in Ningbo，could antagonize againstRalstoniasolanacearum. Based on the 16S rDNA sequence analysis, W12 and W118 were preliminarily identified asBacillusspp. The genes responsible for biosynthesis of bacillomycin, iturin and fengycin were identified in both W12 and W118 strains by PCR amplification. The field trials showed that the control effect of mixed bacterial suspension of W12 and W118 reached 62.3% after irrigations for three times, while when used alone,the control effect of strain W118 was 56.7%, which was better than that of strain W12.

tomato bacterial wilt; antagonist bacteria; antibiotic biosynthesis genes

2016-01-28

2016-03-23

寧波市科技局一般攻關項目(2014C10051)

S 144.9

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.033

聯系方式 E-mail: wanglili531@163.com