山東煙臺地區發生番茄斑萎病毒病危害

李 潔, 遲勝起, 楊勤民, 丁天波, 褚 棟*

(1. 青島農業大學農學與植物保護學院,山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室, 青島 266109; 2. 山東省植物保護總站, 濟南 250100)

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山東煙臺地區發生番茄斑萎病毒病危害

李 潔1, 遲勝起1, 楊勤民2, 丁天波1, 褚 棟1*

(1. 青島農業大學農學與植物保護學院,山東省植物病蟲害綜合防控重點實驗室, 青島 266109; 2. 山東省植物保護總站, 濟南 250100)

番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltvirus(TSWV)是我國進境植物檢疫性有害生物,近年來相繼在國內一些省份發現。利用TSWV的通用引物NF302/NR575對從山東煙臺地區收集的15份疑似感染番茄斑萎病毒病的番茄樣品進行檢測;進一步對特異引物TSWV-NF2037/TSWV-NR2825擴增的TSWV的N基因序列克隆、測序,并對N基因片段編碼氨基酸進行遺傳距離及系統發育分析。結果表明,15份疑似樣品中有4個樣品擴增得到TSWV病毒片段;基于N基因序列分析發現,山東TSWV番茄分離物與云南TSWV番茄分離物(AEI70836.1)的遺傳距離最近，為0.8%,且與云南TSWV番茄分離物聚為一支。這是山東地區首次利用分子標記證實番茄斑萎病毒病的危害。

番茄斑萎病毒; RT-PCR檢測; 系統發育分析; 山東省

番茄斑萎病毒Tomatospottedwiltvirus(TSWV)隸屬布尼亞病毒科Bunyaviridae番茄斑萎病毒屬Tospovirus。該病毒于1915年首次在澳大利亞發現[1],現已在多個國家和地區被報道。TSWV多在熱帶、亞熱帶與溫帶地區發生危害,其寄主范圍廣泛,可侵染番茄、辣椒、萵苣、煙草、大豆、花生等85個屬的1 090種植物[2]。十九世紀八九十年代該病曾暴發流行,給美國夏威夷、意大利等地的番茄、萵苣等作物生產造成毀滅性危害,目前已被列為世界上危害最大的十種植物病毒之一[3]。我國最早于1944年在成都地區的番茄上發現番茄斑萎病毒,隨后在四川[4]、廣東[5]、云南[6]、北京[7]、天津[8]、寧夏[9]等地相繼發現。近些年,該病毒在中國部分地區的危害逐漸加重,基于對該病毒的危險評估,我國于2007年將TSWV列為進境植物檢疫性有害生物。

番茄斑萎病毒為三基因組單鏈RNA病毒,基因組由L RNA、M RNA和S RNA三個單鏈RNA組成,L RNA的互補鏈編碼依賴于RNA的RNA復制酶(RdRp)[10-11],M RNA的互補鏈編碼非結構蛋白(non-structural protein, NSm),S RNA的互補鏈編碼核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, N)[10]。該病毒主要由薊馬以持久增殖方式傳毒。薊馬僅在若蟲期獲毒,獲毒若蟲羽化為成蟲后傳毒,獲毒薊馬終生帶毒,但不能經卵傳遞給后代[12-14]。在我國,田間傳播TSWV的薊馬主要有西花薊馬Frankliniellaoccidentalis、花薊馬F.intonsa、煙薊馬Thripstabaci和棕櫚薊馬T.palmi等[15]。除此之外,TSWV可以通過種子、嫁接、摩擦傳毒的方式進行傳播[16-17]。

番茄斑萎病毒侵染不同寄主及作物品種后所呈現的癥狀各不相同,常見的癥狀為被害植株生長遲緩、矮化;葉片上產生褐色或黃色的環斑或線紋斑,有的葉片產生壞死斑,葉片下垂或萎蔫;葉柄、莖稈上產生壞死條紋;果實上出現褐色輪紋斑或壞死斑,壞死斑部位組織變硬,果實易脫落,壞死嚴重時,可導致植株死亡[9, 18]。此外,感病后的植物果實大小、風味等也會受到影響,嚴重影響其市場價值。

近年來,隨著地區間貿易的加強,TSWV在我國呈擴散趨勢,做好TSWV的檢驗檢疫、預警工作勢在必行。本研究對山東省煙臺部分設施蔬菜種植地區的番茄進行了TSWV抽樣調查,通過RT-PCR的方法檢測到TSWV(已報告植物檢疫機構進行調查處理)。隨后又利用TSWV S RNA核酸序列的特異引物,對調查樣品的TSWV的N基因進行了克隆測序和比對分析。

1 材料與方法

1.1 田間采集材料

供試植物:在山東煙臺照旺莊鎮的設施番茄大棚中觀察到大量番茄果實上出現壞死斑,部分葉片出現褪綠癥狀,經初步調查，表現該癥狀的植株占5%～10%。于2016年5月采集疑似感染TSWV的番茄果實樣品共15份,置于-80℃冰箱保存備用。以云南省農業科學院丁銘和尹艷瓊提供的番茄斑萎病毒冷凍樣本為陽性對照,以健康番茄為陰性對照。

1.2 試劑儀器

試劑及儀器:植物RNA提取試劑為TRIzol,美國英杰生命技術有限公司;瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒,凱杰生物技術(上海)有限公司;PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser反轉錄試劑盒(TaKaRa:RR047a)、載體pMD18-T、連接酶、大腸桿菌感受態細胞DH5α、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker,寶生物工程(大連)有限公司;其余試劑均為國產分析純。PCR儀,寶生物工程(大連)有限公司;凝膠成像系統、電泳儀,美國Bio-Rad公司。

1.3 樣品RNA的提取及TSWV通用引物檢測

提取15個待測番茄樣品及2個對照樣品的總RNA,每個樣品稱取0.1 g,使用TRIzol試劑,參考說明書提取各樣品的總RNA。每樣品取2 μg總RNA,按照反轉錄試劑盒說明書進行反轉錄。首先去除基因組DNA:在冰上配制10.0 μL的反應體系(5×基因組DNA酶緩沖液 2.0 μL,基因組DNA酶 1.0 μL,總RNA 7.0 μL),于42℃反應2 min后將樣品立即置于冰上;然后反轉錄：冰上配制20.0 μL的反應體系(反應溶液 10.0 μL,5×反轉錄酶緩沖液 4.0 μL,反轉錄酶混合物 1.0 μL,反轉錄引物混合物 1.0 μL,無RNA酶ddH2O 4.0 μL),37℃ 15 min,85℃ 5 s,-20℃保存。

采用TSWV檢測通用引物NF302:5′-GGGTCAGGCTTGTTGAGGAAAC-3′和NR575:5′-TTCCCTAAGGCTTCCCTGGTG-3′[19]對供試樣品進行RT-PCR檢測,確認樣品是否攜帶TSWV,陽性樣品預期PCR擴增產物大小為273 bp。PCR擴增產物使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

1.4 N基因PCR擴增產物的擴增與克隆測序

利用TSWV特異引物TSWV-NF2037: 5′-CTGCTTTTAAGCAAGTTCTGC-3′與TSWV-NR2825: 5′-ATCATCATGTCTAAGGTTAAGCTC-3′(由浙江大學謝艷課題組提供)擴增TSWV的核衣殼蛋白N基因,預期PCR擴增產物大小為789 bp。PCR擴增程序:95℃預變性5 min;94℃變性40 s,50℃退火40 s,72℃延伸1 min,35個循環;72℃延伸10 min;4℃反應10 min。PCR擴增產物使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測并拍照。

參照瓊脂糖凝膠DNA純化回收試劑盒說明,將N基因PCR擴增產物回收克隆到載體pMD18-T上,轉化大腸桿菌DH5α,涂布于含有氨芐青霉素、X-gal和IPTG的LB培養基上,篩選出的陽性克隆送青島擎科梓熙生物技術有限公司測序。

1.5 基于N基因編碼蛋白進行TSWV遺傳距離及系統發育分析

利用ExPASy蛋白在線翻譯工具(http:∥web.expasy.org/translate/)對測定的N序列進行蛋白翻譯,將N基因的蛋白序列在GenBank進行Blastp比較,利用DNAMAN 5.0將本研究中TSWV分離物N蛋白序列(編號為China-Shandong Tomato ANQ91902.1),與國內外不同地區有代表性的番茄斑萎病毒的N蛋白序列[20]進行相似性比對,包括:中國云南番茄TSWV分離物(編號為China-Yunnan Tomato AEI70836.1)、日本TSWV分離物(編號為Japan BAC05686.1)、韓國紅辣椒TSWV分離物(編號為Korea Paprika BAD51472.1)、韓國番茄TSWV分離物(編號為Korea Tomato AEB33895.1)、保加利亞煙草TSWV分離物(編號為Bulgaria Tabacco BAA03025.1)、保加利亞煙草TSWV分離物(編號為Bulgaria Tobacco CAD11444.1)、西班牙番茄TSWV分離物(編號為Spain Tomato AAU95407.1)、美國加利福尼亞毛茛屬植物TSWV分離物(編號為USA-California Buttercup AAU95387.1)、美國加利福尼亞菊花TSWV分離物(編號為USA-CaliforniaChrysanthemumAAU95391.1)、美國加利福尼亞大麗花TSWV分離物(編號為USA-CaliforniaDahliaAAU95397.1)、美國科羅拉多Falso lulo TSWV分離物(編號為USA-Colorado Falso lulo AAU95399.1)。根據Kimura-2-parameter模型計算出山東番茄上的TSWV分離物N基因編碼蛋白與已知TSWV的N基因編碼蛋白進化分歧矩陣。進化樹構建采用MEGA 5.05軟件,以鄰接法(neighbor-joining,NJ)構建,進化樹各分支的置信度用Bootstrap檢測(1 000次重復)。

2 結果與分析

2.1 田間病害癥狀

山東煙臺地區疑似感染TSWV的番茄植株,通常葉片產生亮黃色或褐色的壞死斑,整個植株矮化,生長遲緩(圖1a)。果實上出現褐色壞死斑,壞死斑部位組織變硬,果實易脫落(圖1b),壞死嚴重時,可導致植株死亡。

圖1 田間疑似感染TSWV的番茄癥狀Fig.1 Symptoms of tomato plant with suspected TSWV infection in the field

2.2 供試番茄樣品中TSWV的檢測

用NF302/NR575引物對供試15個樣品進行RT-PCR檢測,其中4個番茄樣品擴增得到270 bp左右的特異條帶(圖2),經測序比對,擴增出的特異條帶與GenBank中的TSWV序列相似性均達到99.0%以上,表明所擴增到的基因片段屬于TSWV,所測樣品中的TSWV檢出率為26.7%。

圖2 利用TSWV通用引物NF302/NR575的番茄樣本RT-PCR檢測結果Fig.2 Detection results of tomato samples using the TSWV specific primers NF302/NR575 by RT-PCR

2.3 TSWV番茄分離物N基因的擴增結果

選取TSWV檢測為陽性的3個番茄樣品,采用TSWV-NF2037/ TSWV-NR2825引物擴增其N基因,得到780 bp左右的目的條帶(圖3),將條帶進行回收,連接轉化,測序所得序列經開放閱讀框軟件分析獲得777 bp的N基因編碼區序列,3個樣品的N基因同源性為100%。

2.4 基于N基因序列編碼氨基酸計算不同地區TSWV分離物之間的遺傳距離

用Kimura-2-parameter距離模型計算本研究國內外不同地區TSWV分離物的進化分歧,得到進化分歧矩陣(表1)。發現國內外不同地區TSWV的遺傳距離均小于4.0%,山東煙臺番茄上TSWV與國內外其他地區蔬菜上的TSWV的遺傳距離均小于2.5%,且山東煙臺番茄上TSWV與云南番茄上TSWV的遺傳距離最近，為0.8%。

2.5 基于N基因編碼蛋白進行TSWV進化分析

將山東煙臺番茄上的TSWV與國內外部分地區的TSWV的核衣殼蛋白氨基酸序列繪制成系統進化樹,進化樹表明山東煙臺番茄TSWV分離物(China-Shandong Tomato ANQ91902.1)與云南番茄TSWV分離物(China-Yunnan Tomato AEI70836.1)、日本TSWV分離物(Japan BAC05686.1)、韓國紅辣椒TSWV分離物(Korea Paprika BAD51472.1)和韓國番茄TSWV分離物(Korea Tomato AEB33895.1)聚在同一分支(圖4),且山東煙臺番茄TSWV分離物與云南番茄TSWV分離物的遺傳距離最近,置信度為59。

圖3 山東煙臺地區設施番茄樣品TSWV N基因的擴增結果Fig.3 Amplification of N gene of TSWV from tomato in the greenhouse in Yantai, Shandong

1234567 89101112120.00830.0120.01940.0160.0230.01950.0120.0190.0160.00460.0160.0230.0190.0160.01970.0190.0270.0230.0190.0230.00480.0120.0190.0230.0190.0230.0040.00890.0120.0190.0230.0190.0230.0120.0160.008100.0120.0190.0230.0190.0230.0120.0160.0080.000110.0120.0190.0230.0190.0230.0120.0160.0080.0000.000120.0230.0270.0350.0310.0350.0160.0190.0120.0120.0120.012

1) 中國山東番茄ANQ91902.1;2:中國云南番茄AEI70836.1;3:日本 BAC05686.1;4:韓國紅辣椒BAD51472.1;5:韓國番茄AEB33895.1;6:保加利亞煙草BAA03025.1;7:保加利亞煙草CAD11444.1;8:西班牙番茄AAU95407.1;9:美國加利福尼亞毛茛屬植物AAU95387.1;10:美國加利福尼亞菊花屬植物AAU95391.1;11:美國加利福尼亞大麗花屬植物AAU95397.1;12:美國科羅拉多Falso lulo AAU95399.1。 1: China-Shandong Tomato ANQ91902.1; 2: China-Yunnan Tomato AEI70836.1; 3: Japan BAC05686.1; 4: Korea Paprika BAD51472.1; 5: Korea Tomato AEB33895.1; 6: Bulgaria Tobacco BAA03025.1; 7: Bulgaria Tobacco CAD11444.1; 8: Spain Tomato AAU95407.1; 9: USA California Buttercup AAU95387.1; 10: USA CaliforniaChrysanthemumAAU95391.1; 11: USA CaliforniaDahliaAAU95397.1; 12: USA Colorado Falso lulo AAU95399.1.

3 結論與討論

番茄斑萎病毒(TSWV)是番茄、辣椒等蔬菜上重要的病毒,是我國重要入侵生物之一,目前已在四川、云南、貴州和廣州地區危害嚴重,造成了重大經濟損失,所以對TSWV的監測工作顯得尤為重要。為了做好山東地區TSWV的監測工作,防患于未然,本課題組對山東煙臺地區疑似TSWV感染植株(植株矮化,生長遲緩,果實上出現褐色壞死斑,壞死斑位置組織變硬,果實易脫落)進行了檢測,結果在這些番茄樣品中檢測到了該病毒,證實TSWV已在山東煙臺地區發生,其潛在威脅應引起足夠重視。

根據山東TSWV番茄分離物N蛋白序列構建的系統進化樹顯示,山東煙臺地區設施番茄樣品的TSWV序列與云南番茄上TSWV分離物(China-Yunnan Tomato AEI70836.1)處于同一分支,且上述兩個地區遺傳距離最近(0.8%)。另外,隨著經濟全球一體化推進,中國與世界其他國家的進出口貿易頻繁進行,加速了入侵生物的傳播與擴散。通過本研究發現,山東煙臺地區TSWV分離物與韓國TSWV分離物(Korea Tomato AEB33895.1)、日本TSWV分離物(Japan BAC05686.1)處于進化樹的同一大支,且與上述兩個地區的TSWV的遺傳距離較小,均為1.2%,表明上述三地區TSWV分離物的親緣關系較近。因此推測上述地區的TSWV可能具有相同的入侵來源,具體情況有待進一步研究。

圖4 TSWV不同分離物N蛋白氨基酸序列的系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of different TSWV isolates based on amino acid sequences of N proteins

本研究中TSWV發生田塊所使用的番茄種子是農戶從網上購買,存在一定風險。另外,農戶自己育苗,育苗過程中操作不規范,也可能感染病毒。因此,農戶在購買種苗時,盡量選購通過國家和省級審定的知名品牌的種子,科學育苗,從種苗上降低病毒病發生的風險。另外,TSWV的媒介昆蟲及種苗及時監測也是控制該病害的重要環節。

近些年邱樹亮等在山東壽光發現TSWV病害,部分大棚和溫室番茄受損[21]。張安盛等在山東濟南等地菜椒植株上也發現了TSWV疑似植株[22]。上述研究表明山東地區存在TSWV發生、蔓延的潛在危險,需要引起相關部門的足夠重視。再者,TSWV主要通過薊馬進行傳播,其中西花薊馬和棕櫚薊馬是TSWV的重要傳毒媒介,兩種薊馬也是山東省田間的主要發生類型[23-25],伴隨著兩種薊馬在山東省范圍內的廣泛傳播和擴散,很可能助推TSWV的發生與流行。另外,TSWV的寄主范圍十分廣泛,重要的寄主植物有花生、大豆、辣椒、番茄等,而上述寄主植物亦為山東省主栽經濟作物品種,一旦TSWV發生流行,可能對山東省的農業造成嚴重的潛在危害。為此,建議有關部門立即采取相應的預防與管理措施,首先查明番茄斑萎病毒在山東地區的分布現狀,同時開展相應的控制技術研究,防止其擴散蔓延。

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(責任編輯：王 音)

Identification ofTomatospottedwiltvirusdisease in Shandong, China

Li Jie1, Chi Shengqi1, Yang Qinmin2, Ding Tianbo1, Chu Dong1

(1.KeyLaboratoryofIntegratedCropPestManagementofShandongProvince,CollegeofAgronomyandPlantProtection,QingdaoAgriculturalUniversity,Qingdao266109,China; 2.GeneralStationofPlantProtectionofShandongProvince,Ji’nan250100,China)

Tomatospottedwiltvirus(TSWV) is an important plant quarantine pest, which has been found in some provinces of China in recent years. In this study, 15 suspected tomato samples collected from Yantai, Shandong were first detected by using PCR with the TSWV-universal primers NF302/NR575. Then, theNgene of TSWV isolates amplified by specific primers TSWV-NF2037/TSWV-NR2825 was sequenced for phylogenetic analysis and genetic distance analysis. The results based on the detection with NF302/NR575 showed that four of the 15 samples were positive for TSWV.Genetic distance analysis based on theNgene sequences showed that the genetic distance between Shandong isolate and Yunnan (AEI70836.1) was the closest (i.e. 0.8%). Phylogenetic analysis showed that the Shandong isolate was closely related to the Yunnan isolate (AEI70836.1). Our results proved the introduction of TSWV into Shandong, which is the first evidence of TSWV disease in Shandong based on molecular markers.

Tomatospottedwiltvirus; RT-PCR detection; phylogenetic analysis; Shandong Province

2016-06-27

2016-09-19

青島市應用基礎研究計劃項目(14-2-4-80-jch);國家自然科學基金青年科學基金項目(31401809);國家公益性行業(農業)科研專項(201303028)

S 436.412.1

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.043

致 謝： 感謝云南省農業科學院丁銘、尹艷瓊和浙江省農業科學院張治軍提供番茄斑萎病毒冷凍樣本，感謝浙江大學謝艷教授提供番茄斑萎病毒檢測引物。

* 通信作者 E-mail:chinachudong@sina.com