天然產物合成生物學關鍵技術

匡雪君　鄒麗秋　李瀅　孫超　陳士林

[摘要] 結構復雜多樣的天然產物是新藥發現的重要源泉。通過天然產物合成生物學來實現天然產物的異源合成，被認為是解決復雜、稀缺天然產物來源問題最具前景的途徑。DNA組裝技術與基因組編輯技術是天然產物合成生物學研究的兩大關鍵技術。前者可以將多個元件組裝成超長DNA片段，實現代謝途徑的重建，后者可以通過底盤基因組的改造，增加底盤與外源途徑的適配性。該文綜述了DNA組裝技術與基因組編輯技術的最新研究進展，以期為天然產物合成生物學體系的構建和優化提供幫助。

[關鍵詞] 天然產物； 合成生物學； DNA組裝； 基因組編輯

Key technologies in synthetic biology of natural products

KUANG Xuejun1， ZOU Liqiu1， LI Ying1， SUN Chao1*， CHEN Shilin2*

（1.Institute of Medicinal Plant Development， China Academy of Medical Sciences and Peking Union

Medical College， Beijing 100193， China；

2. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] Natural products with complex and diverse structures are the major sources of new drugs. The biosynthesis of natural products is considered to be one of the best ways to solve the problems of complex and scarce natural products. DNA assembly technology and genome editing technology are two key technologies in the emerging interdisciplinary field of synthetic biology. A number of novel DNA assembly methods developed in the last few years have paved the way for the engineering of high molecular weight DNA molecules， including whole genomes， hence， it can realize the reconstruction of the metabolic pathways and speed up optimization process. A wide variety of new tools for microbial genome editing will be applied widely to modify the chassis genome to increase its adaptation with the exogenetic pathways. This article summarized the latest advance with respect to DNA assembly and genome editing， which aims to provide help for reconstruction and optimization of the synthetic biological systems of natural products.

[Key words] natural products； synthetic biology； DNA assembly； genome editing

doi：10.4268/cjcmm20162205

來源于植物、動物、微生物的天然產物往往天然含量低，組分復雜，提取分離難以得到單一的化合物，采用化學合成的方法也由于合成路線復雜，反應條件難以控制，合成率低，無法滿足市場需求[12]。因此，采用合成生物學的方法將外源的代謝途徑引入易于遺傳改造的模式微生物中，實現復雜天然產物或其前體的高效生產是目前應用前景最廣闊的一種方法[3]。

目前，運用天然產物合成生物學已經成功實現抗瘧藥青蒿素[4]、抗癌藥紫杉醇[5]及長春堿[6]前體的生物合成。要實現外源途徑在底盤系統中的重建并高效合成目標產物離不開2項關鍵技術：DNA組裝技術和基因組編輯技術。前者有效地彌補了DNA化學合成長度的不足，可成功實現長達1 Mb大片段DNA的組裝[7]，從而保障了含多個元件的外源合成途徑的正確組裝；后者可以對底盤細胞基因組進行改造，提高與外源途徑的適配性，精確調控外源基因表達，減少中間產物對宿主的毒性，提高目標產物的產量[8]。

1 DNA組裝技術

采用DNA從頭合成技術產生的DNA片段長度大多為500～1 000 bp，當合成更長的DNA片段時則需要將DNA小片段按順序組裝起來，這就涉及DNA組裝技術[910]。將基因元件組裝為可復制的和表達的DNA分子對于代謝途徑或基因環路的構建是非常關鍵的，DNA組裝方法用于基因環路的設計和特征化不僅有助于細胞內及細胞間調控機制的理解，而且能加速途徑優化進程；此外，DNA組裝方法可以通過激活天然產物生物合成相關的隱藏或沉默的基因簇來發現新型天然產物[1112]。基于不同的機制，DNA組裝技術可分為四大類：基于限制性內切酶的組裝、基于寡核苷酸架橋的組裝、基于同源重組的體外組裝和基于同源重組的體內組裝。

1.1 基于限制性內切酶的方法

1.1.1 依賴于同尾酶的BioBrick/BglBrick 同尾酶（如BglⅡ和BamHⅠ，XbaⅠ和SpeⅠ等）是一類識別DNA分子中不同核苷酸序列，但能產生相同黏性末端的限制性內切酶[13]。Biobrick是首個實現標準生物元件（如啟動子、核糖體結合位點、開放閱讀框、編碼序列和終止子等）順序組裝的DNA組裝方法[14]。該法運用限制酶切和連接不僅能完成標準生物元件的平臺構建，由于元件之間兼容，也能對形成的元件重新裝配，組裝成大型DNA片段。每個DNA元件上游與EcoRⅠ和XbaⅠ酶切位點相鄰，下游與SpeⅠ和PstⅠ酶切位點相鄰。同尾酶XbaⅠ和SpeⅠ識別不同的酶切位點，產生相同的黏性末端，一旦2個DNA元件連接，元件之間產生疤痕序列（ACTAGA），原來的酶切位點將不復存在，也就不能被原有的限制酶所識別，所以連接產物用XbaⅠ或SpeⅠ酶切均不能將其消化[15]。需要注意的是元件與質粒骨架上不能有同尾酶酶切位點。Biobrick連接后的疤痕序列（ACTAGA）翻譯后為蘇氨酸精氨酸，不會產生移框突變和提前終止，可用于融合蛋白的表達。近來出現的BglBrick[16]改進了原始的BioBrick法，DNA元件側翼相鄰的是甲基化的不敏感的酶BglⅡ和BamHⅠ，大大提高了連接效率，疤痕序列（GGATCT）編碼甘氨酸絲氨酸，故BioBrick也能用于蛋白融合。BioBrick和BglBrick 1次連接2個DNA片段，僅利用一對同尾酶，就可以實現DNA片段的多次組裝[13]。

1.1.2 Golden gate 克隆法 Golden gate 克隆法利用Ⅱ型限制性內切酶（ⅡS型酶，如BsaⅠ和AarⅠ）對DNA識別序列的相鄰的特定位置進行剪切，利用同種限制酶產生不同的黏性末端（4個核苷酸的懸突），消化片段連接的產物沒有初始的酶切位點[17]。此方法允許37°酶切消化和16°連接環化一步完成，且克服傳統多片段組裝時限制酶種類的限制，還可進行無縫連接[18]。由于Golden gate 克隆可用于重復序列的組裝，基因組編輯工具轉錄激活樣效應子核酶（TALENs）蛋白的DNA結合結構域是由序列差異很小的多個模塊組成，所以可以對TALENs進行人工設計組裝[19]；該方法也可用于基因環路的構建，陳威華等[20]使用可識別甲基化序列mCNNR（R=A或G）的內切酶MspJⅠ開發MASTER（methylationassisted tailorable ends rational），并利用該方法成功克隆了29 kb的天藍色鏈霉菌放線紫紅素生物合成基因簇。MASTER用含有5甲基胞嘧啶的引物擴增需要組裝的片段，限制性內切酶僅消化目標終端序列，更適于組裝長的DNA片段，但是甲基化引物相對昂貴，并且長片段DNA的擴增可能會引入錯誤。

1.2 基于寡核苷酸的架橋法

連接酶循環反應（the ligase cycling reaction， LCR）利用熱穩定的連接酶和寡核苷酸進行組裝[21]。LCR使用架橋寡核苷酸連接不具有重復序列的片段，每個架橋寡核苷酸含有與待連接DNA片段末端互補的序列，使上游片段的3′與下游片段的5′連接，從而使2個DNA片段組裝成單個的線性片段[22]。近來，De 等運用這項技術將12個DNA片段組裝到一個20 kb的質粒上[23]。

1.3 基于體外同源重組的組裝

1.3.1 重疊延伸PCR技術 重疊延伸PCR技術（splicing by overlapping extension PCR，SOEPCR），又稱交錯延伸剪接PCR技術或套疊PCR技術[24]。該技術采用具有互補末端的引物，使PCR產物形成相互重疊的鏈，在隨后的擴增反應中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段拼接起來[25]。不需要限制性內切酶消化和連接酶處理就可實現任意2個目的基因的連接，同時由于不引入目的基因以外的其他序列，可避免因加入連接序列導致的表達蛋白功能異常[24] 。Tan等[26]利用此技術和長片段PCR結合使用，并且在實驗中采用高保真聚合酶 pfu 的校正功能，成功地組裝了不同的長度DNA 分子，拼接長度可達20 kb，融合的錯誤率僅有1/16 600。此技術可用于2個或2個以上異源基因DNA片段的拼接，并且在插入大片段的定點突變、敲除基因片段以及基因的體外分子進化研究上具有獨特的優勢[26]。

1.3.2 序列及連接非依賴性克隆 序列及連接非依賴性克隆法（sequence and ligationindependent cloning，SLIC）利用T4DNA聚合酶，產生獨特的互補末端，然后采用單鏈退火或RecA介導的體外重組，從而實現DNA片段的拼接[2728]。SLIC法雖然1次可組裝超過10個片段，但需要很長的DNA重疊區，如組裝4個片段需要至少40 bp長的重疊區[27]。為了減少重疊區的DNA長度，降低引物合成費用，Zhang等隨后開發出SLiCE （seamless ligation cloning extract）方法，采用廉價的大腸桿菌細胞提取物驅動同源重組介導的DNA組裝，極大的減少了花費[29]。

1.3.3 USER克隆法 采用USER（uracilspecific excision reagent）克隆法可以實現DNA序列與載體的連接[30]。首先在載體上加上一小段cassette，cassette區域含有載體上不存在的限制性內切酶識別位點，且在識別位點兩端加上2個不同的堿基對控制方向，反方向的鏈上加上2個切口酶識別位點[31]。改造后的質粒用限制性內切酶和切口酶處理后，產生8個堿基對的懸突。組裝片段之間共有的重疊片段均以腺嘌呤起始，并以胸腺嘧啶結束，長度為6～17 bp。采用特定的寡核苷酸來擴增連接片段，重疊區域3′的胸腺嘧啶殘基被尿嘧啶替換，校對聚合酶能讀取尿嘧啶堿基（如Pfu Turbo Cx或Phusion U），然后將質粒骨架、雙鏈DNA片段與USER混合酶混合[32]。混合酶中含有尿嘧啶DNA糖苷酶（催化尿嘧啶的刪除，形成一個脫堿基位點）、DNA糖苷酶裂解酶（斷裂磷酸二酯骨架，釋放無堿基的脫氧核糖單糖），所有的片段形成互補的5′懸突，自退火形成帶有單鏈裂痕的環狀分子，然后轉化到宿主進行修復[33]。組裝的DNA片段之間是無痕連接，但是用來改造載體的cassette會給DNA片段與載體之間帶來13個堿基的疤痕[31]。

1.3.4 Gibson組裝 Gibson組裝要求將多個具有重復序列的DNA片段和線性化的載體混合，同時加入3個酶的混合物，分別為：T5核酸外切酶（使所有DNA片段產生一個3′的懸突，重疊的部分自動退火）、Phusion聚合酶（填補和連接縫隙）和Taq連接酶（修復裂痕，產生完整的目標產物）[34]。Gibson等運用此方法2 d內可將75個284 bp的DNA片段組裝成整個的老鼠線粒體基因組（16.3 kb）[35]。Gibson組裝方法不僅可實現無縫拼接，而且組裝尺度也十分可觀，不僅適用于以寡核苷酸鏈為起始的DNA合成，也適用于構建長的DNA片段，甚至是基因組[36]。該法具有快速、簡便、易行等特點，但因其中酶的造價較高，在大規模使用時，不得不考慮成本。T5核酸外切酶可以完全破壞<250 bp的DNA片段，所以組裝的片段長度需>250 bp。如果片段長度<250 bp可以在Gibson組裝之前使用重疊延伸PCR等技術使其長度達到要求[37]。

1.4 基于體內同源重組的組裝

為了組裝得到更長的DNA序列，除了體外的Gibson組裝等方法，科學家們將注意力轉移到了體內同源重組，包括枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和釀酒酵母重組系統。

1.4.1 酵母體內組裝 酵母同源重組頻率高，并且擁有精確的DNA修復機制，使其成為同時組裝多個DNA片段理想的底盤細胞[38]。酵母同源重組可以有效連接有40 bp重疊序列的DNA片段，Kuijpers等[39]改進了這一方法，通過使用60 bp與酵母基因組不同源的重組序列將9個DNA片段組裝到一個21 kb的質粒上，裝配成功率達到95%。近來，出現了一個改進的RADOM（rapid assembly of DNA overlapping multifragments） 組裝方法[40]， RADOM法將酵母同源重組與大腸桿菌的藍白斑篩選結合起來，大大減少了組裝時間。通過提取酵母轉化株中的質粒轉化入大腸桿菌，借助藍白斑篩選可以區分攜帶組裝DNA片段的載體與空載體，所以能快速地完成大規模的陽性菌株的篩選，已經被成功用于3 kb和10 kb酵母染色體的組裝。

除了DNA組裝，酵母同源重組也常用于將外源DNA整合到基因組上，用于代謝工程與復雜酶途徑的構建[41]。最近發展起來的CasEMBLR法能將沒有標記的DNA片段插入酵母染色體多個位點，利用CRISPR/Cas9系統在基因組目標插入位點引入雙鏈DNA斷裂，通過同源重組極大的提高了染色體插入效率，此法已被用于將類胡蘿卜素途徑中的15個基因整合到酵母中3個目標位點和將酪氨酸合成途徑中的10個酶基因整合到2個目標位點[42]。

1.4.2 枯草芽胞桿菌體內組裝 桿狀的革蘭氏陽性菌枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis也是合成生物學研究中是一個頻繁使用的宿主。Hao等[43]在芽胞桿菌中建立了一套較為完善的不同尺度DNA組裝體系，“Culture mix method”用于上百kb的直接克隆，“Domino method”用于幾kb到上百kb的組裝，“Inchworm method”用于幾Mb基因組的拼接。枯草芽胞桿菌基因組（B. subtilis genome，BGM）載體系統是一個新型的克隆系統，使用整個枯草芽胞桿菌的基因組作為載體，引入的外源DNA可以以一種單鏈的形式轉化進入枯草芽胞桿菌細胞質，通過RecA介導的同源重組將多個大型DNA片段整合到枯草芽胞桿菌染色體上。BGM含有4.2 Mb枯草芽胞桿菌全基因組，允許大型DNA片段的整合。2005年，Itaya等采用“inchworm method”法成功將集胞藻Synechocystis基因組（3.5 Mb）導入到枯草芽胞桿菌中，構建了1個7.7 Mb的集成基因組[44]。然而，該方法需要100 kb以上的DNA片段作為模板，其應用受到了限制。于是，相繼開發了“Domino method”，借助BGM載體系統，利用同源重組原理與逐級添加模式，已經被用于克隆16.3 kb的老鼠線粒體基因組和134.5 kb的大米葉綠體基因組[45]。“Domino method”不要求純化長鏈DNA模板，并且促進DNA穩定的插入BGM，但由于比較耗時，組裝過程需長的同源臂，目前還未得到普遍使用。2010年，Itaya及其同事們[46]發現，含有大質粒（>100 kb）的大腸桿菌被噬菌體侵染后，其中的大質粒仍能夠穩定存在。當直接混合大腸桿菌裂解液與芽胞桿菌感受態細胞，可以將DNA大片段穩定整合到芽胞桿菌的基因組上，隨即開發了“culture mix method”，利用這種天然轉化方式，實現了DNA大片段的直接克隆。

1.4.3 大腸桿菌體內組裝 和釀酒酵母和枯草芽胞桿菌不同的是，不能轉化線性的DNA片段進入大腸桿菌Escherichia coli，因為線性的dsDNA會被依賴于ATP的核酸外切酶RecBCD分解[47]。基于λ噬菌體Red重組酶的同源重組系統頻繁被用于將DNA整合到大腸桿菌中，介導線性DNA分子與環狀的質粒發生同源重組[48]。λ噬菌體主管同源重組的重組酶系統稱為Red，包含3種蛋白質分子，分別稱為Exo，Beta和Gam。Exo蛋白是具有5′3′活性的核酸外切酶，結合到dsDNA末端，通過消化5′ DNA末端產生3′ ssDNA懸突；Beta蛋白與ssDNA懸突結合，退火與ssDNA結合；Gam蛋白抑制核酸外切酶RecBCD結合到dsDNA的末端[47]。Ssbri等用該系統的KIKO（knockin/knockout）載體成功將5.4，7.3，11.3 kb的DNA片段整合到大腸桿菌基因組中[49]。近來，λ噬菌體Red重組酶介導的同源重組與噬菌體80Int介導的位點特異性同源重組結合的技術也被運用于染色體整合，如將8 kb的DNA片段整合到大腸桿菌染色體上[50]。

Rac原噬菌體也可用于大片段DNA在大腸桿菌中組裝。Rac原噬菌體的RecE/RecT重組系統功能上與噬菌體λ的Red蛋白重組酶系統類似（RecE 和RecT分別與Exo 和 Beta類似）[51]。研究顯示噬菌體λ的Red蛋白重組酶系統適用于線性和環狀DNA分子的結合，而Rac的RecE/RecT 系統更適用于2個線性DNA分子的連接[52]。

2 底盤基因組的編輯技術

采用基因組編輯技術幾乎可以對任意基因進行編輯和修飾[8]。近年來，基因組范圍的高效編輯技術發展迅速，對宿主基因組的改造效率也不斷提升，能更加有效地解決宿主菌株改造中的許多瓶頸問題，例如：大片段基因組的改造、復雜表型的改造、基因組上多重位點的組合優化和不需抗生素進行輔助篩選的高效基因組修飾等[53]。此外，對宿主基因組進行適當精簡，只保留存活所需的“必須基因”，能大大改善宿主細胞對底物、能量的利用效率[54]。

2.1 ZFNs

鋅指核酸酶（zincfinger nucleases， ZFNs）是第一種通過人工改造并成功應用的核酸內切酶，由負責DNA特異識別的鋅指蛋白 （zinc finger protein，ZFP）和FokⅠ核酸內切酶融合而成[55]。其N末端為鋅指蛋白DNA結合域，由一系列Cys2His2鋅指蛋白串聯而成，識別并結合特異的三聯體堿基；C末端為非特異性核酸內切酶FokⅠ結構域，只有當2個ZFN單體同時與各自的DNA位點結合時才能形成有切割活性的FokⅠ二聚體，從而在靶位點將DNA切斷。由于 FokⅠ內切酶需要形成二聚體方能發揮活性，所以由隨意剪切產生的脫靶幾率會大為減少。使用者只需針對目的基因設計8～10個鋅指結構域， 再將這些鋅指結構域與核酸內切酶結合，就構建好了靶向特定位點的 ZFNs[56] 。ZFNs的應用研究開始較早，目前以其為基礎的基因治療藥物已經進入臨床研究階段，同時，在生物制藥領域的應用也比較成熟，但是ZFNs的設計篩選費時費力，而且可能存在一定的脫靶率，使其未能成為廣泛應用的常規技術[57]。

2.2 TALENs

轉錄激活子樣效應因子核酸酶（transcription activatorlike effector nucleases， TALENs）與ZFNs類似，由轉錄激活因子樣效應物（transcription activatorlike effector， TALE）和FokⅠ核酸酶組成[58]。TALE蛋白以重復可變雙殘基RNDs對應1個堿基的識別模式結合到靶標DNA序列上。FokⅠ核酸酶只有形成二聚體時才能發揮其剪切酶的活性，所以，為了便于FokⅠ核酸酶的切割結構形成二聚體，通常設計2個結合位點接近的TALEN單體。Christian等[59]研究發現，2個TALEN單體的靶點間距在13～30 bp時活性比較高，其中間距為15 bp時該核酸酶的活性最高。目前，TALENs已經在植物、動物、酵母細胞中得到應用，有潛力成為一種操作方便、特異性強的基因組定點修飾技術[60]。

2.3 CRISPR/Cas9

規律成簇間隔短回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）/Cas9系統能進行基因組的高效修飾[61]。該系統由蛋白質和RNA 2個部分組成，蛋白質即切割DNA的Cas9核酸內切酶，RNA指導Cas9核酸內切酶定位到基因組的靶標位點[62]。CRISPRCas9系統屬于細菌適應性免疫系統，不同的CRISPRCas9系統分為3種類型，類型Ⅰ和類型Ⅲ利用多個Cas9蛋白引起靶標DNA的斷裂，類型Ⅱ只需利用1個Cas9內切酶就能在目標基因組序列引入雙鏈DNA斷裂，通過與經過特殊設計的小向導RNA（single guide RNA）共表達發揮作用[63]。CRISPRCas9系統是基因組編輯的一個重要的工具，已經被成功地用于鏈霉菌中放線菌紫素合成途徑基因簇的失活。對該技術進行改造產生了CRISPRdCas9技術，CRISPRdCas9不切割DNA，而是與轉錄激活劑或抑制劑蛋白結構域結合，靶標基因組中相關基因的啟動子來激活或抑制基因的表達，故可以使用這項技術來進行異源宿主中途徑產量的優化[64]。CRISPR/Cas9系統與ZFNs和CRISPR/Cas9相比，具有更好的擴展性，且更加經濟高效、易于構建。目前此項技術已經成功地用于天然產物紫色桿菌素合成途徑中中間產物和終產物的優化[61]。

2.4 基于位點特異性重組酶的同源重組

基于位點特異性重組酶的基因組編輯是一個有效的工具。現在大多利用來源于P1噬菌體的Cre/loxP位點和來源于酵母的Flp/FRT位點催化2個特異DNA序列發生重組[65]。Cre和Flp都屬于酪氨酸重組酶類，分別識別34 bp的目標位點——loxP和FRT，并且催化發生位點特異性重組[66]。應用這些重組酶進行基因組編輯，其原理是在基因組上和目的 DNA 上均插入特異性識別序列，在相應的重組酶作用下進行重組，實現大片段 DNA 的插入、刪除或替換。在基因組上目的片段兩端分別插入2個重組酶識別位點；同樣地，外源片段含有相應重組酶識別位點；通過重組酶的過量表達，即可實現2個特異識別位點之間基因組 DNA 的替換操作[67]。CreloxP重組系統在釀酒酵母中已經使用得比較成熟，已被成功用于引起單基因或者雙基因的刪除，也能用于大腸桿菌中基因的刪除[66]。

2.5 基于轉座子的同源重組

轉座子（transposon）是存在于DNA上可自主復制和移位的基本單位[68]。轉座子分為簡單轉座子和復合式轉座子。簡單轉座子因沒有任何宿主基因，被直接稱為插入序列，是染色體或質粒DNA的正常組成部分[69]。插入序列都是可以獨立存在的單元，帶有協助自身移動的蛋白；復合式轉座子是另一類帶有某些抗藥性基因或其他宿主基因的轉座子，其兩翼往往是2個相同或高度同源的插入序列。基因轉座時發生的插入作用有一個普遍的特征，那就是受體分子中有一段3～12 bp的靶序列DNA會自我復制，使插入的轉座子位于2個重復的靶序列之間[70]。不同轉座子的靶序列長度不同，但對于一個特定的轉座子來說，所復制的靶序列長度都是一樣的。對于序列已知的目的基因，可利用轉座子將該片段引入宿主細胞內，然后篩選突變的DNA序列替換野生型親本DNA序列，通過對突變基因的測試來研究相關基因的功能[71]。

3 展望

近年來，DNA合成與組裝技術發展迅速，已在合成生物學、遺傳網絡設計和基因組合成方面獲得了廣泛的應用。但是目前的DNA合成與組裝技術也存在一些問題，例如通量低、錯誤率高、自動化程度低、成本高等，通過學科間的交叉合作，開發新的合成策略，研制新的試劑或酶，有望加快DNA組裝技術的研究進程。同時，新型基因組編輯技術也不斷推陳出新，在基因組改造和優化方面表現出巨大的潛力和廣闊的應用前景。但這些技術的快速發展也面臨一些問題，如一些高效的基因組編輯技術只能在少數遺傳操作的模式菌中應用，難以應用到其他微生物。隨著DNA組裝技術和基因組編輯技術的不斷發展和完善，兩者將會在合成生物學和其他生命科學領域研究與應用中發揮更重要的作用。

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[責任編輯 孔晶晶]