龍骨馬尾杉PcHDR1基因克隆及序列分析

張志利　呂海舟　郭溆　何柳　宋經元　孫超　羅紅梅

[摘要] 該研究采用RTPCR方法對龍骨馬尾杉Phlegmarirus carinatus （Desv.） Ching 1羥基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸還原酶[1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase， HDR]基因PcHDR1的編碼區進行克隆并利用生物信息學方法進行序列分析。根據實驗室已獲得的龍骨馬尾杉轉錄組數據，從中獲得1條編碼HDR的轉錄本，采用RTPCR方法獲得該基因的全長cDNA序列，所克隆的PcHDR1基因編碼區長為1 437 bp，編碼478個氨基酸殘基，GenBank登錄號為JQ957845。PcHDR1與銀杏Ginkgo biloba的HDR序列同源性最高，達78%。生物信息學預測PcHDR1蛋白沒有跨膜區，具有LytB保守結構域，不含信號肽。該研究克隆并獲得了龍骨馬尾杉PcHDR1基因的編碼區序列，并對其編碼的蛋白進行了序列分析及結構域預測，為進一步研究HDR的功能奠定基礎。

[關鍵詞] 1羥基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸還原酶； 龍骨馬尾杉； 萜類生物合成

Cloning and bioinformatics analysis of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl

4diphosphate reductase（PcHDR1）gene in Phlegmarirus carinatus

ZHANG Zhili1，2， LV Haizhou1， GUO Xu1， HE Liu1， SONG Jingyuan1， SUN Chao1， LUO Hongmei1*

（1. Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Institute of Medicinal

Plants/Endangered Medicinal Breeding National Engineering Laboratory， Beijing 100193， China；

2. College of Horticulture and Gardening， Yangtze University， Jingzhou 434025， China）

[Abstract] The open reading frame of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase （HDR） was cloned from Phlegmarirus carinatus by RTPCR method and the sequence was analyzed by bioinformatics tools. After searching the transcriptome dataset of P. carinatus， one unique sequence encoding 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase was discovered. The primers were designed according to the cDNA sequence of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase from the dataset. And then， the open reading frame （ORF） of 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase， named as PcHDR1 （GenBank Accession number：JQ957845）， was cloned by RTPCR strategy with the template of mixed RNA extracted from roots， stem and leaf of P. carinatus. The bioinformatic analysis of this gene and its corresponding protein was performed. The ORF of PcHDR1 consisted of 1 437 base pairs （bp）， encoding one polypeptide with 478 amino acids. The sequence comparison showed that PcHDR1 is closest with GbHDR （Ginkgo biloba），and the sequence homology was up to 78%. Bioinformatics prediction and analysis indicated that PcHDR1 protein contained a conserved domain of LytB， without transmembrane region and signal peptides. This study cloned and analyzed 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase from P. carinatus. The result will provide a foundation for exploring the function of PcHDR1 involved in terpene biosynthesis in P. carinatus plants.

[Key words] 1hydroxy2methyl2（E）butenyl 4diphosphate reductase； Phlegmarirus carinatus； terpene biosynthesis

doi：10.4268/cjcmm20162214

龍骨馬尾杉Phlegmarirus carinatus（Desv.） Ching是石杉科馬尾杉屬的代表物種[1]。龍骨馬尾杉中含有石松生物堿（lycopodium alkaloids）、萜類（triterpenes）、有機酸（phenolic acids）和黃酮（flavones）等多種成分[23]，全草入藥，具有重要藥用價值。對風濕關節痛、類風濕性關節炎、筋骨疼痛、跌打損傷等具有顯著療效。龍骨馬尾杉為多年生的附生植物，且生境極為特殊，導致龍骨馬尾杉的野生資源極為有限。因此通過分子生物學手段挖掘龍骨馬尾杉中與次生代謝相關的基因顯得尤為重要。

萜類物質是自然界存在的一類由異戊二烯基焦磷酸（isopentenyl diphosphate， IPP）和二甲基烯丙基焦磷酸（dmiethylallyl diphosphate， DMAPP）為基本骨架組成的化合物的統稱，也稱為類異戊二烯。該類化合物有很好的藥理活性，是中藥和天然藥物的主要有效成分，紫杉醇[4]、青蒿素[5]、銀杏內酯[6]等都屬于萜類，因此萜類化合物的合成代謝引起了人們廣泛的關注。甲基赤蘚糖磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑[78]是一條存在于植物和細菌中的參與萜類前體物質合成的途徑，位于質體中。MEP途徑中最后一個限速酶是1羥基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸還原酶[1hydroxy2methyl 2（E）butenyl 4diphosphate reductase，HDR][9]， 催化羥甲基丁烯基4磷酸（hydroxymethylbutenyl 4d iphosphate，HMBPP） 生成萜類合成的前體物質——IPP 和DMAPP。2000年，Cunningham等通過在大腸桿菌中表達金盞花Adonis aestivalis的lytB 基因，第1次證明了該基因編碼的蛋白具有HDR蛋白的功能，并可以維持IPP和DMAPP恒定的5∶1的比例[10]。 2004年，BotellaPavía P通過在轉基因擬南芥中過表達HDR和TXS（taxadiene synthase）基因發現，在該轉基因植株中紫杉二烯的含量比單轉TXS的擬南芥提高13倍[11]。該基因廣泛存在于生物體中，在植物、細菌和真菌中均已發現。Lv等在蛇足石杉中克隆了該基因家族的2個成員——HsHDR1和HsHDR2[12]。HDR是萜類物質生物合成中的1個限速酶，在萜類合成中行使調節萜類合成前體五碳分子庫容的重要功能，是萜類代謝工程中重要的功能蛋白，它的超量表達有利于推動代謝流向下游流動， 促進下游相關產物的生物合成。因此，對研究生物代謝工程具有重要意義。

本實驗室已經獲得了大量的龍骨馬尾杉轉錄組信息，從中發現了大量可能參與龍骨馬尾杉萜類化合物生物合成的轉錄本[13]。本文克隆了龍骨馬尾杉PcHDR1的cDNA序列，并進行了生物信學預測及分析，為闡明龍骨馬尾杉萜類化合物生物合成途徑奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

龍骨馬尾杉P. carinatus全草采集方法同文獻[13]。大腸桿菌DH5α感受態購于北京全式金生物科技有限公司。植物多糖多酚核糖核酸（RNA）提取試劑盒購于百泰克生物公司。PrimeScript反轉錄試劑盒、Pyrobest高保真酶、pMD19T vector、SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒均為日本寶生物公司產品。多聚酶鏈式反應（PCR）產物膠回收試劑盒購于天根生物公司。本研究所用引物均由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。其他試劑均為國產分析純，試劑與儀器同文獻[13]。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

取適量龍骨馬尾杉全草，在液氮中研磨，依據百泰克生物公司的植物多糖多酚核糖核酸（RNA）提取試劑盒的操作步驟提取龍骨馬尾杉總RNA，RNA完整性檢測及RNA反轉錄合成第一鏈互補鏈DNA（cDNA）的方法同文獻[13]。

1.3 PcHDR1基因的擴增及測序

以龍骨馬尾杉的cDNA為模板，按照以下體系對龍骨馬尾杉的PcHDR1基因進行擴增：cDNA 1.0 μL，Pyrobest酶0.2 μL，10 μmol上下游引物各1.0 μL，2 mmol·L-1 dNTP 0.5 μL，10×Pyrobest Buffer 3.0 μL，終體積為30.0 μL。反應程序：94 ℃預變性3 min，然后進行30個循環，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，循環結束后72 ℃ 7 min延伸反應，10 ℃保溫。1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，對擴增所得目的片段進行切膠回收。引物序列見表1。

將回收產物與pMD19T載體連接，轉化DH5α菌株，在含有氨芐的LB平板上進行培養，挑取單克隆經菌落PCR擴增和電泳檢測后選擇陽性克隆送公司測序。

1.4 PcHDR1生物信息學分析及在線分析工具

本研究中使用的生物信息學分析工具同文獻[12]。采用ExPASy Proteomics Server 提供的在線工具Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/protparam.html）預測PcHDR1的理化性質；利用在線工具ExPASy PROSITE （http：//www.expasy.ch/prosite/）和美國國立生物技術信息中心（NCBI）在線工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析PcHDR1蛋白質結構域。利用SWISSMODEL （http：//swissmodel.expasy.org/）分析蛋白質二級結構。利用3DJIGSAW（http：//bmm.cancerresearchuk.org/～3djigsaw/）對PcHDR1蛋白進行同源建模，分析其三維結構。使用SignalP3.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行分泌蛋白預測。WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org/） 用于PcHDR1蛋白的定位信號預測。在線軟件TMHMM Server v. 2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）用來預測PcHDR1的跨膜區。氨基酸序列比對利用NCBI的蛋白質序列數據庫進行。通過MEGA 5.0構建Neighborjoining系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 龍骨馬尾杉PcHDR1基因的克隆

通過搜索龍骨馬尾杉高通量轉錄組數據[13]，從中發現一個轉錄本（contig00710）被注釋為1羥基2甲基2（E）丁烯基4焦磷酸還原酶（HDR）基因。經分析，發現該轉錄本具有一個完整的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。根據該開放閱讀框的序列設計基因的全長擴增引物（PcHDR1F和PcHDR1R），以龍骨馬尾杉全草RNA反轉錄得到的cDNA為模板，利用RTPCR技術擴增獲得一條長為1 437 bp的序列，對所擴增基因命名為PcHDR1，GenBank登錄號JQ957845。經PCR擴增所得的PcHDR1電泳檢測情況見圖1。

2.2 PcHDR1基因編碼蛋白特性分析

2.2.1 理化性質分析 利用ExPASy Proteomics Server的在線軟件Protparam對PcHDR1基因編碼蛋白質的理化性質進行預測，結果顯示PcHDR1的分子式為C2 358H3 722N630O737S16，編碼478個氨基酸，相對分子質量是53.202 2 kD。等電點pI 5.49，帶正電殘基（Arg + Lys）為55，帶負電殘基（Asp + Glu）為67。該蛋白的不穩定系數（the instability index）為30.40，說明PcHDR1較穩定。脂肪系數（aliphatic index）為82.74，親水性系數（grand average of hydropathicity，GRAVY）為-0.333。

2.2.2 PcHDR1二級結構分析及結構域預測 利用在線工具（http：//www.predictprotein.org/）預測PcHDR1的二級結構，發現其二級結構中α螺旋（Alpha helix）占35.77%，β折疊（beta turn）占16.53%，無規卷曲（random coil）占47.70%，見圖2。InterProScan的保守結構域在線預測結果表明，PcHDR1在122～463位含有LytB保守結構域。

2.2.3 PcHDR1三維結構建模 在SWISSMODEL依據保守結構域作圖工具中，預測了PcHDR1蛋白的三維結構。對PcHDR1蛋白的保守結構域的三維結構建模，結果見圖3。

2.2.4 PcHDR1信號肽、亞細胞定位及跨膜區預測分析 利用SignalP3.0Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預測PcHDR1蛋白不具有信號肽。在線工具WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org/） 預測該蛋白的亞細胞定位情況，結果葉綠體的定位系數為8.0（chlo：8.0）；液泡的定位系數為2.0（vacu：2.0）；細胞核的定位系數為1.0（nucl：1.0）；細胞質的定位系數為1.0（cyto：1.0）；質體的定位系數為1.0（plas：1.0）。因此，PcHDR1最可能定位于葉綠體中。利用TMHMM Server v. 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/） 預測PcHDR1的跨膜區。結果顯示該蛋白沒有跨膜區。

2.2.5 PcHDR1的氨基酸序列比對及進化分析 將PcHDR1的氨基酸序列提交到美國國立生物技術信息中心NCBI的蛋白質序列數據庫（http：//

blast.ncbi.nim.nih.gov/Blast.cgi）進行BLASTP搜索相似性序列，結果顯示，PcHDR1與銀杏（Ginkgo biloba）的HDR序列同源性最高，達78%。為了分析PcHDR1的進化情況，從NCBI的Nr數據庫中選取了8個物種10條HDR序列繪制進化樹。 這些序列包括銀杏G. biloba的HDR（gi|82492442|），赤松Pinus densiflora的HDR（gi|183206805|），火炬松P. taeda的HDR（gi|126697262|），紫杉Taxus x media的HDR（gi|156068994|），艾菊Tanacetum parthenium的HDR（gi|353453158|），黃花蒿Artemisia annua的HDR（gi|289157416|），煙草Nicotiana langsdorffii x Nicotiana sanderae的HDR（gi|157042741|）和蛇足石杉Huperzia serrata中的2個HDR（gi|827048597| 和gi|827048599|）。進化樹見圖4，PcHDR1與蛇足石杉中的HDR（gi|126697262|）親緣關系較近。序列同源性分析表明，PcHDR1與蛇足石杉中的2個HsHDR同源性高達92.76%，見圖5。

3 討論

轉錄組學研究是快速發現基因的有效手段。得益于生物信息學、 比較基因組學等學科與實驗技術手段的快速發展，本課題組已運用高通量測序結合生物信息學分析技術對多種非模式藥用植物的轉錄組進行了研究，并挖掘出大量參與植物次生代謝的候選基因，課題組已完成蛇足石杉[14]、人參[15]、三七[16]、銀杏[17]、西洋參[18]、喜樹[19]、丹參[20]等多個物種的高通量轉錄組測序，發現了大量的參與藥用植物次生代謝途徑及生長發育、抗病抗逆等相關基因，為后續研究藥用植物次生代謝工程及優良品種選育奠定基礎。

本研究在已有龍骨馬尾杉轉錄組數據的基礎上，克隆獲得了編碼龍骨馬尾杉 HDR 的PcHDR1基因。與Lv等[12]報道的蛇足石杉中的HDR基因家族中的2個HDRs基因（HsHDR1和HsHDR2）相比，它們編碼的蛋白質的大小相當，均在476～478 aa。對其編碼的氨基酸序列進行生物信息學預測與分析，結果顯示PcHDR1具有典型的 HDR 催化活性位點，亞細胞定位預測其定位于葉綠體，這與HsHDR1和HsHDR2預測定位于葉綠體的報道一致[12]，與MEP途徑存在于質體中相一致。同來源于其他植物的HDR蛋白同源性較高，在系統進化樹上，PcHDR1與來源于蛇足石杉的2個HDRs蛋白同源性高達92.76%，尤其與HsHDR1的親緣關系最近，推測這2個HDR可能具有相似的功能。以上研究結果將為后續開展PcHDR1的功能驗證及龍骨馬尾杉萜類化合物的生物合成途徑的研究奠定良好的基礎。

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[責任編輯 孔晶晶]