鴉膽子蛋白質組成分析及其酶解物細胞毒性研究

冀會方　劉露　李開　張月圓　王靈芝

[摘要] 對鴉膽子進行蛋白質組成分析，并對其球蛋白酶解物細胞毒性進行研究。采用順序抽提法提取鴉膽子清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白4類蛋白組分，并用凱氏定氮法進行定量；采用不同種蛋白酶水解鴉膽子球蛋白，MTT法考察其小分子量（≤3 kDa）酶解物對人乳腺癌MCF7的細胞毒性。結果表明：鴉膽子總蛋白含量為17.47%，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白和殘渣蛋白分別占總蛋白含量的15.01%，8.11%，2.47%，44.92%，23.62%；球蛋白的胃蛋白酶酶解物（≤3 kDa）對人乳腺癌MCF7具有顯著的細胞毒性，且作用72 h后，IC50為（6.52±0.01） mg·L-1。鴉膽子蛋白質含量較為豐富，其多肽組分具有明確的體外細胞毒性，可進一步開發抗腫瘤活性成分。

[關鍵詞] 鴉膽子； 蛋白質； 抗腫瘤多肽

Protein composition analysis and cytotoxicity of gulbulin

hydrolysates of Brucea javanica seeds

JI Huifang， LIU Lu， LI Kai， ZHANG Yueyuan， WANG Lingzhi*

（School of Chinese Material Medica， Beijing University of Chinese medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract] To analyze the protein composition of Brucea javanica seeds and evaluate the cytotoxicity of its gulbulin hydrolysates. Four protein fractions of albumin， gulbulin， prolamin and glutelin were sequentially extracted and then quantified by Kjeldahl method. Different kinds of proteases were applied to hydrolyze B.javanica gulbulin， and MTT assay was used to evaluate the cytotoxicity of low molecular weight hydrolysates （≤3 kDa） on human breast cancer MCF7 cell. The results showed that： the total protein content of B.javanica seeds was 17.47%， albumin， gulbulin， coxin， glutelin and residue protein accounted for 15.01%， 8.11%， 2.47%， 44.92% and 23.62% of the total protein content， respectively. The hydrolysates （≤ 3 kDa） of B.javanica globulin produced by pepsin showed significant growth inhibitory activity on MCF7 cells， and the IC50 value was（6.52±0.01） mg·L-1 after 72 h of incubation. Protein was abundant in B.javanica seeds， and its peptides demonstrated specific cytotoxicity on MCF7 cell line in vitro， suggesting antitumor active ingredient can be further generated from B.javanica seeds.

[Key words] Brucea javanica seeds； protein； antitumor peptides

doi：10.4268/cjcmm20162221

鴉膽子為苦木科鴉膽子屬植物鴉膽子Brucea javanica（Linnaeus）Merrill的干燥成熟果實，又名老鴉膽、苦參子和鴉蛋子，主產于我國廣東、廣西、海南、云南、福建和臺灣等地[1]。鴉膽子味苦、性寒、有微毒，歸大腸、肝經，有清熱、解毒、截瘧、止痢和腐蝕贅疣等功效[2]，并具有較強的抗瘧、抗炎、抗病毒作用[3]。現代研究表明，鴉膽子含有多種藥理活性物質，如脂肪酸及酯類、苦木素類、三萜類、生物堿、黃酮等，具有良好的抗腫瘤[4]、抗消化道潰瘍[5]、降血脂[6]功能。鴉膽子的石油醚提取物——鴉膽子油，已被開發為多種劑型，應用于臨床治療多種惡性腫瘤[7]。

蛋白質作為生命結構和功能的重要組成部分，具有重要研究價值，目前已進行了多種植物種子蛋白的廣泛研究。種子儲藏蛋白根據其溶解特性可分為四大類：清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白[8]。 生物肽是對生物體的生命活動有益或具有生理作用的肽類化合物，而生物肽多以非活性狀態存在于蛋白質長鏈中，經適當的蛋白酶水解釋放后，顯示出廣泛的生物學特性[9]。目前已有大量關于玉米、大豆、紅松、苜蓿等種子儲藏蛋白的研究，并獲得了具有多種藥理活性的功能肽。但是，國內外關于鴉膽子蛋白質組成及其活性研究的報道較少，因此，本文對鴉膽子的蛋白質組成做了較為系統的分析，并初步探究了鴉膽子球蛋白酶解物的細胞毒性，為進一步開發抗腫瘤活性成分提供了理論依據。

1 材料

鴉膽子（產地廣西，批號20100242）購于北京同仁堂，經北京中醫藥大學劉春生教授鑒定為苦木科鴉膽子屬植物鴉膽子B. javanica的干燥成熟果實。

人乳腺癌MCF7細胞，獲贈于北京中醫藥大學孫震曉教授。

木瓜蛋白酶（批號20140922，北京拜爾迪生物技術有限公司）；α糜蛋白酶（批號1000916140，Sigma公司）；風味蛋白酶（批號1001125310，Sigma公司）；嗜熱菌蛋白酶（批號1001229949，Sigma公司）；胃蛋白酶（批號101644990，Sigma公司）；胰蛋白酶（批號1002203482，Sigma公司）；RPMI1640 培養基（批號1493423，Gibco公司）； 胎牛血清（Gibco公司）；雙抗（批號1734042，Gibco公司）； 蛋白質標準品（批號20160422，北京拜爾迪生物技術有限公司）；蛋白質上樣緩沖液（批號20160422，北京拜爾迪生物技術有限公司）；其他試劑均為分析純。

FW100型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；DHG9053A 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；BP221S型電子分析天平（Sartorius公司）；TGL20M型臺式高速冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司）；SRJX413 型高溫電阻爐（北京市永光明醫療儀器長）；WXG4型旋光儀（上海申光儀器儀表有限公司）；日立L8900全自動氨基酸分析儀（日立高新技術公司）；FD50冷凍干燥機（上海比朗儀器制造有限公司）；DF101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；FLC3超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；MCO18AIC（UV）CO2培養箱（日本SANYO 公司）；Epoch酶標儀（美國BioTek 公司）；TE2000S倒置顯微鏡（日本NIKON公司）。

2 方法

2.1 鴉膽子蛋白質組成研究

2.1.1 鴉膽子蛋白質的順序抽提 采用順序抽提法[10]依次提取鴉膽子的4類蛋白組分。鴉膽子粉末經石油醚脫脂，真空干燥后，依次用雙蒸水、5% NaCl溶液、70%乙醇和0.1 mol·L-1 NaOH溶液順序抽提清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，固液比為1∶10。其中，清蛋白和球蛋白于4 ℃提取，醇溶蛋白和谷蛋白于室溫提取。每種蛋白組分振蕩抽提1 h，1萬 r·min-1離心20 min，收集上清液，重復操作1次，離心后的沉淀用來進行下一蛋白組分的提取。

2.1.2 SDSPAGE 采用垂直板不連續體系[11] 分離膠濃度為15%，濃縮膠濃度為 5%。蛋白溶液加入上樣緩沖液后，100 ℃變性5 min，上樣量20 μg，室溫恒壓電泳。當溴酚藍指示劑距膠底5 mm時，停止電泳。考馬斯亮藍R250染色。

2.1.3 鴉膽子主要成分含量測定 蛋白質含量測定采用凱式定氮法 [12]：鴉膽子粉碎為粉末，過40目篩。精密稱定粉末樣品或量取順序抽提的蛋白質溶液于凱氏燒瓶中，然后依次加入濃硫酸（95%～98%）和催化劑（K2SO4CuSO4·5H2O 5∶1）置于熱源上消化，直至消化終點。將定容后的消化液蒸餾，并用0.005 mol·L-1的稀硫酸進行滴定。每個樣品重復3次實驗。

粉末樣品中蛋白質含量=（A-B）×0.140 1×6.25×N/（C×1 000）×100%

液體樣品中蛋白質含量（mg）=（A-B）×0.140 1×6.25×N

A為滴定樣品用去的稀硫酸平均體積（mL），B為滴定空白樣品用去的稀硫酸平均體積（mL），6.25 為系數，N為樣品的稀釋倍數，C為粉末樣品的質量（g）。

淀粉含量測定[13]：精密稱取（2.50±0.05）g鴉膽子粉末，平行6份，烘干。其中3份樣品中加入稀鹽酸，并進行加熱，使淀粉水解為可溶性糖，然后加入硫酸鋅溶液和亞鐵氰化鉀溶液沉淀非糖類物質，過濾，取濾液測定總旋光度值α1。同時，使用乙醇提取另外3份樣品中的可溶性糖及低分子量多糖，測定其旋光度值α2。將α1、α2帶入以下公式計算即得淀粉含量。

淀粉含量=100×（α1-α2）[α]20D·L·W×100%

[α]20D：純淀粉的比旋光度；L：旋光管長度（dm）；W：樣品質量（g）。

粗脂肪含量測定[14]：精密稱取（3.50±0.05） g鴉膽子于已干燥至恒重的濾紙筒內，烘干，放冷后精密稱定，平行3份，在索式提取器內使用石油醚90℃回流8～10 h后，烘干，放冷后再次精密稱定樣品質量。2次稱量的差值即為粗脂肪含量。

灰分含量測定[12]：精密稱取鴉膽子（2.00±0.01） g至已熾熱恒重的坩堝內，精密稱定，平行3份，500～600 ℃緩緩熾熱至完全炭化，移至干燥器中，放冷，精密稱定后，再次500～600 ℃熾熱至恒重，即得灰分含量。

水分含量測定[12]：取供試品（5.00±0.05） g平鋪于干燥恒重的稱量瓶中，精密稱定，平行3份，開啟瓶蓋于105 ℃干燥5 h，放冷后精密稱定，再次重復，直至相鄰2次稱重差異不超過5 mg為止，根據減失的質量，計算水分含量。

2.1.4 氨基酸含量分析 精密稱定樣品粉末，平行3份，溶于 6 mol·L-1 HCl，110 ℃真空水解24 h。將蛋白質酸水解液用過甲酸處理，水解產物真空干燥后溶于適量0.02 mol·L-1 HCl，日立 L8900 測定氨基酸含量[15]。同時，色氨酸和胱氨酸在含量測定前分別采用堿水解法[16]和過甲酸氧化法[17]進行測定。

2.2 鴉膽子球蛋白酶解物的細胞毒性研究

球蛋白是重要的種子儲藏蛋白之一，根據沉降系數的不同可分為2S，7S，11S和15S球蛋白，且每一種球蛋白都由不同數量的亞基構成，因而形成種類繁多且功能多樣的球蛋白[18]。課題組前期研究表明球蛋白組分蛋白質量較高（79.69%），因此，選擇球蛋白作為后續實驗的研究對象。

2.2.1 最優蛋白酶的篩選 球蛋白提取液經透析（MWCO：35 kDa）純化后，進行冷凍干燥。將凍干蛋白粉分別用木瓜蛋白酶、α糜蛋白酶、風味蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶進行水解，底物濃度0.5%，酶與底物濃度比1∶10。選擇各種酶的最適宜反應條件：木瓜蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl緩沖液，pH 8.0，65 ℃），α糜蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl緩沖液，pH 8.0，37 ℃），風味蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl緩沖液，pH 7.0，65 ℃），嗜熱菌蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl緩沖液，pH 8.0，65 ℃），胃蛋白酶（0.01 mol·L-1 HCl，pH 2.0，37 ℃）和胰蛋白酶（50 mmol·L-1 TrisHCl緩沖液，pH 8.0，37 ℃）。水解液振蕩水浴48 h后，95 ℃變性5 min終止反應，冰浴10 min，1萬 r·min-1，4 ℃離心20 min，取上清液，超濾離心（MWCO：3 kDa），收集濾過液，冷凍干燥后，采用PBS配制質量濃度為10 g·L-1的藥物母液，過濾除菌，備用。

2.2.2 酶解產物（≤3 kDa）對人乳腺癌MCF7的細胞毒性研究 取處于對數生長期的人乳腺癌MCF7細胞，調整細胞密度為2×104個/mL，按100 μL/孔接種于96孔培養板。貼壁培養12 h后，棄去培養液，陰性對照組每孔加入150 μL新鮮培養基，陽性對照組每孔加入等體積5 mg·L-1 5FU。其余各組每孔加入等體積不同濃度的酶解產物，繼續培養72 h，每組6個復孔。孵育72 h后，每孔加入20 μL MTT（5 g·L-1）孵育 4 h，棄去上清，每孔加 150 μL DMSO，低速振蕩 10 min，酶標儀 570 nm波長測定吸光度（A），計算細胞增殖抑制率，并計算 IC50。每組實驗重復3次。

抑制率=（1-A實驗組/A對照組） ×100%

2.3 統計學方法

所有實驗數據均用±s表示，采用SAS 9.3 進行單因素方差分析，P<0.05表示具有顯著性差異。

3 結果

3.1 鴉膽子主要成分含量測定

鴉膽子主要成分分析， 總蛋白量為（17.47±0.12）%，淀粉量為（49.26±0.02）%，粗脂肪、灰分和水分的量分別為（16.16±0.13）%，（5.61±0.10）% 和（6.74±0.05）%。

3.2 鴉膽子蛋白質組成研究

3.2.1 鴉膽子蛋白質組分分析 采用順序抽提法依次用雙蒸水、5% NaCl溶液、70%乙醇和0.1 mol·L-1 NaOH溶液提取清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，經 SDSPAGE電泳后，電泳圖譜見圖1。清蛋白電泳條帶最少，僅在28 kDa附近有分布；球蛋白條帶相對較多，主要分布在33，28，19，10 kDa附近；醇溶蛋白條帶也較多一些，主要分布在27， 22，14，10 kDa附近；谷蛋白相對分子質量分布較為廣泛，條帶也存在明顯差異，但主要分布范圍為37 kDa和17～20 kDa。對4類蛋白定量分析，醇溶蛋白量為每100 mg鮮重（0.43±0.01）mg，占鴉膽子總蛋白的2.47%，含量最低；其次為球蛋白為每100 mg鮮重（1.42±0.01）mg，占總蛋白質量的 8.11%。清蛋白含量較高，占鴉膽子總蛋白的15.01%。4類蛋白中，含量最高的谷蛋白，其絕對量為每100 mg鮮重（7.87±0.02）mg和相對量為44.92% 。此外，仍有23.62%的蛋白質存在于殘渣。

3.2.2 鴉膽子氨基酸組成分析 采用酸水解法，并結合堿水解及過甲酸氧化法，進行100 mg鴉膽子樣品氨基酸含量測定，共檢測到18種氨基酸，總量為11.06 mg，其中含量最高的是Glu， 為 1.88 mg，其次是Asp，為 1.85 mg。人體所需的10種必需氨基酸和半必需氨基酸均被檢測到Thr， Val， Met， Ile， Leu， Phe， Lys， His， Arg， Trp， 量分別為 0.35， 0.53， 0.11， 0.46， 0.78， 0.52， 0.37， 0.35， 0.79， 0.08 mg， 見表3。

3.3 鴉膽子球蛋白酶解物細胞毒性研究

3.3.1 最優蛋白酶的篩選 采用MTT實驗考察球蛋白的不同酶解產物（≤3 kDa）對人乳腺癌MCF7的細胞毒性，結果見圖2，在藥物濃度為10 mg·L-1時，球蛋白的胃蛋白酶酶解產物（≤3 kDa）對MCF7細胞的增殖抑制活性最強，高達75%，因此，確定胃蛋白酶為酶解鴉膽子球蛋白的最優酶。

3.3.2 胃蛋白酶酶解物（≤ 3 kDa）的細胞毒性 分別對加藥后24， 48， 72 h不同濃度組的MCF7細胞進行顯微觀察，見圖3。陰性對照組隨著培養時間的延長，細胞數目逐漸增多，且形態基本保持不變，為不規則多邊形。陽性對照組的細胞隨著時間的延長，細胞數目逐漸減少，細胞形態逐漸皺縮，并裂解為細胞碎片。在同一藥物濃度下，如7 mg·L-1時，隨著時間的延長，細胞數目逐漸減少，細胞形態逐漸由不規則多邊形變成圓形，細胞逐漸破碎；在相同時間下，如48 h，隨著藥物濃度的增加，細胞數目逐漸減少，變形細胞數目及細胞碎片也漸漸增多。

4 討論

鴉膽子為我國傳統中藥，研究工作者已從中分離得到多種抗腫瘤活性成分，如油酸、亞油酸、鴉膽子苦素、鴉膽子苷等。然而，有關鴉膽子蛋白質及其多肽的研究卻鮮少報道。2013年，Sornwatana T等[19]采用胃蛋白酶水解鴉膽子蛋白質，從中獲得了11肽Brucin，可有效抑制化膿性鏈球菌引起的感染（MIC 20 mmol·L-1）。因此，為考察鴉膽子多肽類成分是否也具有抗腫瘤活性，本研究采用順序抽提法對鴉膽子蛋白質進行了較為系統的分析，結果表明鴉膽子蛋白質含量較豐富（17.47%）且含有18種氨基酸，采用酶解法初步獲得了對MCF7細胞株具有較高增殖抑制活性的多肽組分。

酶解法制備生物肽，具有生產條件溫和、安全性高和易得性等優點[20]，顯著優于傳統的化學水解法，已得到廣泛應用。球蛋白作為種子的重要儲藏蛋白之一，其研究逐漸受到重視，目前已有大量關于大豆、燕麥、小麥和花生等種子球蛋白及其酶解產物的研究。藺瑞等[21]采用Osborne法提取裸燕麥球蛋白，并利用鹽析、SephadexG100 凝膠過濾色譜等方法進一步純化，發現組分Ⅰ顯示出更強的抗氧化能力。丁秀臻等[22]研究發現，與未還原大豆球蛋白酶解物相比，還原大豆球蛋白酶解物具有更強的抗氧化能力及與Hg2+的結合能力。侯文娟等[22]采用堿性蛋白酶水解蕎麥球蛋白，酶解產物經凝膠柱色譜分離得到的相對分子質量小于1 kDa 的組分顯示出較強的抗氧化能力。本研究對鴉膽子球蛋白的水解酶進行了篩選，發現其胃蛋白酶酶解產物（≤ 3 kDa）對人乳腺癌MCF7細胞具有出良好的體外抗腫瘤活性IC50 （6.52±0.01）mg·L-1。為進一步獲得高活性的抗腫瘤多肽組分或單體，將采用凝膠過濾色譜、高效液相色譜等多步色譜分離技術對酶解產物進行分離純化，并進行深入機制探討。

綜上所述，鴉膽子多肽類組分具有顯著的抑制腫瘤細胞增殖作用，為該藥臨床應用和藥效物質基礎研究提供了新的實驗數據。

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[責任編輯 丁廣治]