蛋白干預對氣陰兩虛2型糖尿病大鼠氨基酸代謝譜的影響

馬麗娜毛新民　馬曉麗　李琳琳　王燁　陶義存　王敬偉　郭佳佳　蘭怡

[摘要] 該文研究植物蛋白和動物蛋白對氣陰兩虛2型糖尿病大鼠氨基酸代謝譜的影響。將110只雄性SD大鼠隨機分為空白組（10只），糖尿病模型組（20只），病癥結合組（80只），正常組大鼠給予普通飼料，其余給予高糖高脂飼料全程喂養，期間病癥結合組灌服青皮附子（15.75 g·kg-1）每日1次，5周后，腹腔注射小劑量鏈脲佐菌素（40 mg·kg-1）建立實驗性糖尿病大鼠模型，將病癥結合成模的大鼠按照血糖隨機分為病癥結合1組（氣陰兩虛糖尿病組，15.75 g·kg-1）， 病癥結合2組（植物蛋白組，0.5 g·kg-1）， 病癥結合3組（動物蛋白組，0.5 g·kg-1），病癥結合4組（黃連素組，0.1 g·kg-1），連續灌胃給藥4周。蛋白干預4周后，腹主動脈采血分離其血清，運用AQC柱前衍生高效液相色譜法，利用熒光檢測器對血清中游離氨基酸進行分析。蛋白干預4周后，植物蛋白、動物蛋白與黃連素對2型糖尿病大鼠體重和血糖無明顯影響。植物蛋白組與動物蛋白組相比較，氣陰兩虛2型糖尿病大鼠血清中組氨酸和脯氨酸（P<0.01）、絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、酪氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、亮+異亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸（P<0.05）有明顯的變化。研究結果顯示，蛋白灌胃對氣陰兩虛2型糖尿病SD大鼠氨基酸代謝產生了影響，通過代謝組學技術找到標志性差異化合物，從而為2型糖尿病早期預警和氣陰虛證侯提供實驗依據。

[關鍵詞] 蛋白； 氣陰兩虛； 2型糖尿病； 氨基酸

Effect of protein intervention on amino acid metabolism spectrum of

Qi and Yin deficiency type 2 diabetic rats

MA Lina1， MAO Xinmin1， MA Xiaoli2， LI Linlin3， WANG Ye3， TAO Yicun3，

WANG Jingwei3， GUO Jiajia3， LAN Yi4*

（1. Institute of Traditional Chinese Medicine， Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；

2. Analytical&Testing Center of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；

3. Department of Pharmacology， Basicl Medicinal College of Xinjiang Medical University， Urumqi 830011， China；

4. Department of Cadres No.2 of Traditional Chinese Medicine Hospital in Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi 830000， China）

[Abstract] To study the effect of plant protein and animal protein on amino acid metabolism spectrum of Qi and Yin deficiency type 2 diabetic rats. 110 male SD rats were randomly divided into blank group （n=10）， diabetic model group （n=20）， diseasesymptoms group （n=80）. The rats of blank group received ordinary feeding， while other groups were fed with high sugar and fat diets. During the whole process of feeding， rats of diseasesymptoms group were given with QingpiFuzi （15.75 g·kg-1） once a day through oral administration. Five weeks later， the rats were given with a low dose of STZ （40 mg·kg-1） by intraperitoneal injection to establish experimental diabetic models. Then the models were randomly divided into diseasesymptoms group 1 （Qi and Yin deficiency diabetic group， 15.75 g·kg-1）， diseasesymptoms group 2 （plant protein group， 0.5 g·kg-1）， diseasesymptoms group 3 （animal protein group， 0.5 g·kg-1）， diseasesymptoms group 4 （berberine group， 0.1 g·kg-1）. The drugs were given for 4 weeks by gavage administration. After 4 weeks of protein intervention， the abdominal aortic blood was collected and serum was isolated to analyze its free amino acid by using AQC precolumn derivatization HPLC and fluorescence detector. Four weeks after the protein intervention， plant protein， animal protein and berberine had no obvious effect on body weight and blood sugar in type 2 diabetic rats. As compared with animal protein group， histidine and proline（P<0.01）， serine， glycine， threonine， alanine， tyrosine， valine， methionine， bright+isoleucine， phenylalanine and lysine（P<0.05）changed a lot in rats serum of plant protein group.The results showed that gavage administration of protein would produce effects on amino acid metabolism of Qi and Yin deficiency type 2 diabetic SD rats. Symbolic differential compounds could be found through metabonomics technology， providing experimental basis for early warning of type 2 diabetes and diagnosis of Qi and Yin deficiency syndrome.

[Key words] protein； Qi and Yin deficiency； type 2 diabetes； amino acid

doi：10.4268/cjcmm20162223

糖尿病，中醫學多以“消渴”，“三消”論之。消渴是以煩渴多飲，多食善饑，尿頻且多，久則身體消瘦，疲乏無力，或尿有甜味等為主要癥狀的一類病癥。《內經》明確指出：“甘美肥胖，易患消渴”，這些理論與現代醫學研究認為飲食失控可誘發糖尿病的理論十分吻合。消渴的病機主要在于陰津虧虛，燥熱偏勝，而以陰虛為本，燥熱為標，兩者互為因果，陰愈虛則燥熱愈盛，燥熱愈盛則陰愈虛。陰虛日久傷氣，燥熱傷氣，故出現氣陰兩虛。故糖尿病中最常見的中醫癥候就是氣陰兩虛。這與現在許多中醫學者的觀點一致[17]。目前，膳食營養干預已被國內外公認為是預防和控制糖尿病的重要措施。

新疆各民族的膳食結構主要受環境、經濟、宗教習俗等因素的影響，具有顯著特性。本課題組對維吾爾族2型糖尿病患病率進行了流行病學調查，顯示患病率高達14%，作為新疆主要少數民族，其膳食結構特點以細糧，雞蛋為主副食品，97.2%的人喜歡吃蔬菜水果；哈族的膳食結構則以肉類，奶制品攝入為主，幾乎不吃蔬菜和瓜果。在疾病表型上兩民族也顯示了極大地差別，即同一體重指數下，維吾爾族2型糖尿病高發而哈薩克2型糖尿病低發（1.47%），但高血壓高發（41%）[8]，認為可能是腸道菌群失調影響蛋白質等營養物質的消化與吸收，從而影響體內氨基酸水平[9]。作為新疆地區的特高發疾病，2型糖尿病的發生與膳食結構密切相關，因此有必要深入研究兩民族膳食蛋白代謝產物——氨基酸表達譜的特征，結合近來發展的代謝組學技術及統計方法評價其在2型糖尿病發病中的作用。

本實驗選擇大豆蛋白作為植物蛋白干預，因為其含有最為豐富蛋白質，而且容易被吸收；牛奶蛋白作為動物蛋白干預，其含有酪蛋白和乳清蛋白比較符合哈族膳食結構[10]。

1 材料

1.1 動物 雄性SD大鼠，SPF級，體重180～200 g，新疆醫科大學動物實驗中心提供，生產許可證SYXK（新）20110001；飼養環境光照12 h/d，溫度（21±2） ℃，濕度40%～45%。

1.2 藥物及試劑 青皮（新疆和濟中藥飲片有限公司，批號150701）；黑順片（黃岡金貴中藥產業發展有限公司，批號D5050501）；鹽酸小檗堿（東北制藥集團沈陽第一制藥有限公司，批號2150116）；鏈脲佐菌素（STZ）（Sigma， 批號4361710）；戊巴比妥鈉（美國Amresco公司，批號20151225）；檸檬酸（上海山浦化工有限公司，批號20150701）；檸檬酸三鈉（上海山浦化工有限公司，批號20150701）；多聚甲醛（天津光復精細化工研究所，批號20120820）；氯化鈉（天津永晟精細化工有限公司，批號20151128）；氟化鈉（天津市福晨化學試劑廠，批號20140922）；葡萄糖氧化酶（GOD，100 mg G714110ku）；過氧化物酶（POD，100 mg，156 U·mg-1）；無水葡萄糖（天津永晟精細化工有限公司，批號20120725）；苯酚（天津市盛淼精細化工有限公司，批號20080415）；4氨基安替比林（天津永晟精細化工有限公司，批號20120725）；雪蓮龍大豆分離蛋白粉（山東禹王生態食業有限公司）；牛奶蛋白（原產地法國，INGREDIA FR 62.767.030 CE，批號151224）。

1.3 儀器 Model 680型酶標儀（BIO RAD）；CT15RE離心機（HITACHI CENTRIFUGE）；AB104N型分析天平（梅特勒托勒德）；SL502N型電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；高效液相色譜儀（Waters e2695）；熒光檢測器（Waters 2475）。

2 方法

2.1 分組及給藥 將110只雄性SD大鼠隨機分為空白組（10只），模型組（20只），病癥結合組（80只），正常組大鼠給予普通飼料，其余給予高糖高脂飼料全程喂養，期間病癥結合組灌服青皮附子（15.75 g·kg-1）每日1次，5周后，腹腔注射小劑量STZ（40 mg·kg-1）建立實驗性糖尿病大鼠模型，注射STZ 2周后，禁食不禁水12 h，尾尖采血測定空腹血糖，FBG≥11.1 mmol·L-1為造模成功，造模后出現飲水增多、尿量增多、 生長遲緩、身體消瘦、拉尾排便、排尿等糖尿病大鼠共同特征；病證結合組大鼠則出現精神萎糜，倦怠懶動，舌胖大，舌紅少津或舌暗淡，苔白潤或膩。

將73只成模的雄性SD大鼠隨機分為：糖尿病模型組（12只），病癥結合1組（氣陰兩虛糖尿病組，13只，15.75 g·kg-1）， 病癥結合2組（植物蛋白組，17只，0.5 g·kg-1）， 病癥結合3組（動物蛋白組，16只，0.5 g·kg-1），病癥結合4組（黃連素組，15只，0.1 g·kg-1），連續灌胃給藥4周。

2.2 血糖的測定 采用葡萄糖氧化酶法測定血漿葡萄糖。葡萄糖氧化酶（glucose oxidase，GOD）利用氧氣和水將葡萄糖氧化為葡萄糖酸，并釋放過氧化氫。過氧化物酶（peroxidase，POD）在色原性氧受體存在時將過氧化氫分解為水和氧氣，并使色原性氧受體4氨基安替比林和苯酚縮合為紅色醌類化合物，即Trinder反應。紅色醌類化合物的生成量與葡萄糖含量成正比，可在波長505 nm比色測定。

2.3 血清收集和處理 干預4周后，各組大鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉溶液麻醉；腹主動脈取血，用普通采血管采血，靜置30 min后，4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，-80 ℃保存。

樣品前處理：取200 μL血加入400 μL乙腈除蛋白，渦旋靜置10 min后以12 000 r·min-1離心10 min，取其上清液至卵管，氮吹（40 ℃水浴），100 μL蒸餾水超聲復溶，經0.22 μm濾膜過濾后，進樣10 μL進行色譜分析。

2.4 HPLC條件 有機相（A）為甲醇水乙腈（100∶100∶300），緩沖鹽相（B）為無水乙酸鈉7.4 g、蒸餾水940 mL、乙腈70 mL，加冰乙酸調pH 6.5。線性梯度洗脫：0 min，100% B；5 min，98% B；6 min，94% B；15 min，91% B；19 min，79% B；32 min，55% B。方法學考察參考文獻[11]。

2.5 數據分析 將每個樣品18種氨基酸峰面積依次輸入Excel中，依據對照品的已知濃度求出每個樣本的濃度，再帶入SPSS 17.0統計軟件中，采用OneWay ANOVA方法處理分析。

3 結果

3.1 SD大鼠體重的變化 干預前，各組大鼠體重無顯著性差異，從干預后第1周到第4周，2個模型組老鼠體重持續下降，跟正常組比較具有顯著性差異（P<0.01），且隨著時間的推移差異越來越明顯；牛奶蛋白組與黃連素組老鼠在干預4周后與干預前相比較，體重略微增加，但沒有統計學差異，見表1。

3.2 SD大鼠血糖的變化 干預前2模型組大鼠FBG水平明顯高于正常對照組（P<0.01），其余3給藥組FBG與模型組比較無統計學差異；2模型組大鼠FBG持續增高，大豆蛋白組和牛奶蛋白組在同一周期內與2模型組比較，FBG無顯著性差異；黃連素組雖然比2模型組血糖低，但經SPSS 17.0分析并無顯著性差異，可能是由于給藥劑量不夠大，或時間不夠長，有文獻報道，黃連素給藥劑量0.1，0.2 g·kg-1，給藥時間有6～10周不等[1213]，還有可能是因為此實驗全程高糖高脂飼料喂養，含糖比例比較高為20%，見表2。

3.3 SD大鼠血清氨基酸的代謝譜 本實驗采用AQC柱前衍生結合HPLC測定糖尿病大鼠血清中游離氨基酸含量，18種氨基酸混合對照品與各組樣品在30 min內得到有效地分離，并且衍生試劑峰對血清中氨基酸的測定沒有干擾，見圖1。

3.4 蛋白干預對SD大鼠血清氨基酸代謝產物的影響 應用已成熟的HPLC技術檢測正常組，模型組，各給藥組老鼠血清中氨基酸代謝譜，根據18種氨基酸對照品的濃度算出每個樣本濃度導入到SIMCAP+11軟件中進行模式識別分析。PLSDA（正交偏最小二乘法）分析結果見圖2，其可以有效區分SD大鼠正常組，模型組和各個給藥組，說明這幾組氨基酸的代謝存在著一定的差異。其中牛奶蛋白組與黃連素組樣品分布散點比較接近，提示牛奶蛋白可能與黃連素有著相同的氨基酸代謝過程。

3.5 SD大鼠血清中氨基酸的模式識別分析 由圖3～8可得到模型的擬合程度依次為X軸R2=0.886， Y軸R2=0.647，Q2=0.442；X軸R2=0.881， Y軸R2=0.852，Q2=0.811；X軸R2=0.867， Y軸R2=0.755，Q2=0.708；X軸R2=0.967，Y軸R2=0.382，Q2=0.147；X軸R2=0.932， Y軸R2=0.954，Q2=0.938；X軸R2=0.949， Y軸R2=0.796，Q2=0.742。首先糖尿病模型組，氣陰兩虛糖尿病模型組與正常組比較具有顯著性差異，Q2>0.4，說明造模成功，模型可信度較高，有利于后面給藥組與模型組的分析；糖尿病模型組和氣陰兩虛糖尿病模型組比較Q2=0.708，表明這2種模型有著本質的區別，氨基酸代謝水平不相同；氣陰兩虛糖尿病組與大豆蛋白組相比，Q2=0.147，說明這2組氨基酸代謝無顯著性差異；氣陰兩虛糖尿病組分別與牛奶蛋白組，黃連素組比較，Q2=0.938和Q2=0.742，表明其差異性氨基酸具有很好的預測能力，作為氣陰兩虛2型糖尿病標志性差異化合物。為了更加明確的觀察大豆蛋白和牛奶蛋白對氣陰兩虛2型糖尿病氨基酸代謝的影響，將其進行OPLSDA 分析，見圖9。在有監督的OPLSDA模式識別下分析大豆蛋白組與牛奶蛋白組氨基酸代謝情況，這2組樣品區分明顯，見圖10。此模型得到的擬合程度為X軸R2=0.871， Y軸R2 =0.699，Q2=0.474，其中R2和Q2理論上數值越接近1說明擬合準確性越好，通常Q2大于0.4則認為此模型具有很好的擬合效果和良好的預測能力，所有樣品的數據點均落在95%的置信區間，可信度較高。因此為了能更好的尋找這2組間差異性化合物，采用OPLSDA負載圖進行差異性化合物的尋找。

從OPLSDA的載荷圖中可以看出大豆蛋白組與牛奶蛋白組可能存在的差異性化合物，離中心原點越遠的點為差異性代謝化合物，可以作為潛在生物標記物，為后續研究提供參考依據。結合SPSS 17.0軟件分析可以得出，組氨酸和脯氨酸， 絲氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，酪氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，亮+異亮氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸，見表3。

4 討論

據文獻統計，目前中醫臨床上將糖尿病主要分為陰虛火旺、氣陰兩虛、陰陽兩虛型，分別代表著糖尿病發展的早、中、晚3個時期，各階段出現的并發正常組、糖尿病組、氣陰兩虛糖尿病組和大豆蛋白組、牛奶蛋白組、黃連素組明顯分居3D圖兩側，說

明這兩部分有著明顯的氨基酸代謝差異。其中牛奶蛋白組與陽性藥黃連素組的代謝輪廓十分接近，提示著可能牛奶蛋白與陽性藥黃連素有著相似的氨基酸代謝，從而間接解釋了新疆哈薩克族2型糖尿病低發（1.47%）的原因，是因為哈薩克族常年的膳食結構為肉類，奶制品攝入為主。為了能更加準確的對比大豆蛋白組與牛奶蛋白組之間氨基酸的代謝差異，本實驗采用OPLSDA負載圖結合SPSS軟件一起分析。

此實驗得出，大豆蛋白與牛奶蛋白對氣陰兩虛2型糖尿病大鼠的體重沒有顯著影響，但從數據可以看出牛奶蛋白具有抑制體重負增長的趨勢。Young Eun Choi等[1418]將糖尿病造模成功的老鼠分成2組：DM組和大豆蛋白組，在干預1周后，模型組與大豆蛋白組的血糖都非常高，但是4周以后，大豆蛋白組的血糖明顯下降，與DM模型組相比具有顯著性差異（P<0.01），說明大豆蛋白的確具有降低血糖的作用，與此實驗結果一致。本實驗大豆蛋白組與黃連素組的FBG呈直線下降趨勢，但與DM模型組對比沒有統計學差異，最主要的原因可能是高糖高脂飼料全程喂養，其中含糖比例比較高達20%，因此降糖作用不明顯；還有可能是由于給藥劑量不夠大，或時間不夠長，有文獻報道，黃連素給藥劑量有0.1，0.2 g·kg-1，給藥時間6～10周不等。陽性對照藥選用黃連素，一方面是因為黃連素現代研究發現具有降糖，降脂，改善胰島素抵抗及內皮依賴性血管舒張，降低腎臟AR活性等[1213]；另一方面對于黃連素進入人體內引起的氨基酸代謝還沒有研究，因此選用黃連素作為陽性藥。

從大豆蛋白組與牛奶蛋白組血清樣本的HPLC氨基酸代謝譜與OPLSDA結果中發現多種差異氨基酸：組氨酸和脯氨酸（P<0.01）， 絲氨酸，甘氨酸，蘇氨酸，丙氨酸，酪氨酸，纈氨酸，蛋氨酸，亮+異亮氨酸，苯丙氨酸，賴氨酸（P<0.05）。本課題組先前利用NMR技術對新疆維吾爾族2型糖尿病患者血清進行研究，發現與正常健康志愿者血清比較時，異亮氨酸，亮氨酸，纈氨酸，丙氨酸，谷氨酸，組氨酸，苯丙氨酸，酪氨酸具有顯著差別[1920]，除了谷氨酸外，其他的均與大豆蛋白組與牛奶蛋白組差異氨基酸一致，對于這些差異性氨基酸中究竟哪些氨基酸對于2型糖尿病起著決定性的作用，有待于繼續深入研究。

中醫學理論體系的基本特點是整體觀念與辨證論治，整體觀念認為人是一個有機的整體，人與自然環境，社會環境相統一；辨證論治，即用四診搜集癥狀等其他資料，在中醫指導理論下分析，辨清病因，病機，從而判斷為某種性質的癥候，最終依據辯證的結果，來確定相應的治療方法。代謝組學技術則通過分析某種疾病相關特定組分的共性，來更好的有助于人們了解疾病病變過程及體內代謝水平的異常。將中醫藥與代謝組學相結合，是一個極具創造性意義及將中醫藥推向現代化的重要之舉。

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[責任編輯 張燕]