顱腦創傷后大鼠腦組織自噬表達變化及渥曼青霉素保護作用的研究

湯崇輝 方戰艦 胡益嵐 童云 鄔芬贊 傅小君 魏曉捷

顱腦創傷后大鼠腦組織自噬表達變化及渥曼青霉素保護作用的研究

湯崇輝 方戰艦 胡益嵐 童云 鄔芬贊 傅小君 魏曉捷

目的探索顱腦創傷后大鼠腦組織自噬表達變化及渥曼青霉素的保護作用，為臨床治療腦外傷提供實驗依據。方法將120只健康成年雄性SD大鼠隨機分為3組[假手術組（A組）、顱腦創傷組（B組）、渥曼青霉素治療組（C組）]，每組40只。B、C組使用PinPointTM精密顱腦創傷撞擊器、直徑4mm的打擊頭制作中度創傷性腦損傷模型，其中C組于建模前10min側腦室注入渥曼青霉素（0．5μg/kg），B組注入含有二甲基亞砜（DMSO）的PBS（25μl/kg）；A組暴露硬腦膜但不撞擊，建模前注入含有DMSO的PBS（25μl/kg）。采用Western blot檢測自噬相關蛋白（LC3-Ⅱ，p62）表達水平，應用大鼠行為學評分觀察大鼠顱腦創傷后神經功能的變化，采用干濕法檢測腦組織含水量。結果與A組相比，B組和C組大鼠在顱腦創傷后24、72、168h腦組織LC3-Ⅱ表達水平增加，p62表達水平減少，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高，差異均有統計學意義（均P＜0．05）。與B組相比，C組大鼠在顱腦創傷后24、72、168h腦組織LC3-Ⅱ表達水平減少，p62表達水平增加，差異均有統計學意義（均P＜0．05）；傷后72、168h腦組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（均P＜0．05）。顱腦創傷后48、72h，C組大鼠行為學評分均高于B組（均P＜0．05）。顱腦創傷后72h，B組和C組腦組織含水量均較A組明顯增加（均P＜0．05），但C組較B組明顯減少（P＜0．05）。結論渥曼青霉素能明顯抑制顱腦創傷后過度的自噬反應，減輕腦水腫，改善大鼠神經功能。

顱腦創傷自噬相關蛋白渥曼青霉素

顱腦創傷發生率在全身創傷中位居第二，病殘率位居第一[1]。顱腦創傷后保護神經元是臨床治療腦外傷的重要措施[2]。有研究指出尋求作用于神經細胞死亡程序中的上游靶位或多個靶點才有希望糾正顱腦創傷后神經細胞的變性、壞死，使神經功能恢復正常，從而產生綜合治療效應[3]。亦有研究報道顱腦創傷后腦組織自噬活性明顯增強，或引起神經功能缺失加重[4]。故本研究建立顱腦創傷動物模型，探討顱腦創傷后大鼠腦組織自噬表達變化及渥曼青霉素的保護作用，為臨床治療提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組健康成年雄性SD大鼠120

只，體重（253±16）g，由中國科學院上海實驗動物中心提供[清潔級，編號：SCXK（滬）2012-0002]。采用隨機單位組設計法將SD大鼠分為3組，即假手術組（A組）、顱腦創傷組（B組）和渥曼青霉素治療組（C組），每組40只。每組隨機選取8只進行行為學評分和腦組織水含量檢測，余下32只進行Western blot檢測；根據取材時間點（建模到處死時間）分為6、24、72、168h亞組，各亞組大鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）。所有大鼠飼養于室溫20℃、相對濕度55%、12h晝夜節律（光照時間8：00～20：00）的實驗室中，自由進食、飲水，適應環境l周后開始實驗。

1.2 方法

1.2.1 渥曼青霉素給藥方法將1mg的渥曼青霉素（19545-26-7，美國Aladding公司）溶解于1ml二甲基亞砜（DMSO）中，并用0.1mmol/L的PBS稀釋成50ml，配成20μg/ml的渥曼青霉素溶液。將大鼠用2%戊巴比妥納40mg/kg腹腔麻醉后，固定于立體定向儀上；備皮、消毒后作頭皮正中切口并暴露右頂骨，選取大鼠前鹵后0.8mm、矢狀竇右側1.5mm為腦室穿刺點，穿刺深度4mm。造模前10min，C組大鼠以0.5μg/kg的劑量自右側側腦室注入渥曼青霉素溶液；A組和B組大鼠以25μl/kg的劑量注入相同DMSO濃度的PBS作為對照。1.2.2顱腦創傷動物模型的建立給藥時大鼠已麻醉且固定于立體定向儀上；備皮、消毒后作頭皮正中切口并暴露左頂骨，以冠狀縫后4mm、中線旁開3mm為中心，開直徑5mm的骨窗；使用PinPointTM精密顱腦創傷撞擊器、直徑4mm的打擊頭制作中度創傷性腦損傷模型，打擊速度3m/s，打擊深度2mm，打擊時間120ms。A組大鼠僅開骨窗，不做打擊。

1.2.3 Western blot檢測自噬相關蛋白（LC3、p62）的表用表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），兩兩比較采用q檢驗。

2 結果

2.1 3組大鼠自噬相關蛋白的表達水平與A組相比，B組和C組大鼠在顱腦創傷后24、72、168h腦組織LC3-Ⅱ表達水平增加，p62表達水平減少，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值升高，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。與B組相比，C組大鼠在顱腦創傷后24、72、168h腦組織LC3-Ⅱ表達水平減少，p62表達水平增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；C組大鼠在顱腦創傷后72、168h腦組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值降低（均P＜0.05），見表1～3和圖1。

2.2 3組大鼠行為學評分比較顱腦創傷后48、72h，C組大鼠行為學評分均高于B組（均P＜0.05），見表4。

2.3 3組大鼠腦組織含水量比較大鼠顱腦創傷后72h，3組大鼠腦組織含水量比較差異有統計學意義（F= 9.465，P＜0.01）。B組和C組腦組織含水量分別為（78.71±0.98）%、（77.81±0.29）%，均較A組的（76.86± 1.06）%明顯增加（均P＜0.05）；C組大鼠腦組織含水量達水平每個亞組大鼠8只，在6、24、72、168h時點給予2%戊巴比妥納60mg/kg腹腔注射；在深度麻醉狀態下快速斷頭取腦，取損傷周圍水腫帶交界處腦組織約100mg進行蛋白提取和蛋白含量測定。取40μg蛋白上樣行SDS-PAGE電泳（90V，3h），轉膜后進行抗原封閉；加入LC3和p62特異性抗體（用封閉液按1∶1 000稀釋，美國CST公司），4℃過夜；二抗稀釋液（1∶2 000，北京中杉金橋生物工程有限公司）室溫下孵育2h，ECL反應及曝光、顯影；使用美國Nikon Spot圖像采集處理系統采集圖像，使用Image-ProPlus 5.0專業圖像分析軟件分析條帶并測量累積光密度值。以LC3-Ⅱ和p62條帶累積光密度值與GAPDH條帶累積光密度值之比表示自噬相關蛋白的表達水平，并計算LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。1.2.4大鼠行為學評分大鼠顱腦創傷后3、6、24、48、72h，從平衡能力、翻身、支頭、行走、逃避、四肢活動等6個方面進行行為學評分[5]，分值6～21分，分值越低表示對神經功能影響越大。

1.2.5 干濕法測量腦組織水含量大鼠顱腦創傷后72h，在麻醉下斷頭取腦，取損傷區腦組織放置電子天平上稱濕重。移于烤箱，100℃烤24h至恒重，稱干重。按Elliott公式計算腦組織水含量。腦組織水含量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3 統計學處理應用SPSS17.0統計軟件。計量資料較B組明顯減少（P＜0.05）。

表1 3組大鼠顱腦創傷后不同時點腦組織LC3-Ⅱ的表達水平

表2 3組大鼠顱腦創傷后不同時點腦組織p62的表達水平

表3 3組大鼠顱腦創傷后不同時點腦組織LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值

圖1 Western blot檢測自噬相關蛋白（LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ和p62）表達的電泳圖

表4 3組大鼠顱腦創傷后不同時點的行為學評分比較

3 討論

顱腦創傷是一種常見外傷，隨著經濟發展，我國顱腦創傷發生率有逐年增加的趨勢。一般認為顱腦創傷引起神經功能損傷的機制主要有2種，即原發性損傷和繼發性損傷。繼發性顱腦損傷是指急性創傷后發生的一系列病理生理改變，包括受傷局部發生微血管損傷，血管破裂出血、痙攣或血栓形成，繼而發生組織缺血、缺氧、炎癥反應和組織水腫，從而激活細胞內酶原，破壞組織中各種膜結構，最終導致細胞凋亡、壞死[6]。因此，掌握顱腦創傷后變化和修復機制、有效抑制細胞死亡是保護神經元、促進神經功能損傷修復與重建的首要目標。

自噬是一種細胞通過溶酶體降解途徑調控的細胞器和蛋白循環過程，其激活的主要特征是由雙層膜結構包裹的自噬體或自噬空泡的大量堆積。細胞自噬已被證實與衰老、免疫、細胞死亡和分化有關，且在神經退行性疾病、惡性腫瘤的發病過程中具有重要意義[7]。細胞自噬空泡或自噬體結構的增加預示2種結果：（1）自噬作為一種早期的自我適應性機制，清除受損的細胞器和蛋白，通過溶酶體降解途徑提供營養物質和能量來恢復組織的穩態；（2）過度激活或功能受損的自噬過程會導致細胞死亡，即自噬性細胞死亡，從而加速疾病的發展和惡化[8]。值得注意的是，近期研究表明神經功能損傷過程與細胞自噬密切相關[9]，即在受壓迫性損傷的腦組織中，自噬標志蛋白LC3明顯增加；在顱腦創傷早期、蛛網膜下腔出血模型中均亦發現自噬對腦功能的保護作用。在神經功能損傷后的繼發性損傷（炎癥、缺血、缺氧等）過程中都存在細胞自噬過程的激活，但具體機制和作用存在明顯差異，目前仍未明確[10-11]。

LC3是酵母中自噬相關基因8在哺乳動物中的同源體，能靶向定位于自噬體膜，并始終保留在膜上，是自噬過程中膜動力學很好的標志物，也是目前確認的唯一可信的自噬體標志物。LC3有2種細胞形式，即LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ。細胞中合成的LC3前體在胞質內被加工成可溶型LC3-Ⅰ，經泛素樣蛋白修飾加工，與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺結合成自噬相關蛋白8-磷脂酰乙醇胺復合體即LC3-Ⅱ，從而促使自噬泡的形成。LC3-Ⅱ表達水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值大小均可估算自噬水平的高低[12]。p62是特異性經自噬途徑降解的一種蛋白，通常情況下其表達水平與自噬激活程度成反比[13]。渥曼青霉素是一種自繩狀青霉中分離出來的抗真菌類抗生素，可通過抑制PI3KⅢ型的活性，從而抑制自噬[14]。本研究發現與B組比較，C組大鼠顱腦創傷后LC3-Ⅱ表達水平、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯降低，p62表達水平有所增加，提示側腦室預注入渥曼青霉素能抑制創傷引起的自噬。腦水腫是臨床上常見的繼發性顱腦損傷，本研究結果顯示B組大鼠腦組織含水量較A組明顯增高，C組較B組明顯減少。從大鼠行為學評分來看，在顱腦創傷后48、72h，C組大鼠的行為學評分明顯優于B組，說明渥曼青霉素能有效緩解腦水腫，改善預后。

在不同疾病的不同發生、發展階段，細胞自噬作用具有雙重角色，或保護作用，或加劇損傷。本研究表明側腦室預注入渥曼青霉素能明顯抑制大鼠顱腦創傷后自噬相關蛋白表達水平，減輕腦水腫，改善大鼠神經功能，為臨床治療腦外傷提供了實驗依據。

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Expression of autophagy-related proteins in brain tissue and neuroprotective effect of wortmannin after traumatic cerebral injury inrats

ObjectiveTo investigate the expression of autophagy-related proteins in brain tissues and the neuroprotective effect of wortmannin after traumatic cerebral injury in rats．MethodsOne hundred and twenty healthy adult male SD rats were randomly divided into 3 groups:the sham operation group(A),the traumatic brain injury group(B)and the wortmannin group (C)with 40 animals in each group．Precision cortical impactor was used to establish medium traumatic brain injury model in group B and C with a hit point of 4mm in diameter．The rats were pretreated with a single intracerebroventricular injection of wortmannin in group C,while with injection of DMSO in group B．The rats in group A received surgery to expose the dura without actual impact,and were injected PBS before the modeling．The expression of microtubule-associated protein 1 light chain3 B(LC3-Ⅱ) and p62 in brain tissues were detected by Western blot．The neurologic function of rats was assessed with behavioral score．Water content was evaluated by dry-wet analysis．ResultsThe expression of LC3-Ⅱwas increased in groups B and C compared with group A at 24h,72h and 168h after injury,the expression of p62 was decreased,and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰwas increased(all P＜0．05)．The expression of LC3-Ⅱwas lower in group C than that in group B at 24h,72h and 168h after injury,the expression of p62 was higher(all P＜0．05)in group B and the ratio of LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰwas decreased at 72h and 168h (all P＜0．05)compared to group C．At 48h and 72h after injury,the behavioral scores in group C were significantly higher than that in group B(all P＜0．05)．At 72h,the water contents of brain tissue in group B and C were higher than that in group A,while the water content in group C was significantly lower than that in group B(P＜0．05)．ConclusionWortmannin can suppress the excessive autophagy,reduce the brain edema induced by traumatic cerebral injury and improve the neurological function in rats．

Traumatic brain injuryAutophagy related proteinsWortmannin

2016-06-23）

（本文編輯：陳丹）

寧波市自然科學基金項目（2015A610192）；慈溪市科技計劃項目（CN2015022）

315300慈溪市人民醫院神經外科

湯崇輝，E-mail：tangegg@163.com