三種核酸擴增方法用于診斷肺結核的Meta分析

張青 閆麗萍

·論著·

三種核酸擴增方法用于診斷肺結核的Meta分析

張青 閆麗萍

目的 比較環介導等溫擴增技術(LAMP)、RNA實時熒光恒溫擴增檢測技術(SAT)、Xpert MTB/RIF技術(Xpert)3種檢測方法診斷肺結核的敏感度和特異度。方法 從PubMed、萬方、中國知網等數據庫檢索到運用LAMP、SAT和Xpert方法診斷傳染性肺結核的中英文文獻462篇，選擇其中針對3種診斷方法的敏感度和特異度、樣本為痰液的研究進行薈萃分析(Meta分析)。結果 共納入25篇文獻進行分析，LAMP、SAT、Xpert診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為93%(95%CI：92%～95%)和94%(95%CI：92%～95%)，96%(95%CI：94%～98%)和88%(95%CI：85%～90%)，89%(95%CI：87%～90%)和98%(95%CI：98%～99%)。但不一致指數(I2)均>80%，提示存在研究間的異質性。在隨后根據痰涂片狀態和HIV感染進行的區組分析中，用LAMP法診斷痰涂片陽性的肺結核患者，其敏感度由93%上升至98%(95%CI：97%～99%；I2=2.6%)，特異度降低至68%(95%CI：55%～80%；I2=38.4%)；用Xpert法診斷HIV陰性的傳染性肺結核患者，其敏感度和特異度分別為72%(95%CI：62%～80%；I2=49.6%)和99%(95%CI：97%～99%；I2=64.5%)。結論 LAMP、SAT和Xpert 3種檢測方法診斷肺結核的敏感度和特異度均較高，但眾多研究間存在明顯的異質性，異質性的來源可能是痰涂片結果及是否存在HIV感染，臨床醫生在應用時應考慮患者具體情況對結果做出相應判斷。

結核，肺； 診斷； 核酸擴增技術； Meta分析

據報道，2014年全球新發結核病患者960萬例[1]，這對醫務工作者和患者而言都意味著極大的負擔，早期診斷是預防和控制肺結核傳染源傳播的重要環節。傳統上的痰涂片鏡檢雖然快速但敏感度低，導致臨床漏檢率高。一貫作為金標準的痰培養也因培養時間過長，常常延誤結核病的診斷和治療。隨著分子生物學的發展，建立在核酸擴增基礎上的檢測方法已經獲得世界衛生組織(WHO)的認可，其中比較有代表性的就是美國Cepheid公司開發的基于結核分枝桿菌核酸擴增為基礎的全自動分子診斷方法Xpert MTB/RIF(以下簡稱“Xpert”)[2-3]，集痰標本處理、DNA提取、核酸擴增、利福平耐藥rpoB突變檢測于一體，具有較高的特異度和敏感度[4-7]。因此，WHO于2010年12月批準了該方法的應用，并將其譽為“結核病診斷史上革命性的突破”。近期Steingart等[8]在考克蘭圖書館上發表了一篇Meta分析報道，共納入27項研究，而對其中22個研究的匯總分析發現，Xpert方法的合并敏感度和特異度分別達到89%和99%。但另一方面，Meyer-Rath等[9]也對南非常規化使用Xpert方法的費用及效果進行了評估，結果表明，Xpert在提高結核病傳染源發現的同時也造成了診治費用的大幅度上升。由于此項技術成本高昂，中等及以上發達國家有能力采用此法來檢測疑似結核病患者，及早發現傳染源，但對結核病發病率高的發展中國家，其廣泛應用尚有很長一段距離。

恒溫擴增檢測技術是另一種基于核酸擴增的方法，包括環介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)和RNA實時熒光恒溫擴增 (simultaneous amplification and testing，SAT)。由于LAMP反應在恒溫條件下進行，無需昂貴的核酸擴增儀，僅需一臺恒溫設備，因此成本大大降低[10]。Bi等[11]進行的以hspX基因為靶標的LAMP法是通過識別靶序列上6個特異區域的引物和一種具有鏈置換的DNA聚合酶方法，整個實驗過程在60 min 內完成；SAT法則是將新一代的核酸恒溫擴增技術和實時熒光檢測技術相結合的一種新型核酸檢測技術，由我國自主研發，并獲得了國家專利。兩種方法均可準確鑒定結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌不同亞型的菌種，因此筆者認為這兩種方法都快速、簡單、準確、廉價，有望在結核病高負擔的發展中國家推廣應用。并且已經報道的幾項研究都證實了兩種方法具有較高的診斷肺結核的敏感度和特異度，且用一般實驗室的熒光定量PCR即可進行檢測，成本亦明顯降低[12-15]。

據了解，還未有研究對上述3種核酸擴增檢測方法診斷肺結核的準確性進行對比。同時，針對Xpert的Meta分析研究已有不少，但樣本來源則主要囊括了痰、支氣管肺泡灌洗液等，而LAMP和SAT研究主要采用的是痰樣本。因此，本研究旨在對使用痰樣本的肺結核診斷研究進行分析對比，如果LAMP和SAT在診斷肺結核方面有著能與Xpert匹敵的檢測準確性，其低廉的價格有望在結核病高負擔的發展中國家得以廣泛開展。

資料和方法

一、研究設計

系統回顧采用LAMP、SAT、Xpert診斷肺結核的研究報道，并進行Meta分析。首先在PubMed分別以“loop-mediated isothermal amplification”、“tuberculosis”、“LAMP”、“TB”為關鍵詞搜索LAMP診斷肺結核的英文文獻；以“simultaneous amplification and testing methods”、“tuberculosis”、“SAT”、“TB”搜索SAT診斷肺結核的英文文獻；以“Xpert”、“GeneXpert”、“tuberculosis”、“TB”搜索Xpert診斷肺結核的英文文獻(所有文獻年限設定為2000—2014年)，然后回顧摘要并獲取相關文獻的全文，繼而根據文獻納入標準納入合適的文章；對于SAT的相關研究，由于是中國的自主研發技術，筆者亦在萬方、中國知網檢索并納入了符合入選標準的中文文獻，為了確保無文獻遺漏，筆者還在Google Scholar上進行了相關搜索。

二、文獻納入標準

僅納入同時滿足以下標準的研究：采用LAMP、SAT、Xpert診斷肺結核、樣本為痰液、研究中報道了敏感度和特異度或可計算出敏感度和特異度及參比方法為痰培養(如羅氏培養，或BACTEC MGIT960)的研究。

三、文獻質量評估

采用QUADAS-2工具進行文獻質量評估[16]。主要通過審查文獻中患者選擇、待評價試驗、金標準、患者流程和進展情況來評估。上述所有4個方面在偏倚風險方面都會被評估，前3個方面在臨床適用性方面被評估，并以QUADAS-2量表中標志性問題的回復來確定各納入研究文獻的偏倚風險和臨床適用性(低風險、高風險、不明確)。

四、數據分析

采用Meta-disc 1.4軟件進行此診斷性試驗的Meta分析。首先使用森林圖來獲取該研究診斷準確性的大致評估。

五、異質性分析

1. 閾值效應：探討異質性是了解精確評估相關因素和統計不同研究的精確評估是否適當的關鍵。在診斷試驗中，引起異質性的重要原因之一是閾值效應。當存在閾值效應時，敏感度和特異度呈負相關(或敏感度與1-特異度呈正相關)，其結果在受試者工作曲線(receiver operating curve，ROC)平面圖上呈“肩臂狀分布”。當正相關系數大于0.6時有較強的閾值效應，反之，如小于0.6，敏感度和特異度的合并分析結果是可靠的。

2. 非閾值效應：在診斷試驗系統評價中，除了閾值效應引起研究間異質性外，其他原因如人群、試驗條件、試驗標準等亦可引起研究間異質性。筆者采用診斷比值比(DOR)的Cochran-Q檢驗來檢測是否存在由非閾值效應引起的變異，另外還通過以下2個方面來判斷：(1)肉眼看森林圖中與垂直線的偏離；(2)不一致指數(I2)，根據Cochrane網上異質性檢測手冊，I2可定量分析異質性。0%～50%為異質性不明顯，50%～70%為中度異質性，大于70%則為明顯異質性。

結 果

一、文獻檢索結果

按照檢索策略首先檢索出462篇相關文獻，其中LAMP 116篇，SAT 83篇，Xpert 263篇，回顧摘要后剔除并非針對3種診斷方法的敏感度和特異度的研究384篇，全文回顧剩余文獻并剔除樣本非痰、肺外結核等研究53篇，最終納入25篇文獻進行Meta分析(圖1)。按照擬定效應指標提取出各文獻中的相關數據(表1)。

表1 納入研究的基本信息

續表1

注 TP：真陽性；FP：假陽性；FN：假陰性；TN：真陰性；Boehme等[27-28]在2010年和2011年分別進行了兩項多中心研究，由于對納入的不同患者分別報道了檢測結果(即TP、FP、FN、TN)，根據其不同的患者組別分別進行了a、b、c、d、e、f的編號

圖1 各原始研究納入流程

二、3種方法診斷的敏感度和特異度

圖2 LAMP診斷肺結核的合并敏感度和特異度

圖4 Xpert診斷肺結核的合并敏感度和特異度

從森林圖上直觀發現LAMP診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為93%(95%CI：92%～95%)、94%(95%CI：92%～95%)(圖2)。SAT診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為96%(95%CI：94%～98%)、88%(95%CI：85%～90%)(圖3)，且各研究大多未明顯偏離其合并預測值，在敏感度方面更為明顯。Xpert診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為89%(95%CI：87%～90%)、98%(95%CI：98%～99%)(圖4)。3種檢測方法的敏感度和特異度相應I2值均在80%以上(LAMP診斷的敏感度和特異度相應的I2值分別為85.8%和90.3%，SAT診斷的敏感度和特異度相應的I2值分別為83.0%和89.6%，Xpert診斷的敏感度和特異度相應的I2值分別為90.8%和88.5%)，這提示存在明顯異質性。

三、異質性分析

3種診斷方法的敏感度和特異度Meta分析結果都有著較高的I2值，這提示研究間存在異質性，因此直接在此基礎上進行匯總分析的可靠程度頗受質疑，為此，筆者從閾值效應及區組分析上來探討其異質性的可能來源。

1. 閾值效應分析：真陽性率與假陽性率間的Spearman等級相關性分析結果表明：3種診斷方法均不存在有統計學意義的相關性，這提示并非閾值效應導致了異質性(表2)。

表2 Spearman 等級相關性分析

2. ROC曲線：3種診斷方法的ROC曲線均未顯示明顯的肩臂狀分布，這提示并無明顯的閾值效應存在。

3.DOR的Cochran-Q檢驗：3種診斷方法的DOR的Cochran-Q檢驗均提示非閾值效應導致了異質性(圖5～7)。

四、區組分析

1. LAMP區組分析：痰涂片陽性組，從森林圖中發現在痰涂片陽性組分析中，敏感度和特異度的相應I2值分別為2.6%、38.4%(圖8)，在此基礎上進行的敏感度和特異度匯總則分別為98%(95%CI：97%～99%)、68%(95%CI：55%～80%)。

痰涂片陰性組，從森林圖上發現LAMP在痰涂片陰性組中診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為72%(95%CI：64%～79%)、93%(95%CI：91%～94%)，少數研究明顯偏離其合并預測值，同時，無論是敏感度還是特異度，其相應I2值均在80%以上(圖9)，這提示存在明顯異質性。

靶向序列為16S RNA，從森林圖發現LAMP在靶向序列為16S RNA組中診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為97%(95%CI：95%～99%)、91%(95%CI：87%～94%)，少數研究明顯偏離其合并預測值，同時，敏感度和特異度的相應I2值分別為60.6%、91.3%(圖10)。

圖5 Xpert診斷比值比的Cochran-Q檢驗

圖6 LAMP診斷比值比的Cochran-Q檢驗

圖7 SAT診斷比值比的Cochran-Q檢驗

圖8 LAMP檢測痰涂片陽性組的敏感度和特異度

圖9 LAMP檢測痰涂片陰性組的敏感度和特異度

圖10 LAMP檢測靶向序列為16S RNA組的敏感度和特異度

2. Xpert區組分析：HIV陽性組，從森林圖上發現Xpert在HIV陽性組中診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為79%(95%CI：71%～86%)、99%(95%CI：97%～99%)，多數研究均未明顯偏離其合并預測值，同時，敏感度和特異度的相應I2值分別為72.9%、64.4%(圖11)。

HIV陰性組，從森林圖上發現Xpert在HIV陰性組中診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為72%(95%CI：62%～80%)、99%(95%CI：97%～99%)，多數研究均未明顯偏離其合并預測值，且就本區組而言，納入研究的診斷敏感度普遍偏低(28%～72%)。同時，敏感度和特異度相應的I2值分別為49.6%、64.5%(圖12)。

從痰涂片陰性組的森林圖發現，Xpert診斷肺結核的合并敏感度和特異度分別為59%(95%CI：51%～67%)、98%(95%CI：97%～99%)，多數研究均明顯偏離其合并預測值，同時，敏感度和特異度的相應I2值分別為66.7%、93.3%(圖13)。

五、原始研究質量評估

幾乎所有的納入文獻均有著較低的偏差風險和臨床適用性擔憂(表3)。但是LAMP和SAT在患者納入上均未提及是否連續或隨機納入，但在參考方法及患者流向上都有著低偏差風險。

圖11 Xpert檢測HIV陽性組的敏感度和特異度

圖12 Xpert檢測HIV陰性組的敏感度和特異度

圖13 Xpert檢測痰涂片陰性組的敏感度和特異度

原始研究偏倚風險適用性患者選擇待檢測試驗金標準患者流程和進展患者選擇待檢測試驗金標準Sekadde2013[17]低低低低低低低Rachow2012[18]低低低不明確不明確低低Myneedu2014[19]不明確低低低低低低Rachow2011[20]低低低不明確不明確低低Nicol2011[21]低低低低低低低Helb2010[22]低低低不明確低低低Kurbatova2013[23]低低低不明確低低低Sohn2014[24]低低低低低低低Zar2013[25]低低低低低低低Hanrahan2013[26]低低低低低低低Boehme2010a[27]低低低低低低低Boehme2010b[27]低低低低低低低Boehme2010c[27]低低低低低低低Boehme2010d[27]低低低低低低低Boehme2010e[27]低低低低低低低Boehme2011a[28]低低低低低低低Boehme2011b[28]低低低低低低低Boehme2011c[28]低低低低低低低Boehme2011d[28]低低低低低低低Boehme2011e[28]低低低低低低低

續表3

討 論

筆者進行了此Meta分析研究，以對比Xpert、LAMP及SAT診斷傳染性肺結核的敏感度和特異度。在最初研究設計時，筆者主要還是想更多注重國際期刊上發表的文獻，或者在PubMed上有英文摘要的核心期刊。檢索所得Xpert、LAMP相關文獻量頗為豐富，而SAT相關文獻偏少。鑒于SAT技術是國內自主技術，筆者還在萬方、中國知網上進行了檢索。隨后筆者分別對3種技術進行了匯總分析，森林圖上首先發現3種方法各自納入的研究均有著較高且相似的敏感度和特異度，僅有少數研究明顯偏離匯總預測值；進一步匯總3種方法的敏感度和特異度亦相似，這似乎可以認為三者在診斷肺結核的準確性上可相互匹敵。但是，不容忽視的是三者無論是敏感度還是特異度，其相應的I2值大多在80%以上，提示Meta分析中納入的研究間存在著較大的異質性，單純匯總這些結果顯然是莽撞的。過去已有不少針對Xpert和LAMP的Meta分析的研究。Walusimbi等[39]分析研究了Xpert診斷痰涂片陰性肺結核患者的敏感度和特異度，其相應的I2值分別為70.8%、69.7%，作者根據HIV狀態進行了區組分析，結果其相應的I2值分別為33.6%、9.3%，說明痰涂片結果是導致其異質性的原因之一。

筆者仔細尋找了3種診斷方法Meta分析的異質性來源，但Spearman 等級相關性分析和ROC曲線觀察均提示不存在明顯的閾值效應，這表明研究的異質性來源于非閾值效應。事實上，鑒于LAMP和SAT的相關報道相對少于Xpert，且其采用樣本多為痰液，3種檢測方法的研究中筆者僅納入了相對單純的報道，而那些樣本為支氣管肺泡灌洗液、腦脊液，或肺結核并發肺外結核的研究則排除在外，但結果仍有較大的異質性，反過來可以表明人為控制的因素可能對研究間異質性的貢獻并不大。結合以往的文獻報道，筆者著重按照痰涂片結果、HIV感染狀態對LAMP和Xpert進行了區組分析。發現在LAMP痰涂片陽性組中，敏感度和特異度的相應I2值分別為2.6%、38.4%，痰涂片陰性組中其相應I2值均在80%以上，這提示了痰涂片狀態是導致LAMP診斷肺結核研究間異質性的重要來源。而在16S RNA的區組分析中，敏感度和特異度的相應I2值仍較高，這提示靶向序列也是導致LAMP異質性的重要來源。在Xpert方法HIV陰性組中，敏感度和特異度的相應I2值分別為49.6%、64.5%，HIV陽性組中相應I2值分別為72.9%、64.4%，較總體分析中的90.8%、88.5%亦有明顯降低，這支持HIV狀態影響Xpert診斷肺結核的研究間異質性的推測。而SAT由于納入文獻較少，且未對痰涂片結果、HIV感染等進行區分報道，筆者并未對其進行區組分析。但與LAMP一樣同為恒溫核酸擴增，推測痰涂片結果、HIV感染亦在其異質性中扮演了重要角色。

在LAMP涂片陽性組中，敏感度匯總則為98%(95%CI：97%～99%)，這表明其對涂陽患者的極高敏感度。筆者沒有對Xpert進行涂陽區組分析，因為所納入的研究幾乎都檢測出了涂陽樣本，這也肯定了Xpert對涂陽患者的極高敏感度。

在Xpert 涂片陰性組中，筆者發現其敏感度在28%～72%之間，較Xpert整體分析明顯降低，這提示該法對痰涂片陰性患者的診斷價值偏低。而LAMP涂片陰性組中，敏感度在55%～100%之間，合并敏感度為72%(95%CI：64%～79%)，提示對于涂片陰性的患者，LAMP似乎更有優勢。

需要提及的是，Boehme等[28]和Rachow 等[18]的研究中分別報道了44%、43%的Xpert診斷肺結核的敏感度，前者研究國家是加拿大，屬于結核病低發病率的國家，而后者研究的是平均年齡僅為38.4個月的兒童。Bates等[40]采用胃灌洗液調查了Xpert診斷兒童肺結核的敏感度，結果敏感度僅為65%，這提示低發病率、幼齡兒童可能降低Xpert診斷的敏感度。

這些區組分析雖然反映出了涂片狀態、HIV感染等對異質性的一定貢獻，但總體結果仍然欠佳，即區組中仍然存在較大的異質性。其后筆者嘗試根據研究人種、地域進行分組，但區組化后的研究甚少，筆者認為結果欠穩健而未采用。不管怎樣，對本研究中的異質性筆者也自認為欠佳，但畢竟不同于隨機對照研究的Meta分析，雖匯總結果提示較大異質性，但各具體原始研究中對診斷敏感度和特異度都報道了較高的、且頗為一致的結果，因此筆者認為將其表述出來對指導臨床具有價值。

雖然SAT的匯總分析研究發現有較大的異質性，但各項研究均報道了較高的敏感度和特異度，這還是肯定了其對肺結核診斷的價值。遺憾的是該檢測方法開展時間不長，研究數量較少，未能進行區組分析以對其異質性進行探索。

不管怎樣，此次Meta分析所納入的Xpert、LAMP和SAT相關研究都報道了較高且相似的肺結核診斷的敏感度和特異度，肯定了其各自在肺結核診斷領域中的價值。痰涂片結果和HIV感染可能是導致其研究間異質性的重要來源。Xpert方法已經得到了WHO的認可，其對涂陽樣本有著良好的診斷敏感度和特異度。但對于涂陰樣本、結核病低發病率地區及幼齡兒童的肺結核診斷敏感度則稍為遜色。而同為恒溫核酸擴增的LAMP和SAT亦有著較高的敏感度和特異度，尤其是LAMP在診斷涂陽樣本中表現出了與Xpert相當的高敏感度，在涂陰樣本中似乎還要優于Xpert，其低成本的優勢將有望在發展中國家中推廣。而SAT研究的匯總分析雖有著較大異質性，但各項研究均呈現出了幾乎類似的高敏感度和特異度，相信隨著這兩種恒溫核酸擴增研究的豐富，其診斷肺結核的價值將得到更多的肯定。

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(本文編輯：郭萌)

Meta-analysis of three multiplex PCR for pulmonary tuberculosis diagnosis

ZHANGQing,YANLi-ping.

TuberculosisClinicandResearchCenter,ShanghaiPulmonaryHospital,TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200433,ChinaCorrespondingauthor:ZHANGQing,Email:zhqi709851@sohu.com

Objective To compare the sensitivity and specificity of loop-mediated isothermal amplification (LAMP), simultaneous amplification and testing (SAT), and Xpert MTB/RIF for the diagnosis of pulmonary tuberculosis. Methods Meta-analysis of previous studies of LAMP, SAT, and Xpert MTB/RIF for the diagnosis of pulmonary tuberculosis that used laboratory culturing as the reference method. Results In 25 previous studies, the pooled sensitivity and specificity of the diagnosis of tuberculosis was 93% (95%CI: 92%-95%) and 94% (95%CI: 92%-95%) for LAMP, 96% (95%CI: 94%-98%) and 88% (95%CI: 85%-90%) for SAT, and 89% (95%CI: 87%-90%) and 98% (95%CI: 98%-99%) for Xpert MTB/RIF, respectively. The inconsistence index (I2) values for the pooled data were >80%, indicating significant heterogeneity. Further subgroup analysis stratified by smear or HIV condition was performed. In the smear-positive subgroup analysis of LAMP, the sensitivity increased from 93% to 98% (95%CI：97%-99%；I2=2.6%),and the specificity was 68% (95%CI: 55%-80%;I2=38.4%). In the HIV-negative subgroup analysis for Xpert MTB/RIF, the pooled sensitivity and specifi-city were 72% (95%CI: 62%-80%;I2=49.6%) and 99% (95%CI: 97%-99%;I2=64.5%), respectively. Conclusion LAMP, SAT and Xpert MTB/RIF had comparably high levels of sensitivity and specificity for the diagnosis of tuberculosis. However, the results of these tests should be interpreted with caution because each has previously demonstrated significant heterogeneity, which may be related to variation in the smear or HIV status of patients.

Tuberculosis, pulmonary; Diagnosis; Nucleic acid amplification techniques; Meta-analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.01.015

200433 同濟大學附屬上海市肺科醫院結核病臨床研究中心

張青，Email：zhqi709851@sohu.com

2016-09-27)