IL-1β促進肺癌細胞增殖的作用機制研究①

石玉榮 吳軍錄 權文強 李 冬

(蚌埠醫學院生物化學與分子生物學教研室，蚌埠233000)

IL-1β促進肺癌細胞增殖的作用機制研究①

石玉榮 吳軍錄②權文強③李 冬②③

(蚌埠醫學院生物化學與分子生物學教研室，蚌埠233000)

目的：研究IL-1β在巨噬細胞促進肺癌細胞增殖的作用機制。方法：采用Transwell?插入式細胞培養皿共培養人肺癌細胞株A549、NCI-H520細胞和巨噬細胞。BrdU-ELISA法檢測巨噬細胞對肺癌細胞的增殖能力。采用Real-time PCR法檢測巨噬細胞和A549、NCI-H520細胞中IL-1β mRNA的表達。應用IL-1β的中和抗體抑制IL-1β的活性，觀察IL-1β在巨噬細胞促進肺癌細胞增殖中的作用。利用Western blot法檢測肺癌細胞中自噬標志物Beclin 1的表達。結果：BrdU-ELISA檢測結果：A549細胞與巨噬細胞以1∶0.5的比例共培養，A549細胞的OD值從(0.41±0.06)增加到(1.13±0.10)，差異有統計學意義(P<0.05)，且A549細胞的OD值隨共培養巨噬細胞比例的增加而升高(P<0.05)。NCI-H520細胞與不同濃度的巨噬細胞共培養后，NCI-H520細胞的OD值變化趨勢與A549細胞相似。Real-time PCR法檢測結果：在共培養后，巨噬細胞中IL-1β mRNA的表達顯著上調，且有時間依賴性，并顯著高于肺癌細胞中的表達。加入IL-1β中和抗體后，BrdU ELISA法檢測的細胞增殖，結果顯示IL-1β中和抗體可明顯抑制巨噬細胞對肺癌細胞A549和NCI-H520的增殖促進作用。Western blot法檢測結果顯示IL-1β可顯著抑制腫瘤細胞Beclin 1的表達。結論：巨噬細胞和肺癌細胞通過增強IL-1β的表達促進腫瘤細胞的增殖。抑制腫瘤細胞的自噬可能是IL-1β促進肺癌發展的作用機制。

巨噬細胞；肺癌；IL-1β；細胞增殖；自噬

肺癌的發病率和死亡率一直居于各種腫瘤的前列，其中非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)是最為普遍的肺癌類型，占肺癌發病總數的85%，5年生存率只有15%[1]。臨床和實驗研究表明炎癥與腫瘤有著極為密切的聯系[2]。腫瘤微環境中存在的炎癥因子對腫瘤形成和發展的每一步都十分重要[3]。IL-1β是IL-1家族最重要的一員，具有強大的前炎癥活性，與細胞的惡變，腫瘤的形成及轉移有著極為密切的關系[4]。前期有研究發現，在大腸癌中，由巨噬細胞分泌的IL-1β是大腸癌生長的重要因子[5]。在肺癌中，表達上調的IL-1β是炎癥促進肺癌形成的重要因素，可顯著促進肺癌細胞的增殖和轉移[6]。但是前期的肺癌研究只局限在IL-1β對腫瘤的直接作用，沒有涉及到腫瘤微環境中包含的炎癥免疫細胞如巨噬細胞在其中的作用，因此，IL-1β在肺癌微環境中的表達，及其對肺癌發展的作用和機制至今尚不清楚，還需進一步研究。本研究中，我們將在體外以共培養方式建立腫瘤微環境模型，研究巨噬細胞促進肺癌細胞增殖的效應和機制，并探討了IL-1β在其中的重要作用，為肺癌的臨床治療提供一個潛在的研究方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要抗體和試劑 兔抗人Beclin 1抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；重組人IL-1β和人IL-1β中和抗體購自美國R&D公司；免疫球蛋白IgG購自美國Sigma公司；10%胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；Transwell? 插入式細胞培養皿購自美國Corning公司；BrdU-ELISA試劑盒購自瑞士羅氏公司；ECL化學發光劑購自Thermo公司；Trizol試劑購自Invitrogen公司產品；QPCR SYBR試劑盒購自美國Bio-Rad公司。

1.1.2 細胞來源和培養 肺癌細胞： NCI-H520購自中國科學院上海細胞庫，A549細胞購自美國ATCC。巨噬細胞：分離人外周血單核細胞，于含10%FBS的DMEM完全培養基中擴大培養，加巨噬細胞集落刺激因子50 ng/ml繼續培養 5 d，形態學和巨噬細胞表面標志分子CD14和CD68鑒定。

1.2 方法

1.2.1 BrdU-ELISA法檢測共培養后肺癌細胞的增殖能力 使用Transwell? 插入式細胞培養皿，將肺癌細胞與巨噬細胞在含10%FBS的DMEM培養液中共培養4 d。實驗分組：將每株肺癌細胞各分為4組，1組為肺癌細胞單獨培養組； 2、3、4組按肺癌細胞和不同比例的巨噬細胞(1∶0.5、1∶1和1∶2)共培養，其中肺癌細胞單獨培養在24孔板中，巨噬細胞培養在Transwell?培養皿中。肺癌細胞與不同濃度巨噬細胞共培養4 d后，按照BrdU-ELISA試劑盒操作說明檢測各樣本的吸光度。

1.2.2 BrdU-ELISA法檢測IL-1β對肺癌細胞的增殖能力的影響 實驗分組：將每株肺癌細胞各分為3組，第1組為肺癌細胞單獨培養組； 第2組為肺癌細胞與巨噬細胞按1∶1的比例共培養組，并加免疫球蛋白IgG作為對照；第3組為肺癌細胞與巨噬細胞按1∶1的比例共培養組，第3組為共培養后，加入10 μg/ml IL-1β中和抗體。按照BrdU-ELISA試劑盒操作說明檢測肺癌細胞的增殖能力。

1.2.3 Real-time PCR 檢測巨噬細胞和肺癌細胞中IL-1β mRNA的表達 將2×105個肺癌細胞與巨噬細胞按1∶1的比例進行共培養。收集所需細胞，按照試劑盒說明書提取總mRNA，逆轉錄生成cDNA，實時定量PCR檢測IL-1β mRNA的表達。反應條件：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60℃退火45 s，70℃延伸45 s，25個循環；70℃延伸5 min。以β-actin為內參。引物序列如下，IL-1；F:5′-ATGGCAGAAGTACCTAAGCTC-3′；R:5′-TTAGGAAGACACAAATTGCATGGTGAACTCAGT-3′。β-actin，F： 5′-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3′；R：5′-CTGGTGCCT-GGGGCG-3′。

1.2.4 Western blot法檢測Beclin 1蛋白的表達 肺癌細胞經10 ng/ml IL-1β作用到待檢時間后，收集細胞，加入細胞裂解液裂解細胞，提取細胞蛋白樣品定量。取40 μl總蛋白與等體積2×上樣緩沖液混合，變性后上樣于10% SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉膜，用含5%脫脂奶粉封閉，加一抗4℃孵育過夜，經TBS-T充分洗滌，加HRP-羊抗兔抗體，TBS洗滌，用化學發光試劑盒定影顯影。

2 結果

2.1 巨噬細胞促進肺癌細胞的增殖 BrdU-ELISA法分析結果顯示(表1)，A549細胞與不同比例的巨噬細胞共培養4 d后，與A549細胞單獨培養組比較，共培養組的A549細胞的吸光度明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)，隨著巨噬細胞數量的增多，A549細胞的吸光度增加的越明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。與不同濃度的巨噬細胞共培養后，NCI-H520細胞的增殖變化趨勢與A549細胞相似。提示巨噬細胞可以促進肺癌細胞的增殖，且促進作用隨巨噬細胞比例的增加而增加。

LungcancercellsControlLungcancercell：macrophage1∶051∶11∶2FvaluePvalueA549041±006113±0101)232±0301)2)379±0351)2)3)3896001NCI?H520031±007071±0061)197±0211)2)345±0231)2)3)744001

Note：Compared with the control group，1)P<0.05；compared with the 1∶0.5 group，2)P<0.05；compared with the 1∶1 group，3)P<0.05.

圖1 Real-time PCR 檢測IL-1β mRNA在巨噬細胞和A549細胞中的表達Fig.1 Detect expression of IL-1β mRNA in macrophages and A549 cells by Real-time PCRNote: Compared with the macrophages 0 h group，*.P<0.05；compared with the A549 cell 0 h group，#.P<0.05.

圖2 Real-time PCR 檢測IL-1β mRNA在巨噬細胞和NCI-H520細胞中的表達Fig.2 Detect expression of IL-1β mRNA in macrophages and NCI-H520 cells by Real-time PCRNote: Compared with the macrophages 0 h group，*.P<0.05；compared with the NCI-H520 cell 0 h group，#.P<0.05.

LungcancercellControlLungcancercell∶macrophage=1∶1ControlIgGIL?1βneutralizingantibodyFvaluePvalueA549055±003363±033146±0181)5472001NCI?H520055±004294±038153±0201)2371001

Note：Compared with the control IgG group，1)P<0.05

2.2 共培養增強巨噬細胞和肺癌細胞IL-1β mRNA的表達 Real-time PCR檢測結果顯示在與肺癌A549細胞或NCI-H520細胞共培養8 h后，巨噬細胞中IL-1β mRNA的表達顯著上調，且隨著時間的延長其表達增加(P<0.05,圖1、2)。A549細胞和NCI-H520細胞IL-1β mRNA表達也上調，但是上升的幅度顯著低于巨噬細胞(圖1、2)。

2.3 IL-1β中和抗體抑制巨噬細胞的促肺癌細胞增殖作用 BrdU ELISA法檢測的結果顯示，A549細胞與巨噬細胞以1∶1的比例共培養后，對照IgG組的A值為(2.95±0.11)，IL-1β中和抗體組的A值為(1.45±0.04)，差異有統計學意義(P<0.05，表2)。NCI-H520細胞的檢測結果與A549細胞相似，提示：IL-1β中和抗體也可抑制A549細胞和NCI-H520細胞的增殖(P<0.05，表2)。

圖3 Western blot 檢測IL-1β處理肺癌細胞后Beclin 1蛋白的表達Fig.3 Detect expression of Beclin 1 protein in IL-1β treated lung cancer cells by Western blotNote: A.A549 cell;B.NCI-H520 cell Compared with the 0 h group，P<0.05.

2.4 IL-1β對肺癌細胞自噬的影響 Western blot法檢測的結果顯示，IL-1β分別作用于肺癌細胞A549和NCI-H520后，自噬相關蛋白Beclin 1的表達在兩種細胞里隨著作用時間地延長逐漸下調，與0 h組相比有統計學差異P<0.05 (圖3)。提示IL-1β可降低肺癌細胞的自噬能力。

3 討論

腫瘤微環境在腫瘤的發生、發展中的重要作用已被生物醫學界廣泛認可，但具體的作用機制現仍不清楚。在本研究中我們發現，巨噬細胞與肺癌細胞共培養時，巨噬細胞促進了肺癌細胞增殖，肺癌細胞增強了巨噬細胞IL-1β的表達；IL-1β下調腫瘤細胞Beclin 1表達，抑制細胞自噬。提示對肺癌細胞自噬能力的影響可能是IL-1β促進肺癌細胞增殖的作用機制。

在腫瘤發生發展過程中，常有炎癥細胞如巨噬細胞的浸潤，這也是腫瘤的重要特征[7]。腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophages，TAMs)是滲入腫瘤組織的巨噬細胞，其數量與腫瘤的預后不良關系密切[8]。激活的TAMs滲入到腫瘤微環境中，通過自分泌和旁分泌的方式產生細胞因子和趨化因子，調控腫瘤的生長[9]。在巨噬細胞缺陷的小鼠中，腫瘤的生長和轉移幾乎被完全抑制[10,11]。抑制小鼠炎癥免疫細胞的NF-κB信號途徑，顯著抑制小鼠肺部炎癥反應，導致小鼠肺腫瘤生長阻滯[7,9]。前期我們的研究發現[7]，在人類肺腺癌和鱗癌組織中有大量的巨噬細胞浸潤，而正常的肺組織中僅有少量巨噬細胞。本研究結果顯示，巨噬細胞可以顯著促進2株肺癌細胞株A549細胞和NCI-H520細胞的增殖，并且具有明顯的巨噬細胞數量依賴性。但是巨噬細胞浸潤與肺癌的發展還存在爭議。Koukourakis等[12]發現在Ⅰ～Ⅱ期的非小細胞肺癌患者中，巨噬細胞數量決定了肺癌患者的預后，巨噬細胞浸潤數量越多，患者預后越差。而在Kerr[13]的研究中，發現在對腫瘤生長抑制的非小細胞肺癌標本分析中，高巨噬細胞數目與腫瘤的生長抑制存在正相關。不同的巨噬細胞評價方法可能是導致結論不一致的原因，這一問題將有待今后進一步研究。

現已有研究表明[14]，巨噬細胞可產生多種細胞因子，對腫瘤的增殖和發展具有重要作用，如白介素、腫瘤壞死因子等。IL-1β是巨噬細胞表達的重要前炎癥因子，多個研究發現IL-1β對肺癌，大腸癌等腫瘤的發展具有促進作用[4,6]。其機制包括：IL-1β可通過激活大腸癌的wnt信號途徑促進腫瘤細胞的生長[15]；IL-1β具有血管生成功能，可以增加肺腫瘤周圍的血管形成[15]。IL-1β通過抑制肺癌細胞microRNA-101/Lin28B 途徑促進肺癌的發展[6]。本研究采用肺癌細胞與巨噬細胞共培養，檢測巨噬細胞和腫瘤細胞中IL-1β 的表達。結果顯示，當肺癌細胞與巨噬細胞共培養時，巨噬細胞中的IL-1β表達顯著增強，且高于肺癌細胞IL-1β的表達，提示共培養時IL-1β的表達和分泌主要來源于巨噬細胞。進一步采用IL-1β中和抗體抑制IL-1β，結果顯示巨噬細胞促進肺癌細胞增殖的能力明顯減低，證實巨噬細胞釋放的IL-1β是其促進腫瘤細胞增殖的關鍵因素。

IL-1β可被多種炎癥中介物調控表達，是巨噬細胞分泌的主要炎性細胞因子之一[4,5]。研究發現[5]，肺癌病人的肺泡巨噬細胞分泌的IL-1β遠高于同一病人外周血單核細胞，顯示了其在腫瘤發展中的作用。IL-1β通過誘導GSK3β磷酸化，穩定β-catenin，增強TCF依賴的基因活性，從而激活腫瘤細胞Wnt/β-catenin信號途徑促進腫瘤增殖[5]。自噬(Autophagy)是一個受到高度調控的對細胞內物質進行周轉的重要過程[16]。該過程中一些臨時的或損壞的蛋白質和細胞器通過溶酶體進行降解并得以循環利用，以實現細胞本身的代謝需要和某些細胞器的更新[9]。自噬可出現在機體的多種生理和病理過程，其所起的作用是正面還是負面的尚未完全闡明，對腫瘤的研究尤其如此，值得關注[17]。我們的結果發現，IL-1β的刺激顯著降低肺癌細胞Beclin1蛋白的表達。Beclin1是一種腫瘤抑制蛋白，是哺乳動物參與自噬的特異性基因，刺激自噬的發生[16]。結果提示，IL-1β很可能通過抑制Beclin1的表達，進而抑制肺癌細胞自噬的發生，導致肺癌細胞增殖增強。已有研究表明，在乳腺癌小鼠模型中，抑制腫瘤細胞Beclin1基因表達，顯著增加小鼠腫瘤的數量，加快腫瘤的生長。而在肝細胞癌肺轉移小鼠模型，通過沉默Beclin1基因抑制自噬，卻顯著降低肝細胞癌的肺轉移。因此，IL-1β在小鼠肺癌模型中是否通過調控腫瘤細胞自噬相關蛋白抑制自噬，從而促進腫瘤生長還需要進一步研究。

綜上所述，本研究結果顯示，肺癌細胞與巨噬細胞共培養，巨噬細胞能促進肺癌細胞增殖，肺癌細胞增強了巨噬細胞中IL-1β的表達，IL-1β可下調腫瘤細胞自噬能力。

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[收稿2016-06-25 修回2016-09-21]

(編輯 許四平)

Study on mechanisms of IL-1β promoted lung cancer cells proliferation

SHIYu-Rong,WUJun-Lu,QUANWen-Qiang,LIDong.

DepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,BengbuMedicalCollege，Bengbu233000，China

Objective:To investigate the mechanisms of IL-1β promoted lung cancer cells proliferation.Methods: The “Transwell? Inserts” system was used to coculture lung cancer cells A549，NCI-H520 with macrophages.BrdU ELISA used to measure the effect of macrophages promoted lung cancer cells proliferation.Expression of mRNA of IL-1β in A549 and NCI-H520 cells were analysed by Real-time PCR analysis.IL-1β was responsible for macrophage-promoted lung cancer cells growth,IL-1β neutralizing antibody was added.The autophagy marker Beclin1 protein was detected by Western blot.Results: The BrdU ELISA assay showed that after coincubation with macrophages in the proportion of 1∶0.5,the OD value of A549 increased from(0.41±0.06)to(1.13±0.10).There was statistical significance(P<0.05).It also showed that the growth of the A549 cell was dependent on the macrophage number(P<0.05).The OD value variability of NCI-H520 cells was as same as A549 cell upon cocultured with macrophages.Real-time PCR results showed that the expression of IL-1β mRNA in macrophages was remarkably enhanced in a time dependent manner upon coincubated with lung cancer cell,and the expression level was higher than lung cancer cells.Addition of IL-1β neutralizing antibody markedly inhibited macrophage-promoted lung cancer cells proliferation.The OD value of these two cells were decreased from(3.63±0.33) to (1.46±0.18),from (2.94±0.38) to (1.53±0.20),respectively (P<0.05).After treatment with IL-1β,the expression of Beclin1 was significantly inhibited in tumor cells.Conclusion: Over-expression of IL-1β from macrophages and lung cancer cells is responsible for proliferation of tumor cells in coculture condition.Inhibition of autophagy in tumor cells may be the important mechanisms of IL-1β promotes lung cancer cells proliferation.

Macrophages；Lung cancer；IL-1β；Cell proliferation；Autophagy

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.004

①本文為國家自然科學基金(81272603，81472179)和安徽省自然科學基金(KJ2014A162)資助項目。

石玉榮(1974年-)，女，碩士，副教授，主要從事腫瘤分子生物學方面的研究。

R734.2

A

1000-484X(2017)01-0020-05

②同濟大學附屬同濟醫院檢驗科，上海200065。

③通訊作者，E-mail: 186ld@163.com。