RhoGDI2在結直腸癌中的表達及臨床意義①

柳思琪 馬俐君 顏宏利 王文睿 金珍婧

(吉林大學第二醫院，長春130021)

RhoGDI2在結直腸癌中的表達及臨床意義①

柳思琪 馬俐君②顏宏利③王文睿 金珍婧

(吉林大學第二醫院，長春130021)

目的：探討RhoGDI2在結直腸癌中表達及臨床意義。方法：通過免疫組化檢測 RhoGDI2 在結直腸癌組織、癌旁組織及轉移淋巴結中表達，分析其與CRC患者臨床因素及生存期之間的關系。結果：RhoGDI2在癌旁組織、腫瘤原發灶及轉移淋巴結中表達逐漸升高，差異有統計學意義(P<0.001)； RhoGDI2表達與淋巴結轉移、遠處轉移關系密切(P<0.05)；高表達RhoGDI2者總生存期及無病生存期短。結論：RhoGDI2在結直腸癌組織中高表達，且與結直腸癌淋巴結轉移、遠處轉移明顯相關，高表達RhoGDI2者總生存期及無病生存期短。

RhoGDI2;結直腸癌;轉移

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是世界范圍內人類最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈現上升趨勢，對人類的生命構成嚴重威脅。CRC的侵襲及轉移是其致死的主要原因，但明確的生物學機制尚不明確，CRC的5年生存率仍徘徊在50%左右[1,2]。

Rho鳥苷三磷酸酶(RhoGTPases)家族包括Rac1、RhoA和Cdc42，它調控著諸多的信號傳導途徑，尤其在細胞形態、遷移、黏附、細胞骨架重組、細胞周期及基因轉錄等方面發揮至關重要作用，更有研究證實部分腫瘤增殖及凋亡也受影響[3-5]。Rho鳥嘌呤核苷酸解離抑制因子(RhoGDP dissociation inhibitor，Rho GDI)作為RhoGTPases活性的關鍵調節因子，在腫瘤發生發展及轉移中發揮至關重要作用[6]，目前已有大量文獻報道RhoGDI2在肺癌、胃癌、膀胱癌、卵巢癌等腫瘤中的意義，但其在CRC中發揮作用及機制研究甚少[7-10]。

本研究通過免疫組化方法RhoGDI2在CRC腫瘤原發灶、癌旁組織及轉移淋巴結中的表達，進一步分析其與CRC患者臨床病理指標的關系及對總生存期和無病生存期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本及臨床資料 本研究從吉林大學第一醫院病理科嚴格選取2006年6月至2012年11月期間行結直腸癌根治術患者手術切除的原發灶組織石蠟標本共計87例，其中男性54例，女性33例，年齡28～88歲，中位年齡60歲，結直腸癌TNM分期按 AJCC2010第七版標準,其中Ⅰ期19例,Ⅱ期21例,Ⅲ期22例,Ⅳ期25例。所有患者自術后起均通過電話隨訪至死亡或存活滿5年。并選取18例患者對應的癌旁組織石蠟切片和轉移淋巴結組織石蠟切片，所有選擇標本均經過HE染色及組織學確認，并由兩位病理科醫生共同診斷確定結果，全部病患術前均未行放化療及靶向治療。所有患者相應臨床資料均經吉林大學第一醫院倫理委員會同意后從吉林大學第一醫院病案室或經隨訪獲得。

1.1.2 試劑 兔抗人RhoGDI2抗體購自美國Abcam公司，兔二抗購自上海威奧生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組織化學染色 脫蠟、水化：組織切片置于75℃烤箱內烘烤15 min；二甲苯切片浸泡15 min，共兩次；100%無水乙醇浸泡2 min-100%乙醇再浸泡2 min-90%乙醇浸泡2 min-80%乙醇浸泡2 min-70%乙醇浸泡2 min；1×PBS清洗5 min×3次；封閉酶阻斷劑：每張組織切片上滴加配置好的H2O2及甲醇混合液( H2O2：甲醇=1∶9)100 μl，室溫條件下避光靜置10 min；1×PBS清洗5 min×3次；抗原熱修復：枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)高壓修復10 min，自然冷卻至室溫：1×PBS清洗5 min×3次；封閉：10% BSA 37℃條件下封閉30 min；滴加抗體稀釋液稀釋的一抗50 μl，4℃孵育過夜；次日復溫后1×PBS清洗5 min×3次；滴加辣根過氧化物酶標記的二抗50～100 μl，37℃孵育75 min；1×PBS清洗5 min×3次；DAB顯色：滴加50 μl新鮮配制的DAB工作液，室溫孵育，顯微鏡下觀察以控制顯色時間，自來水沖洗10 min；蘇木素45 μl復染1 min；自來水洗1 min；鹽酸酒精分化1 s；自來水洗1 min；稀氨水返藍8 s；脫水、封片：80%乙醇30 s-90%乙醇30 s-100%乙醇1 min-100%乙醇2 min-二甲苯2 min二甲苯2 min，晾干后中性樹膠封片；普通光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學染色結果判讀 ①RhoGDI2表達主要位于細胞漿內，在顯微鏡下觀察到胞漿中出現棕黃色或者棕褐色顆粒為陽性；未觀察到棕黃色或棕褐色顆粒者則為陰性。②評分標準：請3位病理科醫生對切片進行鏡檢觀察，3人對切片所對應患者病理資料不知情，且各自獨立在普通光學顯微鏡閱片，在切片中隨機挑選5個視野，根據切片中陽性細胞百分率和陽性細胞染色強度判斷結果。其中陽性細胞染色強度評分標準:陰性為0分，淡棕色為1分，棕色為2分，深棕色為3分。陽性細胞百分率評分標準：0～5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，50%～75%為3分，75%～100%為4分。組織標本陽性等級評分=陽性細胞染色強度評分+陽性細胞百分率評分，0～2分為(-)，3分為(+)，4分為(++)，≥5分為(+++)。

1.3 統計學方法 分析采用χ2檢驗或 Fisher分析；原發灶、癌旁組織和轉移淋巴結蛋白表達差異比較釆用χ2檢驗；利用Kaplan-Meier繪制生存曲線；所有數據均采用Graphpad Prism 6.0或SPSS21.0軟件進行統計分析，以P<0.05定義為具有統計學差異，以P<0.01定義為具有顯著統計學差異。

2 結果

2.1 RhoGDI2在結直腸癌、癌旁組織及轉移淋巴結中表達水平 RhoGDI2在18例結直腸癌患者腫瘤原發灶、癌旁組織及轉移淋巴結中陽性表達分別為6例、0例及12例，通過統計學方法比較RhoGDI2在轉移淋巴結中陽性率明顯高于腫瘤原發灶及癌旁組織。見表1、圖1。

2.2 RhoGDI2表達與結直腸癌臨床病理指標的關系 我們將RhoGDI2在87例結直腸癌患者的原發灶中表達水平與相應患者臨床病理指標結合，通過χ2檢驗來統計它們之間的關系。見表2。

表1 RhoGDI2蛋白在結直腸癌、癌旁組織及轉移淋巴結中的表達情況

Tab.1 RhoGDI2 expression in colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues

GroupsnPositivePositiveratePCRCtissues186333%<0001Para?tumorous1800Lymphnodes1812667%

圖1 RhoGDI2蛋白在結直腸癌、癌旁組織及轉移淋巴結中表達(SP，×200)Fig.1 RhoGDI2 expression in colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues(SP，×200)

表2 RhoGDI2 表達與臨床病理指標關系

Tab.2 Relationship between RhoGDI2 expression and clinical factors

ClinicalfactorsnRhoGDI2expressionHighLowPn872364Age06828<60411031≥60461333Gender05227Male541341Female331023Size03562<5cm451035≥5cm421329Locationoftumor06427Colon611744Rectum26620Number03911Single852362Multiple202Differentiation05661High202Moderate471433Poor38929Stage00812I+Ⅱ40733Ⅲ+Ⅳ471631Lymphnodemetastasis003371)(+)441628(-)43736Remotemetastasis002841)(+)261115(-)611249Vascularinvasion04374(+)321022(-)551342Venousinvasion02003(+)321121(-)551243

Note：1)P<0.05.

2.3 RhoGDI2與結直腸癌總生存期及無病生存期關系 將RhoGDI2在87例結直腸癌患者中表達水平與結直腸癌總生存期及無病生存期關系通過Kaplan-Meier繪制生存曲線來統計，結果見圖2、3。

圖2 不同表達量的RhoGDI2與結直腸癌患者總生存期關系Fig.2 Relationship between different expression of RhoGDI2 with overall survival in patients with CRC

圖3 不同表達量的RhoGDI2與結直腸癌患者無病生存期關系Fig.3 Relationship between different expression of RhoGDI2 with disease-free survival in patients with CRC

3 討論

結直腸癌是最常見的惡性腫瘤之一，近年來其發病率呈明顯上升趨勢，逐漸成為一種嚴重危害人類健康的惡性疾病。隨著外科手術的進步、放化療及靶向治療的應用，結腸癌患者預后有所改善，但腫瘤復發、腫瘤轉移仍是患者死亡的主要原因，且逐漸成為提高患者生存期及改善預后的主要屏障。因此，深入研究結直腸癌發生、發展機制，積極尋求對抗方法，對進一步改善患者預后、延長生存期有重大意義。

Rho蛋白家族屬于Ras癌基因超家族，是一組相對分子質量約為20～30 kD的GTP結合蛋白，具有GTP酶活性，習慣上被稱為Rho GTP酶，包括RhoA、Rac1、Cdc42[11]。

RhoGDIs與其他兩個調節因子RhoGEFs和RhoGAPs不同(每一家族超過60成員)，只存在三種亞型： RhoGDI1或RhoGDIα、RhoGDI2或RhoGDIβ及RhoGDI3或RhoGDIγ，其中，RhoGDI1和RhoGDI3表達量較低，主要與高爾基體和囊泡功能相關，在腫瘤方面的作用知之甚少。RhoGDI2由201個氨基酸構成，分子量為27 kD，是RhoGDIs中表達最高的，最初認為其僅特異性地表達在淋巴造血組織，參與調節淋巴細胞的活化、存活及反應性。近年來的研究發現，RhoGDI2在許多惡性腫瘤組織中異常表達，與腫瘤的發生、發展及轉移等密切相關。

RhoGDI2 在人體多種腫瘤組織中存在異常表達。Theodorescu等[12，13]研究表明，RhoGDI2在原發性膀胱癌中表達水平低甚至不表達，其表達水平和膀胱癌患者生存率呈正相關，并通過單因素及多因素分析證實其是膀胱癌患者預后評估的獨立因子。RhoGDI2在乳腺癌發生發展中發揮雙向調節作用，有研究指出乳腺增生病變區域RhoGDI2比乳腺正常上皮細胞表達量高，浸潤型乳腺癌中RhoGDI2 的表達比乳腺原位癌中的低，另外RhoGDI2 的表達與淋巴結轉移呈負相關[14，15]。RhoGDI2表達和胰腺癌的關系研究顯示RhoGDI2在胰腺癌中表達升高，且受累神經節也可見RhoGDI2表達升高，siRNA RhoGDI2表達后可導致胰腺腫瘤細胞對神經侵襲能力改變[16]。Cho等[17]發現RhoGDI2在晚期胃癌組織中表達明顯高于早期胃癌組織和正常胃黏膜，與胃癌淋巴結轉移呈正相關。還有學者指出 RhoGDI2在高分化卵巢癌中的表達水平較高，其過表達與腫瘤病理類型有關，與腫瘤分期無關[8,18]。

本研究利用免疫組化檢測RhoGDI2在不同結直腸癌組織中表達情況，以及在原發灶、癌旁組織、轉移淋巴結等表達差異性，以研究RhoGDI2表達與結直腸癌發生及轉移有無相關性，同時結合患者臨床化驗指標進行分析，以明確該其與患者預后關系。結果顯示RhoGDI2蛋白在轉移淋巴結、腫瘤原發灶、癌旁組織中表達逐漸降低，其表達與結直腸癌淋巴結轉移、遠處轉移關系密切，與性別、年齡、腫瘤大小、位置、分期及分化程度等無關，高表達RhoGDI2的患者總生存期及無病生存期短，RhoGDI2的高表達與結直腸癌的發生、發展關系密切。

4 結論

RhoGDI2在結直腸癌組織中表達明顯升高，其在轉移淋巴結、原發灶、癌旁組織中表達量依次降低，RhoGDI2的表達與結直腸癌淋巴結轉移、遠處轉移關系密切，與性別、年齡、腫瘤大小、數目、分期、分化程度、血管浸潤及神經侵襲等無關，高表達RhoGDI2的患者總生存期及無病生存期短。

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[收稿2016-09-27]

(編輯 張曉舟)

RhoGDI2 expression and clinical significance in colorectal cancer

LIUSi-Qi,MALi-Jun,YANHong-Li,WANGWen-Rui,JINZhen-Jing.

TheSecondHospitalofJilinUniversity,Changchun130021,China

Objective:To explore the expression and clinical significance of RhoGDI2 in colorectal cancer.Methods: Immunohistochemistry was used to identify RhoGDI2 expression in clinical samples of colorectal cancer tissues,para-tumorous tissues and lymph node metastasis tissues.The relationships between CRC clinical factors and survival were analyzed.Results: RhoGDI2 expression contributed positively with tumor progression and metastasis in clinical tissues.It was associated with the stage of the tumor,lymph node metastasis,remote metastasis,venous invasion and vessel invasion.Patients with higher RhoGDI2 expression had poorer overall survival.Conclusion: RhoGDI2 showed high expression in colorectal cancer and it was associated with the stage of the tumor,lymph node metastasis,remote metastasis,venous invasion and vessel invasion.Patients with higher RhoGDI2 expression had poorer overall survival.

RhoGDI2;Colorectal cancer;Metastasis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.022

①本文受吉林省發展和改革委員會資助(2013C026-1)。

柳思琪(1988年-)，女，碩士，醫師，主要從事慢性肝病、重癥肝病的臨床及基礎研究。

及指導教師：金珍婧(1965年-)，女，博士，主任醫師，主要從事消化道腫瘤、肝硬化的臨床及基礎研究，E-mail:jinyu0429@sina.com。

R735.3+5

A

1000-484X(2017)01-0108-04

②上海交通大學醫學院附屬同仁醫院，上海200336。

③第二軍醫大學附屬長海醫院，上海200433。