免疫細胞靶向治療結腸癌腫瘤干細胞①

黃 雪 鄭媛媛 李富榮

(暨南大學第二臨床醫學院(深圳市人民醫院)轉化醫學協同創新中心，深圳518000)

免疫細胞靶向治療結腸癌腫瘤干細胞①

黃 雪 鄭媛媛 李富榮

(暨南大學第二臨床醫學院(深圳市人民醫院)轉化醫學協同創新中心，深圳518000)

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)發病率列我國第三位。隨著我國人民生活水平的不斷提高和飲食習慣的改變,發病率也呈現出逐年上升的趨勢，結直腸癌5年生存率只有50%[1,2]。研究發現結直腸癌腫瘤干細胞在結直腸癌的發生、復發和轉移中發揮著重要作用。結直腸癌腫瘤干細胞(Colorectal cancer stem cells，CCSCs)是結直腸癌腫瘤組織中數量很少的一部分細胞，但是這類細胞具有很強的致瘤性和化療抵抗性，是結直腸癌復發和轉移的源頭。研究發現這類細胞能進行自我更新和分化成新的腫瘤，在放化療后能進入休眠狀態，當微環境發生改變時，開始增殖并轉移到其他地方形成轉移灶[3]。免疫細胞治療作為新的治療技術，通過免疫細胞靶向治療結直腸癌腫瘤干細胞可能是從根本上根治結直腸癌的手段。本文就近年來結直腸癌腫瘤干細胞分離、純化、表面標記，以及各種針對腫瘤干細胞免疫細胞治療的研究進展作一綜述。

1 結直腸癌腫瘤干細胞生物學特性

結直腸癌的干細胞具有自我更新能力，具有類似的分化能力和類似的信號通路，多處于靜息期，具有自分泌能力以及耐藥性等[4]。腫瘤干細胞具有與正常干細胞相似的自我更新的特征，不同的是正常干細胞的自我更新是在基因調控下進行的有序的增殖與分化，而腫瘤干細胞的增殖是無限和無序的，且不能分化為成熟細胞[5]。腫瘤干細胞分化出的細胞具有異質性，不同類型的亞克隆伴隨著不同屬性的產生，只有部分克隆細胞可以轉移形成轉移性腫瘤。這些轉移的克隆細胞可以進一步地累積突變基因，形成與原始病灶不同的轉移性腫瘤[4，6]。根據種子土壤學說，腫瘤起始細胞作為種子，能生產自己的土壤，增加了起始細胞在腫瘤微環境中懸浮單細胞的生存能力[7]。由于腫瘤干細胞的強大的致瘤能力，猜想這可能和上皮細胞向間質細胞的轉變(EMT)密切相關。Radisky等[8]人發現CCSCs可以通過侵犯血管，經過上皮間葉組織轉分化作用到達遠處的組織，形成新的腫瘤，由于結腸癌腫瘤干細胞的這些特性，可以選擇以結腸癌腫瘤干細胞作為治療靶標，除了傳統的方法來治療結直腸癌以外，通過免疫細胞清除腫瘤干細胞具有預防結直腸癌的復發和轉移作用。

2 結直腸癌腫瘤干細胞表面標記物

免疫染色技術發現結直腸癌腫瘤干細胞的表面抗原標記物，主要有CD44、CD24、CD166、CD133、CD29和ALDH1。可以通過流式細胞儀等方法成功分離出結直腸癌腫瘤干細胞，發現結直腸癌中每100 個細胞中至少就會有一個 CD44+CSC具有致瘤性[2,3]，取結直腸癌組織中一個 CD44 陽性細胞，在體外可以培養成類似原發癌的腫瘤組織。曾有研究者用流式細胞儀觀察到組織外周血中 CD3+細胞 CD24 熒光強度，發現其表達量與結直腸癌有關。在結直腸癌動物模型體內注入隱匿 HT29 或 Colo357 細胞的 siRNA，7～10 d內可形成肉眼可見的腫瘤;在標準的化療方案中加入抗 CD24 抗體，則發現腫瘤生長得到抑制[7]。有人證實腫瘤細胞表面 CD166 表達與病理分級及侵襲深度有關，與結直腸癌患者的性別、年齡、直徑、淋巴結轉移及 Dukes 分期無關[8]。把培養的原發和肝轉移結直腸細胞“癌球”植入 NOD/SCID 小鼠可見其導致腫瘤發生，約每 16 個 CD133+細胞中有一個可以成癌球，顯示CD133+可能是CCSCs表面標志物[9]。研究者把500 個 ALDH1+ESA+細胞置入 NOD/SCID小鼠，30 d 內就能形成腫瘤，而10 000 個 ALDH1-ESA+細胞在 50 d 內仍無法致瘤[10]，研究統計 ALDH1 表達與結腸癌患者年齡、性別、分化程度、侵襲深度、淋巴結轉移以及 Duke′s 分期無關，但與預后有關，表達越低預后越好。另外,EpCAM、CD44、CD166和 DAB2IP 表面標記物也是結直腸癌腫瘤干細胞表面標志特征，如 DAB2IP與腫瘤的分化程度、轉移呈負相關，DAB2IP會抑制NF-κB介導的上皮間質間的轉分化作用，在結腸癌中DAB2IP低表達的患者往往預后較差且生存時間更短。目標研究發現的結直腸癌腫瘤干細胞表面標志物，見表1。

3 免疫細胞靶向治療結直腸癌腫瘤干細胞

由于腫瘤干細胞大多處于休眠狀態,具有較強的耐藥性及放療不敏感性，傳統的腫瘤化療藥物和放療不能對其有效殺滅，最終導致腫瘤轉移和復發。細胞免疫干預作為一種有效的治療手段，它可以靶向腫瘤特異性抗原(TSAs)和/或腫瘤相關抗原(TAAs)，可特異性清除腫瘤細胞或腫瘤干細胞。CSCs由于具有對常規治療抵抗性，這些腫瘤起始細胞除表達干細胞抗原外，可能還包含許多編碼腫瘤特異性抗原的突變。因此，制備抗結直腸癌腫瘤干細胞的疫苗，以及針對結直腸癌腫瘤干細胞表面抗原的特異性靶向免疫細胞，可清除手術后或化療后殘存結腸癌腫瘤干細胞，將解決腫瘤干細胞藥物抵抗和復發問題，以大大提高結直腸癌治愈率[20,21]。

3.1 DC疫苗 目前為止，DCs被認為是功能最強大的抗原提呈細胞，能激活T細胞，產生強大的免疫應答[22]， Zarnani等[23]在結腸癌小鼠模型中，給在結腸癌腫瘤細胞上面負載了一個腫瘤細胞特異性的抗原肽gp70-derived peptide(AH1)和一個輔助蛋白分子卵清蛋白(OVA)，得到DC-Pep-OVA 這樣的DC疫苗，再注射到結腸癌小鼠體內，表現出更長的存活時間。2010年FDA批準上市的Provenge(sipuleucel-T)，用于治療轉移性激素抵抗性前列腺癌(CRPC)，Provenge誘導作用是通過抗原提呈細胞(APCs)負載前列腺癌酸性磷酸酶(PAP)抗原，與GM-CSF的因子進行了融合，而GM-CSF的作用就是促進樹突狀細胞的擴增與分化成熟，可使腫瘤抗原在樹突狀細胞表面有效地表達，繼而激活腫瘤特異的CD8+T細胞，誘導抗前列腺癌免疫應答，目前sipuleucel-T已經通過了臨床實驗[24]。研究比較熱的還有全細胞抗原負載的 DCs 疫苗，將腫瘤細胞的裂解物來致敏DCs，Alteber等[25]通過冷凍消融術后再來負載DCs，并觀察冷凍消融術負載DCs和對照組的生存時間，觀察到72 d時，負載疫苗的小鼠能夠存活而且通過體內的光化學檢測沒有發現新的轉移。也有通過基因修飾的方法來致敏DCs的，將腫瘤細胞的特異性抗原直接加載到DCs上，使DCs更能有效地與MHC分子進行結合，產生更加強大且持久的免疫應答，Benteyn等[26]人將m-RNA修飾在DCs上，獲得比對照組更有效的免疫應答，抗結直腸癌干細胞的DC疫苗激活自體T細胞后會引起結直腸CSC抗原特異性的T細胞應答。有學者利用自體DC負載后的腫瘤裂解物對結直腸癌患者進行皮下注射，發現其活化T細胞對腫瘤細胞有強大的殺傷作用，而且并未發生明顯不良反應，說明了DC用作疫苗的高效安全性[22]，2015年杜克大學開發了一種新的方法，用破傷風毒素來刺激免疫系統增強了DCs疫苗對惡性腦膠質瘤的效力，研究表明巨細胞病毒(CMV)存在于膠質瘤細胞中，但目前還不清楚這種病毒是否導致腫瘤的持續發展，這種DC疫苗主要針對巨細胞病毒的，在接受破傷風加強劑治療的患者生存值超過了36.6個月，而僅接受樹突狀細胞注射治療的患者平均生存時間僅為18.5個月[27]。這個結果是非常令人振奮的。

表1 結直腸癌腫瘤干細胞表面標記物

Tab.1 Specific molecular biomarkers of CCSC

標記物別名功能參考文獻ALDH1ALDH1A1，RALDH1在細胞內催化乙醛氧化成乙酸[11]CD133Prominin?1，AC133連接兩個膽固醇酯，包含了兩個血漿質膜微小結構域的跨膜糖蛋白[12]CD44PGP?1，HUTCH?1，GP90，EPICAN，CDW44，MIC4一種細胞黏附分子，參與淋巴細胞的激活和淋巴循環[13]EpCAM，TACSTD1，CD326，17?A，ESA，EGP40上皮細胞黏附分子[14]CD24HSA黏蛋白樣的細胞黏附分子[15]CD29B1Integrin受體細胞外基質蛋白，參與調控細胞遷移、增殖、生存、分化和死亡[16]Lgr5GPR49R?spondin受體蛋白，成體干細胞的表面標記物[17]CD166ALCAM白細胞活化黏附因子[18]BMI?1干細胞自我更新的調節器，核心蛋白復合體(PRC1)的組成部分[19]

3.2 CTL細胞 細胞毒性T淋巴細胞(CTL)能識別腫瘤相關抗原(Tumor-associated antigen，TAA)，抗原肽由HLA-Ⅰ類分子提呈，提呈給CD8+T 細胞，CD8+T 細胞具有很強大的抗腫瘤細胞效應，而激活CTLs的重要的分子就是HLA-Ⅰ，有報道稱惡性腫瘤就是由于失去了表達HLA-Ⅰ類分子使得不能有效地將腫瘤的表面抗原提呈給CTLs，無法引起有效的免疫應答，使機體無法及時的清除腫瘤細胞[28]，Sokol等[29]實驗發現在結直腸癌中由于MHCⅠ分子表面TPA結合蛋白(Tapasin)的缺失，以致CD8+CTL不能有效地對腫瘤細胞進行攻擊，并且與結腸癌的轉移和惡性發展有極大關系。Morita等[30]科學家通過使用siRNA來對嗅覺受體7C1(OR7C1)過表達和基因敲除，發現OR7C1可以作為新的篩選結腸癌腫瘤干細胞的標志，而CTL能特異性的識別結腸癌腫瘤干細胞。Visus 等[31]，已經證明ALDH高表達的細胞能誘導CD8+T 細胞免疫應答，通過流式細胞儀分選出ALDH高表達的細胞來致敏CD8+T 細胞，將致敏后的CD8+T 細胞和從健康人中分離出的HLA-A2-restricted樹突狀細胞一起共培養，過繼給腫瘤小鼠進行細胞免疫治療，結果小鼠體內的腫瘤生長受到了抑制，而且表現出更長的存活時間，這個實驗說明ALDH高表達的細胞可能是CTL潛在的作用靶點。Kryczek教授[32]及其團隊發現IL-22+CD4+的T細胞能通過激活轉錄因子STAT3和誘導甲基轉移酶DOT1L促進結腸癌細胞的干性，當用結腸腺癌細胞系DLD-1給NSG小鼠種植腫瘤時發現，105個DLD-1細胞不能在NSG小鼠體內形成腫瘤，而用外源性的IL-22作用，小鼠腫瘤的體積明顯增大。在結腸癌中，CD8+T細胞是抗腫瘤免疫的重要細胞，Th1型趨化因子CXCL9 和CXCL10能對免疫細胞Th1和CD8+T細胞起調節作用。Nagarsheth等[33]通過用IFN-γ來刺激結腸癌的單細胞懸液，發現CXCL9和 CXCL10的水平有所升高，觀察到CD8+T細胞浸潤結腸癌腫瘤的程度也更深。Wei[34]報道結直腸癌腫瘤干細胞能表達共刺激抑制信號 CD274 (B7-H1)和可溶性LGALS3 (galectin-3)，能削弱CTLs和γδT細胞的作用，抑制腫瘤的免疫應答。Morita等[30]報道OR7C1 作為一個新的結直腸癌腫瘤干細胞表面抗原篩選標志，以OR7C1 來源的抗原肽致敏的CTLs，對結腸癌腫瘤干細胞有很強的殺傷毒性。OR7C1致敏的CTL抗腫瘤效應比CTL細胞毒性T淋巴細胞克隆有更強的抗腫瘤性，有研究者觀察到結腸癌腫瘤干細胞能表達一種膜融合蛋白和分泌可溶性的IL-4，而這些信號會抑制T細胞對腫瘤干細胞的免疫反應，且IL-4的水平在體內實驗發現與腫瘤的轉移、復發有很密切的聯系[35]。結直腸癌腫瘤干細胞致敏的CTL細胞免疫治療有可能成為治療結直腸癌的一個希望。

3.3 NK細胞 自然殺傷細胞(NK)是機體重要的免疫細胞，能識別病毒感染細胞和腫瘤細胞，主要是由于NK細胞能調節腫瘤細胞上面的MHCⅠ和MHCⅡ類分子，NK細胞能識別非特異性的抗原，不需要特異性的HLA表達。NK細胞在腫瘤免疫中發揮著重要的作用。CD133已經證明存在于腫瘤干細胞表面，也包括結腸癌腫瘤干細胞。有學者已經證明NK細胞能高度識別腫瘤干細胞，表明NK細胞能有效靶向殺傷腫瘤干細胞和非干性的腫瘤細胞的可能。最近研究發現NK細胞對于CD133陽性的細胞具有很強的殺傷作用[36]。Kim[37]通過比較原位結腸癌和轉移性結腸癌的腫瘤干細胞發現，在轉移性結腸癌細胞系(KM12L4A 和KM12SM)中腫瘤干細胞表面NKG2D 配體和DR4/5水平是明顯高于原位結腸癌的，NK92細胞對KM12L4A 和KM12SM的殺傷作用也更加敏感。結腸癌腫瘤干細胞表面低表達CD1d，有實驗發現加入胸腺肽α1能上調CD1d的表達，CD1d能有效刺激NK細胞的免疫應答，抑制Erk/MAPK途徑，致敏NK細胞，實驗中24 h內，血液中NK細胞的數量已經達到一個高水平，體內、體外實驗都得到驗證[38]。Tallerico等[39]發現在結腸癌干細胞表面的MHCⅠ類分子相對于結腸癌細胞是低表達的，而 MHCⅠ類分子，會減弱NK細胞的免疫應答作用，研究人員用純化同種異體的NK細胞來識別和殺傷結直腸癌腫瘤肝細胞，這是由于結直腸癌腫瘤干細胞白表面可高表達NKp30和NKp44配體。Ueda等[40]科學家在小鼠結腸癌中對小鼠進行自體干細胞移植，再對脾臟中的NK細胞進行檢測，發現在1到3周后NK細胞在結腸癌小鼠自體干細胞移植組比未進行自體干細胞移植組的細胞數量增加，并且是高度激活的。而且在2周時，NK細胞的數量和活性達到一個頂峰狀態，但這是在小鼠實驗階段的結果，進入臨床還有待研究。

3.4 TCR-T及CAR-T TCR-T是通過轉基因技術修飾的T細胞，基因轉染TCRs與靶細胞特異性的MHC分子結合，既能識別細胞表面抗原，又能識別細胞內抗原[41]。早在2006年Morgan等[42]就報道采用基因修飾的方法來治療轉移性的黑色素瘤，將特異性的TCR-T細胞與黑色素瘤的MART-1基因特異性的結合，實驗的17個患者中有2名患者腫瘤縮小且生存時間延長。后來用高活性的TCR修飾后的T細胞能識別滑膜肉瘤的NY-ESO-1抗原，6個試驗患者中，4個患者引起了強烈的免疫應答。Rapoport等[43]于2015年對20例多發性骨髓瘤的患者進行臨床試驗，用TCR-T治療后其中14名患者接近完全緩解(near complete response，nCR)，2名患者獲得較大緩解(Very good partial response，VGPR)，一名患者表現為病情穩定，另一名表現出有進展，但是所有患者均超過100 d表現出接近完全緩解或較大緩解，平均存活時間達到了19.1個月。而CAR載體通常來源于抗原蛋白的一部分，表達在T細胞表面時，能與靶細胞結合，激活CAR-T細胞。最近CAR-T已經發展到第三代，包含了雙刺激分子，如CD28+CD134 (OX40) 和CD28+CD137 (4-1BB)[44]。雖現在對于結直腸癌腫瘤干細胞的免疫治療上，CAR-T及TCR的文獻報道還比較少，但是運用CAR-T及TCR與結直腸癌腫瘤干細胞特異性抗原結合，也為結直腸癌腫瘤干細胞的免疫治療提供了一個新的思路。

3.5 其他 最近有研究者用白喉桿菌與胃泌素-17進行共軛，而胃泌素-17作為生長因子本身能促進胃腸道腫瘤的生長，在這項臨床研究中，有三分之一的患者獲得了部分免疫應答，32%的患者病情更加穩定，其余的患者產生了抗胃泌素-17的抗體，生存時間明顯延長[45]。有研究團隊將人5型腺病毒作為疫苗，發現能在67%的轉移性的結腸癌患者中引起較強的免疫反應，但是這項研究并沒有明顯提高患者的生存期[46]。

4 展望

研究已經證明腫瘤干細胞比一般的腫瘤細胞的免疫原性更低，而且腫瘤干細胞會下調自身的某些抗原的表達來逃脫免疫細胞的免疫效應作用。因此，識別和增加腫瘤干細胞表面的特異性抗原來增加免疫應答作用是非常有必要的。隨著對結腸癌腫瘤干細胞的認識更加深入，以及對結腸癌腫瘤干細胞表面抗原標記物的發現，以及新的免疫細胞制備的技術手段發現和改進，將為人類預防或治愈結腸癌提供了可能。

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[收稿2016-06-02 修回2016-08-02]

(編輯 倪 鵬)

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.034

黃 雪(1992年-)，女，碩士，主要從事腫瘤免疫治療方面研究，E-mail：654954659@qq.com。

及指導教師：李富榮(1963年-)，男，博士，研究員，博士生導師，主要從事細胞治療方面的研究，E-mail:frli62@163.com。

R392

A

1000-484X(2017)01-0156-05

①本文為深圳市科技計劃項目(No.201402014)。