c-Myc調控PIK3R3抑制黑色素瘤B16-F10細胞的遷移和侵襲①

楊鎵寧 鄧 菲 潘 寧

(四川省醫學科學院,四川省人民醫院皮膚外科,成都610072)

c-Myc調控PIK3R3抑制黑色素瘤B16-F10細胞的遷移和侵襲①

楊鎵寧 鄧 菲②潘 寧

(四川省醫學科學院,四川省人民醫院皮膚外科,成都610072)

目的：探討c-Myc調控PIK3R3對黑色素瘤B16-F10細胞的遷移和侵襲的影響。方法：運用免疫組化檢測PIK3R3在正常皮膚組織和黑色素瘤組織的表達；檢測慢病毒(LV3-c-Myc和LV3-PIK3R3)對c-Myc和PIK3R3基因的沉默效率；使用EdU增殖實驗檢測沉默c-Myc和PIK3R3后黑色素瘤細胞株B16-F10的增殖情況；Transwell侵襲實驗檢測c-Myc和PIK3R3的表達對黑色素瘤細胞B16-F10的侵襲能力的影響；劃痕實驗檢測c-Myc和PIK3R3的表達對黑色素瘤細胞B16-F10遷移能力的影響；qPCR檢測沉默c-Myc和PIK3R3后miR-199a的表達；qPCR檢測轉染miR-199a mimics和miR-199a inhibitor后c-Myc和PIK3R3的表達；雙熒光素酶報告基因系統檢測miR-199a對c-Myc和PIK3R3轉錄活性的影響。結果：和正常皮膚組織比較，PIK3R3在黑色素瘤組織中表達明顯增加；沉默c-Myc和PIK3R3基因后，黑色素瘤細胞株B16-F10的增殖、侵襲和轉移能力明顯降低；沉默c-Myc和PIK3R3基因后，miR-199a表達上調；轉染miR-199a mimics后，c-Myc和PIK3R3表達降低；轉染miR-199a inhibitor后，c-Myc和PIK3R3表達上調；雙熒光素酶報告基因系統檢測結果顯示，miR-199a可以直接調控c-Myc和PIK3R3的轉錄活性。結論：c-Myc可以通過miR-199a調控PIK3R3的表達，從而促進黑色素瘤細胞的增殖、侵襲和遷移能力。

miR-199a；c-Myc；黑色素瘤；Western blot;Transwell;劃痕實驗;PIK3R3

黑色素瘤是高轉移高侵襲性的一種惡性腫瘤，也稱為惡性黑色素瘤(Malignant melanoma，MM)，它是世界范圍內男性中是第五大惡性腫瘤，女性中是第六大惡性腫瘤，通常發病在皮膚表面，約占皮膚腫瘤十分之一，一旦確診后患者的死亡率高達80%以上，較難治愈，在發病人群中存在一定的家族聚集現象[1]。黑色素瘤容易出現早起轉移，侵襲至其他組織器官，且在早期發病期間癥狀不明顯，不易發現，早期診斷率較低，一旦確診多屬于晚期情況，診斷治療的效果較差，這是導致黑色素瘤死亡率居高不下的主要原因[2]。因此，探討黑色素瘤侵襲和轉移機制可以在一定程度上提高黑色素瘤的早期診斷和治療，有效減少腫瘤的發生和進展，進而降低黑色素瘤死亡率。

MicroRNA(miRNA) 是一類新的小分子非編碼RNA，可以與基因的3′-UTR端的連接，從而影響靶基因mRNA的性能，對細胞的增殖、分化、侵襲、轉移以及凋亡進行調控[3]。miRNA領域在黑色素瘤中涉及較少，只有少量報告對黑色素瘤的單一表達譜進行研究，比如在黑色素瘤中發現miR-221可結合的3-UTR′端，調控酪氨酸激酶信號通路中關鍵受體Ckit的轉錄和翻譯，提示其參與黑色素瘤的發生發展過程[4]。miR-199a和miR-33的表達與黑色素瘤的高轉移特性顯著正相關，可能成為黑色素瘤轉移中的關鍵miRNA[5]。

Myc基因是較早發現的癌基因，Myc基因家族包括c-Myc、N-Myc、L-Myc等，其中c-Myc定位于8號染色體上。c-Myc由不編碼蛋白質的第1 外顯子和編碼蛋白質的第2、3外顯子構成。c-Myc 基因編碼c-Myc致癌蛋白，可以調控細胞增殖功能。c-Myc 是一個多功能的基因，可以調控細胞周期，細胞的生長代謝、細胞惡性轉變等生物學功能[6,7]。正常細胞中的 c-Myc 原癌基因一旦被異常激活為癌基因，c-Myc mRNA 和 c-Myc蛋白的相關表達會異常增高，使細胞的生長增殖不受正常的調節限制，開始向惡性細胞特性轉變，同時c-Myc的高水平表達還可以抑制細胞的正常分化，影響細胞的正常凋亡，進而誘導腫瘤的發生。Wang等[8]研究表明，c-Myc基因表達與脈絡膜黑色素瘤的發生、發展密切相關。但是在皮膚黑色素瘤中c-Myc的表達水平和調控機制尚未有文獻報道。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3R3)是信號通路中重要的信號因子，參與細胞增殖、生長、分化、細胞遷移和凋亡等多個生理過程，在多種腫瘤中存在廣泛激活的現象[9]。PIK3CA基因在非小細胞肺癌、前列腺癌和腸癌等腫瘤中表達增高。經過活化后的PIK3R3可調控Akt、mTOR等家族成員等[10]。PIK3R3的異常表達會影響癌細胞的遷移侵襲等生物學功能[11]。因此，我們推測可能通過miR199a負性調控的c-Myc表達通過PI3K/AKT信號通路抑制黑色素瘤的侵襲轉移等惡性生物學功能，并研究c-Myc在黑色素細胞中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 人皮膚黑色素瘤細胞株B16-F10購買自武漢大學中國典型培養物保藏中心。細胞培養條件：含10%胎牛血清的RPMI1640，37℃，5%CO2條件下培養。胎牛血清，RPMI1640培養基均購自Gibco公司。PIK3R3兔單克隆抗體均購自Abcam(ab186612)。Transwell小室購自美國Millipore公司，Matrigel購自美國BD公司。miR-199a mimics，miR-199a inhibitors，PIK3R3和c-Myc沉默及對照慢病毒購自上海吉凱制藥技術有限公司。miR-199a、PIK3R3和c-Myc qPCR引物以及RNA提取試劑盒、逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒均購自廣州復能基因有限公司。

1.2 方法

1.2.2 qPCR 熒光定量PCR檢測miR-214、PIK3R3和c-Myc的表達 用Trozel (Gibco) 抽提組織總RNA，逆轉錄，PCR擴增miR-199a、PIK3R3和c-Myc，PIK3R3和c-Myc用GAPDH作為內參物，miR-199a使用U6作為內參。反應條件：以100 ng總RNA為模版，逆轉錄cDNA，反應條件為：37℃ 15 min，95℃ 5 min。后根據PCR試劑盒說明書進行PCR反應。獲得數據以RQ=2-ΔΔCT計算mRNA表達量。實驗重復3次。

1.2.3 PIK3R3蛋白檢測 配制10%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白樣品。使用濕轉法電轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2 h，1∶1 000 TBST稀釋一抗(山羊抗人PIK3R3多克隆抗體)，4℃過夜；加入辣根過氧化酶物標記兔抗羊IgG(1∶5 000)稀釋，室溫孵育2 h；ECL發光。實驗重復3次。

1.2.4 Transwell侵襲實驗檢測黑色素瘤細胞遷移能力 所有試劑及器材均于冰上預冷，將Transwell小室置于24孔板內，將Transwell小室內膜均勻涂抹Matrigel膠 50 μl (0.2 μg/μl)，37孵育15 min，使膠凝固；消化、離心、計數細胞后，按照2.5×104ml-1用無血清培養基稀釋細胞，制成細胞懸液；按照每孔200 μl，將細胞懸液加入Transwell上室，同時在Transwell下室加入10%FBS+培養基600 μl，放入37℃孵箱培養；甲醛固定，結晶紫染色10 min，然后用棉簽輕輕擦拭內膜上的細胞。顯微鏡下技術，計數4個高倍視野(×40)下穿過濾膜的細胞數。實驗重復3次。

1.2.5 劃痕實驗檢測黑色素瘤細胞遷移能力 劃痕實驗：將B16-F10細胞接種于6孔板，待細胞融合度生長在90%時，用200 μl消毒槍頭從上而下劃線，并在顯微鏡下觀察，測量劃痕的初始距離(0 h)；在24 h后，測量劃痕的距離，并拍照，計算細胞的遷移率。實驗重復3次。

2 結果

2.1 PIK3R3在黑色素瘤組織中表達增加 黑色素瘤及癌旁組織免疫組化結果顯示，PIK3R3定位在細胞核中，胞漿和胞質中較少。PIK3R3在黑色素瘤癌組織中呈強陽性表達，在癌旁組織中呈弱陽性表達(圖1)。黑色素瘤組織中PIK3R3的表達明顯高于癌旁組織，差異具有統計學意義(P<0.05，圖1)。

2.2 c-Myc在不同黑色素瘤細胞株中的表達 Western blot實驗結果顯示： 相比WM451、 A375、SK-MEL-1、B16-BL6細胞株，c-Myc蛋白在B16-F10細胞株中表達最高，所以后續實驗我們選取B10-F10作為實驗細胞株，見圖2。

圖1 免疫組化檢測PIK3R3在黑色素瘤組織和癌旁組織的表達情況(×40)Fig.1 Expression of PIK3R3 in Melanoma was detected using immunohistochemical staining(×40)Note: *.P<0.05.

2.3 c-Myc通過miR-199a調控 PIK3R3的表達 我們通過生物信息學進行預測(Targetscan)、c-Myc和 PIK3R3互為內源競爭性RNA。c-Myc和PIK3R3可能通過miR-199a進行相互調控。本研究發現，與對照組(LV3-NC)比較，黑色素瘤細胞株B16-F10感染慢病毒LV3-c-Myc后，PIK3R3的蛋白水平和 mRNA水平明顯降低(圖3A，P<0.05)。

圖2 c-Myc在不同黑色素瘤細胞株中的表達Fig.2 Expression of c-Myc in different melanoma cell linesNote: *.P<0.05.

圖3 c-Myc通過miR-199a調控 PIK3R3的表達Fig.3 c-Myc regulated PIK3R3 through miR-199aNote: *.P<0.05.A.The level of PIK3R3 mRNA decreased after silencing c-Myc;B.PIK3R3 protein level decreased after silencing c-Myc;C.c-Myc mRNA level decreased after silencing PIK3R3;D.mRNA level of miR-199a after increased silencing PIK3R3 and c-Myc.Error bars represent standard error.

同時我們發現，和對照組(LV3-NC)比較，黑色素瘤細胞株B16-F10感染慢病毒LV3-PIK3R3后，c-Myc的mRNA水平明顯下調(圖3B，P<0.05)。我們的結果提示，c-Myc和 PIK3R3可以相互調控。我們進一步研究發現，分別沉默c-Myc和PIK3R3后，miR-199a表達升高(圖3C，P<0.05)，這提示miR-199a是c-Myc和PIK3R3相互調控的一個關鍵因子。

2.4 c-Myc和PIK3R3是miR-199a的直接靶點 為了進一步證實c-Myc和 PIK3R3互為內源競爭性RNA，運用B16-F10細胞，我們轉染miR-199a mimics和miR-199a inhibitors。結果顯示(圖3)，和對照組比較，轉染miR-199a mimics后，c-Myc和 PIK3R3表達降低；轉染miR-199a inhibitors后，c-Myc和 PIK3R3表達上調。同時雙熒光素酶報告系統檢測發現，c-Myc和PIK3R3是miR-199a的直接靶點。結果提示，c-Myc和PIK3R3是miR-199a的直接靶點，c-Myc和PIK3R3可能通過miR-199a相互調控。見圖4。

2.5 沉默c-Myc和PIK3R3后，黑色素瘤細胞B16-F10侵襲能力降低 細胞侵襲穿過Matrigel基質膠的能力可以反映細胞的侵襲能力。Transwell實驗結果表明：感染LV3-c-Myc或者LV3-PIK3R3后，黑色素瘤細胞B16-F10通過Matrigel基質膠的細胞數量分別為(45.54±6.76)和 (50.65±4.63)明顯少于感染LV3-NC的B16-F10細胞 (310.90±21.86)，差異有統計學意義(P<0.05)。我們的結果說明，沉默c-Myc和PIK3R3可以抑制黑色素瘤細胞B16-F10的侵襲能力，見圖5。

圖4 c-Myc和PIK3R3是miR-199a的直接靶點Fig.4 c-Myc and PIK3R3 are direct target of miR-199aNote: *.P<0.05.A.c-Myc and PIK3R3 were down-regulated after transfection with miR-199a mimics;B.c-Myc and PIK3R3 were up-regulated after miR-199a inhibitors transfection;C,D.c-Myc and PIK3R3 are direct targets of miR-199a.Error bars represent standard error.

2.6 沉默c-Myc和PIK3R3后，黑色素瘤細胞B16-F10遷移能力降低 在顯微鏡下測量24 h后，各組細胞任意三個部位的劃痕的寬度，遷移率=[D(t=24 h)-D(t=0 h)]/D(t=0 h)。劃痕實驗結果表明：與LV3-NC轉染細胞組比較，在24 h時，LV3-c-Myc或LV3-PIK3R3感染細胞組遷移率明顯降低 [ (0.79±

圖5 Transwell侵襲實驗檢測沉默c-Myc和PIK3R3對黑色素瘤細胞B16-F10侵襲能力的影響Fig.5 Effect on invasion ability of B16-F10 after silencing c-Myc and PIK3R3 cells were detected by Transwell matrigel invasion assaysNote: *.P< 0.05.Error bars represent standard error.

圖6 劃痕實驗檢測沉默c-Myc和PIK3R3對黑色素瘤細胞B16-F10轉移能力的影響Fig.6 Effect on migration ability of B16-F10 cells after silencing c-Myc or PIK3R3 were detected by wound healing assaysNote: *.P< 0.05.Error bars represent standard error.

圖7 沉默c-Myc的表達可以抑制黑色素瘤細胞的體內成瘤能力Fig.7 Ability in vivo tumorigenicity of B16-F10 cells after silencing c-Myc were detected in nude miceNote: Error bars represent standard error.*.P< 0.05.

0.04)% vs (0.42±0.02)%,P<0.05;(0.79±0.04)% vs (0.32±0.04)%,P<0.05]，差異有統計學意義。表明沉默c-Myc和PIK3R3后，黑色素瘤細胞B16-F10遷移能力降低，見圖6。

2.7 沉默c-Myc后，黑色素瘤細胞成瘤能力減弱 裸鼠體內成瘤可以檢測腫瘤細胞在體內的生物活性和增值侵襲能力。裸鼠體內成瘤實驗表明，沉默c-Myc的黑色素瘤細胞在裸鼠體內成瘤情況明顯與對照組相比要慢，4周后腫瘤體積與對照組相比要小[(1.68±0.08)cm3vs (0.37±0.12)cm3,P<0.05]，4周后腫瘤質量與對照組相比要輕[(1.45±0.11) g vs (0.32±0.06) g,P<0.05]。差異有統計學意義。說明沉默c-Myc后黑色素瘤B16-F10細胞的裸鼠體內成瘤能力受到的抑制，見圖7。

3 討論

皮膚黑色素瘤起源于神經棘來源的黑色素細胞的惡性腫瘤，其惡性程度極高。黑色素細胞在各種體內外致癌因素的影響下，早期就可以出現遠處轉移，容易導致轉移部位異常增生，除了細胞異常增生，細胞凋亡也出現不可調控的狀態，黑色素瘤的臨床診斷和治療都有很大的滯后性。探索黑色素瘤的發生、發展的生物學機制，并探討黑色素瘤發生和進展的分子生物學機制，可以為黑色素瘤的診治提供新的重要途徑[12]。

在多種腫瘤中都可以發現c-Myc 的異常活化的現象。在小鼠的肝臟模型中過表達c-Myc 可誘發小鼠肝臟腫瘤的形成[13]，在臨床患者肝癌樣品組織中也能觀察到c-Myc 組織學表達的異常增高[14]。通過針對肝癌基因芯片的生物學表達及功能分析發現，c-Myc基因在肝癌的發生發展過程中發揮重要作用[15]。Baroudi等[16]研究表明，在細胞中c-Myc的異常激活可以導致miRNA功能被抑制，從而促進惡性腫瘤的發生，該結果提示，c-Myc所介導的基因表達沉默可能會引起腫瘤中miRNA水平廣泛下調。我們實驗旨在驗證c-Myc介導的基因沉默在黑色素瘤發生發展中所起到的作用及其可能的生物學機制。

目前關于miRNA的研究包括生物信息學預測以及生物芯片篩選，但兩者都需要通過后續試驗驗證[17，18]。由于miRNA的作用機制非常復雜，比如：調控蛋白的穩定性或者定位[19]和DNA以及RNA之間相互作用調控基因表達[20，21]、形成mRNA調控基因的表達[22]、調控mRNA前體的拼接、作為內源性競爭性RNA發揮調控作用等。本研究通過生物信息學分析我們的研究證實，c-Myc通過miR-199a調控PIK3R3的表達，影響黑色素瘤B16-F10的遷移和侵襲，從而促進黑色素瘤的發生和發展。

磷脂酰肌醇-3-激酶(PIK3R3)是細胞內脂質底物的轉換器。可以被酪氨酸激酶激活，進而產生第二信使(cAMP，cGMP)參與多條信號通路，調控細胞的增殖和侵襲。Huang等[23]研究表明PIK3R3在結腸癌中，可以促進其生長和轉移，抑癌因子miR-152可以直接靶向PIK3R3抑制結腸癌的惡性生物學行為。有研究發現，PIK3R3可以誘導EMT從而促進結腸癌的轉移能力[24]。在黑色素瘤當中，miR-221可以通過靶向PIK3R3抑制黑色素瘤細胞的增殖、侵襲和轉移能力[25]。本研究中，我們發現PIK3R3在黑色素瘤組織中表達增加，同時沉默PIK3R3后，黑色素瘤B16-F10細胞轉移和侵襲能力降低，這和前面其他研究報告結果相一致。

周建大等[26]研究發現，在黑色素瘤中，miR-199a可以通過靶向調控Let-7b，抑制黑色素瘤細胞的侵襲轉移。另一項研究表明，奈鉑達通過促進miR-199a表達抑制黑色素瘤細胞B16-F10的增殖和侵襲[27]。在黑色素瘤細胞B16-F10中，過表達miR-199a后，癌細胞明顯被抑制。這說明miR-199a參與了黑色素瘤的發生和進展。我們的研究發現，miR-199a可以直接靶向調控c-Myc和PIK3R3。這說明Myc和PIK3R3可能是促進腫瘤的作用，并且也間接說明c-Myc和PIK3R3之間的相互調控是通過miR-199a來實現的。

在本研究中，我們發現在黑色素瘤細胞B16-F10中，c-Myc的沉默會通過調控PI3K/AKT信號通路中PIK3R3蛋白來相應下調促癌miR199a分子的表達，并且發現促癌miR-199a與PIK3R3復合物之間有一種相互抑制的關系，從而可以形成一個雙負反饋環路。在黑色素瘤發生的過程中，該環路的失衡會導致miR-199a的進一步過表達以及下游信號通路的異常活化。本研究結果不但豐富了miRNA表觀沉默機制的內容，而且還為以c-Myc和PIK3R3為分子靶標的黑色素瘤癌治療新策略提供了新的理論依據。

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[收稿2016-08-15 修回2016-10-12]

(編輯 許四平)

c-Myc promoted migration and invasion of malignant melanoma B16-F10 cells through regulating PIK3R3

YANGJia-Ning，DENGFei，PANNing.

DepartmentofDermatologicalSurgery,SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople′sHospital,Chengdu610072,China

Objective:To investigate the effect and the related mechanism of c-Myc on the proliferation,invasion and migration ability of malignant melanoma B16-F10 cells.Methods: We detected the expression of PIK3R3 in malignant melanoma and normal tissues.Efficiency of gene silencing of c-Myc and PIK3R3 was determined by qPCR and Western blot.We detected the proliferate ability of B16-F10 cells after silencing c-Myc and PIK3R3 using EdU assay.We detected the migration and invasion ability of B16-F10 cells after silencing c-Myc and PIK3R3 using wound healing assays and Transwell matrigel invasion assays.The expression of miR-199a after silencing c-Myc and PIK3R3 using qPCR.The expression of c-Myc and PIK3R3 was detected by qPCR after transfecting miR-199a mimics or miR-199a inhibitor.Dual-luciferase reporter assay system was used to detect miR-199a regulating c-Myc and PIK3R3.Results: Compared normal skin tissue,expression of PIK3R3 was significantly increased in malignant melanoma tissue;after silencing c-Myc and PIK3R3 gene,the proliferation,invasion and metastasis of melanoma cell line B16-F10 were significantly reduced;expression of miR-199a upregulated after silencing c-Myc and PIK3R3 genes,expression of c-Myc and PIK3R3 decreased after transfecting miR-199a mimics,expression of c-Myc and PIK3R3 upregulated after transfecting miR-199a inhibitor,dual luciferase reporter system test results revealed miR-199a can directly regulate c-Myc and PIK3R3 transcription activity.Conclusion: miR199a regulated the expression of c-Myc,then promote proliferation,migration and invasion in malignant melanoma cells.

miR-199a;c-Myc;Malignant melanoma;Western blot;Transwell;Wound healing assay;PIK3R3

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.013

①本文為四川省衛計委科研課題(No.140084)。

楊鎵寧(1981年-)，男，碩士，主治醫師，主要從事皮膚腫瘤的基礎與臨床研究，E-mail：13880602002@163.com。

R739.5

A

1000-484X(2017)01-0066-06

②四川省醫學科學院，四川省人民醫院腎臟內科，成都610072。