miR-132靶向調控Ezrin抑制卵巢癌細胞增殖、促進凋亡的實驗研究

楊 波 李勝澤 馬 玲 郭蘇陽 劉紅麗 劉 健 邵均均

(蚌埠醫學院第一附屬醫院婦瘤科，蚌埠233004)

miR-132靶向調控Ezrin抑制卵巢癌細胞增殖、促進凋亡的實驗研究

楊 波 李勝澤 馬 玲 郭蘇陽 劉紅麗 劉 健 邵均均

(蚌埠醫學院第一附屬醫院婦瘤科，蚌埠233004)

目的：探討微小核糖核酸分子(miRNA)-132在卵巢癌中生物學作用和作用靶點。方法：收集22例卵巢癌及癌旁非腫瘤組織標本，RT-PCR檢測miR-132表達量；RT-PCR檢測人正常卵巢上皮細胞和卵巢癌細胞系中miR-132表達量；選擇miR-132表達量最高或最低的卵巢癌細胞株，分別轉染陰性對照質粒(NC)和miR-132 mimic質粒，RT-PCR檢測轉染后miR-132表達量；CCK-8法檢測細胞增殖，流式細胞儀檢測細胞凋亡，Western blot檢測Ezrin蛋白表達。結果：卵巢癌組織中miR-132表達量顯著低于癌旁非腫瘤組織，而卵巢癌細胞系中miR-132表達量顯著低于正常卵巢上皮細胞，差異均有統計學意義(P<0.05)；選擇卵巢癌細胞株中miR-132表達量最低卵巢癌SKOV3細胞株進行基因轉染，與轉染陰性對照質粒相比，轉染miR-132 mimic質粒后miR-132表達量顯著上升，細胞增殖顯著降低，細胞凋亡顯著增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；Western blot結果顯示，上調miR-132表達后，卵巢癌SKOV3細胞株中Ezrin蛋白表達顯著上升(P<0.05)。結論：在卵巢癌中，miR-132可能作為一種抑癌基因通過靶向調控Ezrin抑制卵巢癌細胞增殖、促進凋亡。

miR-132；卵巢癌；增殖；凋亡；埃茲蛋白

卵巢癌在婦科腫瘤中發病率排第三，病死率第一。卵巢癌病死率居高不下的原因是由于早期篩查和診斷困難，患者就診時大部分已經處于中晚期，加上卵巢癌對化療的耐藥以及復發和轉移[1]。而提高卵巢癌的早期診斷和有效治療方法是目前臨床亟待解決的問題。

埃茲蛋白(Ezrin) 是ERM家族成員之一，是一種膜細胞骨架連接蛋白，能夠對細胞的形態、黏附和運動造成影響。Ezrin能夠將轉移信號轉導致細胞內，在細胞信號轉導方面具有重要作用[2]。Ezrin主要表達與上皮細胞膜的內側，在大多數的組織中均有表達，具有廣泛的生理功能。Ezrin能夠調節腫瘤細胞表明的黏附分子，對腫瘤細胞的生長、分化等具有重要的調節作用[3]。研究認為，Ezrin低表達與卵巢癌的惡性程度、復發和轉移、預后等密切相關[4，5]。

染色體重塑、組蛋白修飾、DNA甲基化以及非編碼RNA調控等表觀遺傳學方面是近年來腫瘤發病機制研究的重點。其中非編碼RNA調控作為一種新穎的基因表達調控機制備受關注。微小核糖核酸分子(MicroRNA)是常見的非編碼單鏈RNA，廣泛參與了基因網絡調控，在炎癥發生，細胞生長、分化、增殖、凋亡，腫瘤發生，組織器官形成和信號通路調控中扮演著重要的角色。研究已經證實，多種腫瘤的發生和發展與miRNA密切相關[6-8]。

miR-132定位在人類染色體17p13，與中樞神經系統、腫瘤、炎癥、和血管生長密切相關。已經有研究發現，乳腺癌、大腸癌、肝癌、非小細胞肺癌等多種人類腫瘤中miR-132低表達，發揮抑癌基因作用[9-12]。miR-132在卵巢癌中的作用并不明確，本研究旨在探討miR-132在卵巢癌中生物學作用和作用靶點，以期尋找到有效的卵巢癌診斷標志物和治療靶點，改善患者預后。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本和細胞系 收集醫院2014年8月～2016年2月手術切除的22例卵巢癌及癌旁非腫瘤組織標本，標本獲取后30 min內液態氮速凍，并在-80℃條件下保存。所有患者均經病理診斷確診，術前均未進行放療或化療。22例患者中年齡28～62歲，平均年齡(46.65±15.48)歲。人正常卵巢上皮細胞(IOSE80)和卵巢癌細胞系(OVCAR3、A2780、SKOV3、ES2)均購自長沙贏潤生物科技有限公司，置于5%CO2、飽和濕度、37℃的胎牛血清培養基中常規培養，穩定傳代2～3次后選取對數期生長的細胞進行實驗。

1.1.2 試劑和材料 anti-β-actin、anti-Ezrin均由美國Sigma公司提供；電泳儀、PCR儀購自美國Bio-Rad公司，CO2培養箱購自美國Thermo公司；流式細胞儀由美國BECKMANCOULTER公司提供。PCR引物及miR-132類似物(mimic)由上海吉瑪生物公司提供；脂質體LipofectamineTM2000、miRNeasy mini Kit試劑盒、RT-PCR試劑盒、TRIzol試劑盒均購自德國Qiagen公司；DMEM培養基、胎牛血清由美國GeneCopoeia公司提供。CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自日本Dojindo公司。

1.2 方法

1.2.1 RT-PCR檢測組織和細胞中miR-132表達 病理組織切2～4薄片約100 mg，室溫裂解后加入三氯甲烷，離心后靜置，隨機選取12個樣品，每個樣品取2 μl。采用TRIzol試劑盒提取組織樣品和細胞中總RNA。制作逆轉錄反應體系，并合成修飾后的miRNA cDNA。以cDNA作為模板，制作RT-PCR的反應體系，PCR反應條件為：95℃預變性10 min，95℃變性10 s，60℃退火20 s，72℃延伸10 min，擴增40個循環。根據融解曲線計算循環數Ct值，Ct值越小，參與反應的起始模板量越多，以U6作為內參基因，計算△Ct=CtmiR-132-CtU6，miR-132的相對表達量=2-△△Ct。

1.2.2 基因轉染 構建慢病毒感染的陰性對照質粒(NC)和miR-132 mimic質粒。用含1%的雙抗和5%滅活的胎牛血清培養基培養卵巢癌細胞系(選擇其中一種表達量最低或最高的)，細胞起始濃度為2×106個/孔。細胞密度達到75%時將對數期生長的細胞分為兩組(NC組和miR-132 mimic)，分別加入NC和miR-132 mimic病毒懸浮液，以新鮮培養基更換舊的培養基。RT-PCR檢測轉染后miR-132表達量。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖 取NC組和miR-132 mimic組分別轉染了24、48、72、96、120 h的對數生長期細胞，胰酶消化后以2×106個/孔加入到96孔板中，常規培養孵育3 h后加入CCK-8溶液10 μl，孵育2 h后酶標儀測定吸光度(OD)值，繪制增殖曲線。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡 將轉染48 h后的兩組細胞用PBS清洗，胰酶消化后制成細胞懸液，離心棄上清液，PBS清洗后加入Binding buffer清洗和重懸細胞，加入碘化丙啶和Annexin V-FITC，孵育20 min制成1×105個/ml的細胞懸液，尼龍網過濾后上流式細胞儀測定。

1.2.5 Western blot檢測Ezrin蛋白表達 按照試劑盒說明提取細胞中的總蛋白，變性。采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，酶標儀測定OD值，繪制標準曲線。配置與蛋白大小相符的分離膠和濃縮膠，蛋白上樣后濃縮膠電泳加壓。脫脂奶粉封閉，加入1∶1 000稀釋的Ezrin和1∶5 000稀釋的β-actin一抗；孵育1 h后加入1∶5 000通用二抗。孵育0.5 h后漂洗、顯影、曝光，圖像處理軟件分析Ezrin蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 卵巢癌組織和細胞中miR-132表達量 與癌旁組織比較(0.993±0.054)相比，22例卵巢癌組織中miR-132表達量(0.503±0.219)顯著降低，差異有統計學意義(t=3.302,P<0.05)(圖1A)。4種卵巢癌細胞中miR-132表達量均顯著低于卵巢正常上皮細胞株IOSE80(P<0.05)，其中SKOV3細胞株中miR-132表達量最低(圖1B)，作為后續實驗的細胞株。

2.2 轉染miR-132 mimic后SKOV3細胞株miR-132表達量上升 采用miR-132 mimic轉染SKOV3細胞株，miR-132表達量顯著上升(7.749±1.035)，與NC組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 卵巢癌組織和細胞中miR-132表達量Fig.1 miR-132 expression in ovarian cancer tissue and cell volumeNote: *.P<0.05.

圖2 轉染miR-132 mimic后SKOV3細胞株miR-132表達量上升Fig.2 Expression of miR-132 increased after transfection miR-132 mimic in SKOV3 cell linesNote: *.P<0.05.

2.3 過表達miR-132對卵巢癌細胞增殖的影響 采用轉染miR-132 mimic上調卵巢癌SKOV3細胞株miR-132表達量，CCK-8檢測各組細胞增殖情況，結果發現，自72 h開始，miR-132 mimic組細胞增殖顯著降低，與NC組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 過表達miR-132對卵巢癌細胞凋亡的影響 采用轉染miR-132 mimic上調卵巢癌SKOV3細胞株miR-132表達量，流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況，結果發現，miR-132 mimic組細胞凋亡顯著增加，與NC組比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖3 過表達miR-132抑制卵巢癌細胞增殖Fig.3 Overexpression of miR-132 inhibits proliferation of ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

圖4 過表達miR-132促進卵巢癌細胞凋亡Fig.4 Overexpression of miR-132 promotes apoptosis of ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

圖5 過表達miR-132促進卵巢癌細胞中Ezrin蛋白表達Fig.5 Overexpression of miR-132 promotes expression of Ezrin in ovarian cancer cellNote: *.P<0.05.

2.5 Ezrin是miR-132下游靶基因 Western blot結果顯示，上調miR-132表達后，卵巢癌SKOV3細胞株中Ezrin蛋白表達顯著上升(P<0.05)，推測Ezrin是miR-132下游靶基因。見圖5。

3 討論

卵巢癌是臨床常見的婦科生殖系統惡性腫瘤，具有惡性程度高、病死率高以及極易出現復發和轉移、預后差等特點。由于缺乏早期特異性癥狀和有效的篩查方法，卵巢癌早期不易被發現，而多數患者因出現臨床癥狀就診時已經到了中晚期。手術+化療等綜合治療方式雖然可以取得一定的效果，但卵巢癌患者的5年生存率仍然不到30%。了解卵巢癌細胞發生發展的分子機制，發掘差異性表達的預測分子標志物并對其生物學功能進行深入研究，將有助于提高卵巢癌診斷和治療水平，具有重要的臨床意義。

miRNA因其新穎的基因表達調控機制近年來備受關注，miRNA不編碼蛋白，通過結合下游靶基因3′-UTR影響mRNA。目前關于miRNA與卵巢癌的報道較多，Liu等[13]發現卵巢癌中MiR-214顯著降低。Chen等[14]通過對卵巢癌預后的研究發現，miR-21和附睪蛋白4(HE4)均在卵巢癌組織中高表達，兩者呈顯著正相關，復發患者miR-21和HE4表達量高于未復發患者，認為miR-21和HE4與卵巢癌的預后有關。本研究采用RT-PCR技術，首先檢測了22例卵巢癌組織和癌旁非腫瘤組織中miR-132表達量，結果發現卵巢癌組織miR-132表達量顯著低于癌旁組織；進一步對比了卵巢癌細胞系和正常卵巢上皮細胞中miR-132表達量，結果發現，卵巢癌細胞系miR-132表達量顯著低于正常卵巢上皮細胞。說明miR-132在卵巢癌中低表達，可能作為抑制抑癌基因參與卵巢癌的發生和發展。

增殖增加和凋亡減少是腫瘤細胞最常見的兩個生物學特點，也是腫瘤形成和發展的生物學基礎[15]。為了研究miR-132在卵巢癌細胞中的生物學作用，本研究采用過表達質粒miR-132 mimic轉染卵巢癌細胞SKOV3，結果發現miR-132表達量顯著上升；上調miR-132表達后卵巢癌細胞的增殖受到了顯著的抑制，凋亡明顯增加。結果表明，miR-132有促進腫瘤細胞凋亡，抑制增殖的作用，與Tian等[16]結果類似。

關于miR-132相關分子信號機制存在較大差異，例如Lei等[17]研究發現miR-132通過調控YAP抑制肝癌細胞增殖。在垂體腫瘤的研究中，Ren等[18]發現，miR-132在垂體腫瘤中低表達，上調miR-132表達可以降低Sox5表達并抑制腫瘤細胞生長、侵襲和轉移。以往研究認為，Ezrin低表達與卵巢癌的惡性程度、復發和轉移、預后等密切相關[4，5]。利用生物信息學檢索工具可以發現Ezrin是miR-132下游靶點之一，具有miR-132的特異性結合序列。因此，本研究進一步檢測了上調miR-132表達后Ezrin蛋白表達情況，結果發現，Ezrin蛋白表達顯著上升。結果表明miR-132可能靶向調控Ezrin抑制卵巢癌細胞增殖、促進凋亡。

總而言之，本研究發現卵巢癌中miR-132低表達，miR-132可能作為一種抑癌基因，靶向調控Ezrin抑制卵巢癌細胞增殖、促進凋亡，為進一步的分子機制研究提供了新的思路。本研究的不足之處主要有：首先臨床樣本量不足，研究結果可能存在偏倚；此外，本研究為體外細胞研究，體內研究結果仍需要后續開展以進一步驗證。

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[收稿2016-08-15 修回2016-10-14]

(編輯 許四平)

Experimental research of miR-132 inhibits proliferation and induces apoptosis of ovarian cancer via Ezrin

YANGBo,LISheng-Ze,MALing,GUOSu-Yang,LIUHong-Li,LIUJian,SHAOJun-Jun.

DepartmentofGynecology,theFirstAffiliatedHospitalofBengbuMedicalCollege,Bengbu233004,China

Objective:To explore the biological function of miR-132 in ovarian cancer and the target.Methods: 22 cases ovarian cancer tissue and non-tumor tissue adjacent were collected,the expression of miR-132 in tumor tissue and non-tumor tissue,normal ovarian epithelial cells and ovarian cancer cell were detected by RT-PCR.The normal ovarian epithelial cells which the expression of miR-132 maximum or minimum were chosen,and they were divided into two groups,respectively with transfection of negative control plasmid (NC) and miR-132 mimic plasmid.The expression of miR-132 after transfection was detected by RT-PCR,the cell proliferation and cell apoptosis were detected by CCK-8 method and flow cytometry instrument respectively,the expression of Ezrin protein was detected by Western blot.Results: The expression of miR-132 in tumor tissue was significantly lower than the tumor tissue adjacent,the expression of miR-132 in ovarian cancer cell lines was significantly lower than normal ovarian epithelial cells,the differences were statistically significant (P<0.05).The SKOV3 cell lines was chosed for gene transfection,compared with NC group,transfection with miR-132 mimic plasmid could significantly reduce cell proliferation,increase cell apoptosis,the difference had statistical significance (P<0.05).Western blot results showed that up-regulation miR-132 significantly increased the Ezrin protein expression in ovarian cancer SKOV3 cells (P<0.05).Conclusion: In ovarian cancer,miR-132；inhibits proliferation and induces apoptosis of ovarian cancer via Ezrin,it may be a tumor suppressor gene.

miR-132;Ovarian cancer;Proliferation;Apoptosis;Ezrin

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.014

楊 波(1978年-)，男，醫學碩士，副主任醫師，主要從事婦科惡性腫瘤的基礎和臨床方面的研究，E-mail：yangbo4836@163.com。

R737.31

A

1000-484X(2017)01-0072-05