HIV感染者T細胞NKG2C/NKG2A表達及與疾病進展關系研究①

陶安福 何 磊 張子寧 傅雅靜 劉 靜 胡清海 姜擁軍

(中國醫科大學附屬第一醫院檢驗科 衛生部艾滋病免疫學重點實驗室，沈陽110001)

HIV感染者T細胞NKG2C/NKG2A表達及與疾病進展關系研究①

陶安福 何 磊 張子寧 傅雅靜 劉 靜 胡清海 姜擁軍②

(中國醫科大學附屬第一醫院檢驗科 衛生部艾滋病免疫學重點實驗室，沈陽110001)

目的：研究HIV慢性感染者和HARRT治療者T細胞NKG2C/NKG2A受體的表達變化，探討其與疾病進展的關系。方法：選取HIV慢性感染者、接受HAART治療的HIV感染者以及健康人的外周血細胞，通過熒光抗體染色，利用流式細胞儀檢測T細胞上表達的NKG2C/NKG2A受體。結果：HIV慢性感染者NKG2C+T細胞，NKG2A+T細胞和NKG2C+NKG2A-T細胞百分比明顯高于健康對照組 (P=0.025、P=0.032、P=0.029)，HARRT治療組則明顯低于HIV慢性感染者(P=0.033、P=0.037、P=0.018)，恢復到正常水平，與健康對照組相比無統計學差異。HIV慢性感染者外周血CD4+T淋巴細胞絕對數和表達NKG2A、NKG2C+NKG2A+和NKG2C-NKG2A+的T細胞呈負相關(r=-0.697,P<0.000 1；r=-0.463,P=0.015；r=-0.693,P<0.000 1)，HIV慢性感染者外周血T細胞上表達的NKG2C與NKG2A的比值與CD4+T淋巴細胞絕對數呈正相關(r=0.476,P=0.012)。結論：HIV感染者T細胞表面NKG2C和NKG2A的表達研究具有重要意義，為HIV感染的臨床預后評估提供科學依據。

HIV感染者；T細胞；NKG2C；NKG2A

獲得性免疫缺陷綜合征，又稱艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome，AIDS)，是由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染所引起的一種免疫缺陷性疾病，患者以CD4+T細胞減少為主要特征，同時伴有反復機會感染、惡性腫瘤及中樞神經系統退行性病變，最終導致死亡，對人類的健康造成了極大威脅[1]。胸腺依賴性淋巴細胞(Thymus dependent lymphocyte)， 又稱 T 細胞，是來自胚肝或骨髓的始祖 T 淋巴細胞且在胸腺內完成分化發育和成熟。T 細胞表面分布一定數量的T 細胞受體(T cell receptor,TCR)，用于特異性識別抗原或者輔助相關功能[2]。NKG2家族屬于C型凝集素家族，包括了NKG2A、NKG2C、NKG2E和NKG2D/F等[3,4]，分布于部分T細胞和NK細胞上。這些NKG2受體既有抑制性受體NKG2A/B，又有活化性受體NKG2C、NKG2D和NKG2E。其中NKG2A/B可與CD94形成二聚體，發揮抑制性作用；NKG2C和NKG2E與CD94、DAP12連接后形成活化性受體，傳遞活化性信號，增強細胞的殺傷能力[5]。

目前關于HIV慢性感染者和HARRT治療者T細胞上NKG2A/NKG2C的研究和報道較少，尚無和疾病進展關系的研究報道。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 本實驗共收集了70例受試對象，包括27例HIV慢性感染者(Chronically HIV infection,CHI)，21例HIV感染后進行HARRT治療者以及22例健康對照者(HIV-negative normal control,NC)。健康對照者符合以下標準方可入組：HIV抗體陰性、無免疫系統疾病、血常規及肝功檢查正常、乙型肝炎表面抗原及抗丙型肝炎抗體陰性。

1.1.2 主要試劑和儀器 單克隆熒光抗體：CD3-FITC(美國BD公司)，NKG2A-PE和NKG2C-APC(美國R&D公司)，溶血素(乙二胺四乙酸二鈉0.037 g、氯化銨8.25 g、碳酸氫鉀1.0 g、去離子水1 000 ml)，流式細胞儀：FACS Calibur和 FACS Aria(美國BD公司)

1.2 方法

1.2.1 CD4+T細胞絕對值檢測 CD4+T細胞絕對值檢測參照1997 年美國疾病預防控制中心制定的指導方法，應用FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)進行檢測，使用MultiSET軟件分析得出CD4+T淋巴細胞絕對值。

1.2.2 HIV病毒載量測定 HIV病毒載量測定使用標準版模板制備法，提取500 μl血漿中的RNA，在COBAS AMPLICOR自動載量儀上采用Roche公司HIV-1 Monitor 1.5試劑盒以RT-PCR方法檢測病毒載量，最低檢測限是400 copies/ml。

1.2.3 外周血T細胞的百分數及細胞表面NKG2A、NKG2C受體的檢測 應用熒光抗體CD3-FITC(美國BD公司)/NKG2A-PE(美國R&D公司)/NKG2C-APC(美國R&D公司)，加入100 μl EDTA抗凝全血，室溫條件下避光 30 min。加入溶血素3 ml，室溫條件下避光 8 min；洗滌3次，最后加入200 μl含有1%多聚甲醛固定液，應用FACS Aria流式細胞儀上機進行檢測，采用BD FACS DivaTM軟件分析實驗結果。畫門策略見圖1。

1.3 統計學分析 應用SPSS20.0軟件包進行統計分析，全部數據采用中位數表示，采用Mann-WhitneyU檢驗進行各組間的實驗指標比較，采用Spearman秩相關檢驗進行相關性分析，P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 T細胞上表達的NKG2C和NKG2A在健康對照者、HIV慢性感染者和HARRT治療者的變化 我們檢測受試對象外周血T細胞上表達的NKG2C和NKG2A受體，結果顯示T細胞上表達的NKG2C受體在CHI組有顯著性升高(P=0.025)，HARRT組經過治療后出現顯著性下降(P=0.033)。T細胞上表達的NKG2A受體在CHI組比健康對照組有顯著升高(P=0.032)，經過治療后的HARRT組出現明顯下降，具有統計學意義(P=0.037)。我們將NKG2C和NKG2A受體組合起來，觀察在不同人群中的分布情況，發現CHI組NKG2C+NKG2A-T細胞出現顯著性升高(P=0.029)，HARRT組經過治療后出現明顯下降，具有統計學意義(P=0.018)，見圖2。

2.2 HIV慢性感染者外周血T細胞上表達的NKG2C和NKG2A受體與CD4+T細胞數量的相關性 為了觀察HIV慢性感染者外周血T細胞上表達的NKG2C和NKG2A受體與疾病進展的關系，本實驗統計了HIV慢性感染者的CD4+T淋巴細胞絕對數和病毒載量，并分別和外周血T細胞上表達的NKG2C和NKG2A受體進行相關性分析，結果顯示外周血CD4+T細胞數量和T細胞上表達的NKG2A受體百分數呈負相關(r=-0.697,P<0.000 1)，進一步觀察NKG2C和NKG2A受體組合的表達情況，結果顯示表達NKG2C+NKG2A+和NKG2C-NKG2A+的T細胞百分數和CD4+T細胞數量均成負相關(r=-0.463,P=0.015;r=-0.693,P<0.000 1)，而病毒載量和T細胞上NKG2C、NKG2A受體的表達無明顯相關性(r=0.161,P=0.464;r=0.215,P=0.324)，見圖3。

圖1 畫門策略Fig.1 Gating strategyNote: A.P1 gate is lymphocytes;B.P2 gate is CD3+ lymphocytes;C.The expressions of NKG2C,NKG2A in T cells,respectively.

圖2 T細胞上表達NKG2C和NKG2A受體在健康對照者(NC)、HIV慢性感染者(CHI)和HARRT治療者(HARRT)的統計比較Fig.2 Comparisons of NKG2C and NKG2A receptors expression on T cells in NC group,CHI group and HAART groupNote: A.Percentage of NKG2C expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group;B.Percentage of NKG2A expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group;C.Percentage of NKG2C+NKG2A- expressed on T cells in NC group,CHI group and HAART group.*.P<0.05.

圖3 HIV慢性感染者(CHI)外周血T細胞上表達的NKG2A和NKG2C受體與CD4+ T細胞數量和病毒載量的相關性分析Fig.3 Correlation between NKG2A,NKG2C receptors expressed on T cells and absolute counts of CD4+ T cells and HIV viral load in CHI groupNote: A.Correlation between NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;B.Correlation between NKG2C+NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;C.Correlation between NKG2C-NKG2A+ T cells and the absolute counts of CD4+ T cells in CHI group;D.Correlation between NKG2C+ T cells and HIV viral load in CHI group;E.Correlation between NKG2A+ T cells and HIV viral load in CHI group.

圖4 HIV慢性感染者(CHI)外周血T細胞上表達的NKG2C和NKG2A的比值與CD4+ T細胞數量的相關性分析Fig.4 Correlation between NKG2C/NKG2A expressed on T cells and absolute counts of CD4+ T cells in CHI groupNote: The absolute number of peripheral blood CD4+ T lymphocytes has positive correlation with the ratio of NKG2C and NKG2A expres-sed on T cells receptor in HIV chronically infected individuals.

2.3 HIV慢性感染者外周血T細胞上表達的NKG2C和NKG2A的比值與CD4+T細胞數量呈正相關關系 除了分析NKG2C和NKG2A受體單獨表達以及聯合表達與CD4+T淋巴細胞絕對數的相關關系，我們進一步統計分析了HIV慢性感染者外周血T細胞上NKG2C/NKG2A的比值和CD4+T細胞數量，發現兩者呈正相關(r=0.476,P=0.012)，見圖4。

3 討論

T細胞是人體適應性免疫應答的重要效應細胞，成熟的T細胞經血流分布至外周免疫器官的胸腺依賴區定居，廣泛接觸進入體內的抗原物質，通過 T 細胞抗原受體(TCR)的第一信號和共刺激分子第二信號的協同刺激激活細胞[6,7]，并可經淋巴管、外周血和組織液等發揮細胞免疫及免疫調節等功能，長期保持免疫記憶能力。NKG2A和NKG2C作為共同作用于配體HLA-E上的一對抑制性受體和活化性受體，除了在NK細胞上表達，在T細胞上亦有一定的表達，對T細胞內信號的傳遞產生影響。HIV感染之后機體的免疫系統被激活，作為活化性受體的NKG2C，通過識別人類細胞上表達的HLA-E以及DAP-12，傳遞活化性信號給靶細胞，增強T 細胞的殺傷能力。NKG2A是抑制性受體，通過識別人類細胞上表達的HLA-E，NKG2A表達增加，抑制細胞的功能。由于NKG2家族受體的報道主要集中于單一受體的表達，很少對兩種不同作用的受體在同一細胞表面表達進行研究，考慮NKG2C和NKG2A作為一對共配體HLA-E的受體分子，單獨研究一種受體只能片面地反映細胞的功能變化，我們對活化性受體NKG2C和抑制性受體NKG2A同時進行檢測，將會更全面地反映出HIV慢性感染者和HARRT治療者外周血T細胞在HIV感染后的變化。

我們在實驗中觀察到NKG2C+和NKG2A+以及NKG2C+NKG2A-T細胞在慢性感染者中出現顯著性增長。NKG2C受體的增多會傳遞更多的活化信號，調節細胞的免疫功能；HIV感染引起全身免疫系統的活化，進而導致抑制性受體NKG2A反饋性增多。NKG2A受體的增多又抑制了細胞的免疫功能，導致HIV慢性感染者體內病毒持續的存在和擴增。目前關于T 細胞上NKG2受體家族有部分報道， Mingari[8]和De Maria[9]研究發現抑制性受體是通過對細胞毒性T細胞的抑制效應來降低對病原體的清除。我們觀察的NKG2A是一種抑制性受體，T細胞上表達的NKG2A數量在感染HIV后出現顯著性增長將抑制機體免疫系統對HIV病毒的清除。Magdalena[10]在感染HSV-1的小鼠模型中發現CD8+T 細胞表面表達NKG2A/C/E受體出現明顯增長，小鼠模型中的實驗結果有力支持了我們在HIV感染者外周血中看到的結果，即T細胞上表達的NKG2A受體和NKG2C受體在HIV慢性感染者中出現明顯增長。而Miller等[11]在感染淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒的小鼠模型中發現在抗原特異性的CD8+T 細胞表面高表達NKG2家族，但是當疾病進入慢性進展期后，NKG2家族受體數量出現了下調。我們分析Miller研究的對象小鼠感染的是淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒，而本實驗的研究對象人感染的是HIV病毒，因此兩個實驗雖然檢測同樣的實驗指標，實驗結果存在一定的差異。

HARRT組經治療后出現了顯著性下降，且與健康對照者相比無統計學差異，說明經過治療后機體的免疫系統得以改善。很多接受HARRT治療的患者經檢測發現病毒載量低于檢測下限， CD4+T 細胞絕對數也有不同程度增長，其體內T細胞表面表達的NKG2A和NKG2C以及NKG2C+NKG2A-的數量隨著疾病進展均出現了顯著性下降，恢復到正常人水平。Costa[12]在實驗中發現HIV-Ⅰ型病毒感染者在未治療時CD8+T細胞CD94/NKG2A表達升高，經6個月的抗逆轉錄病毒治療表達未顯著減少，經24個月的治療后可恢復至與健康對照人群無差異的水平。而我們實驗選取的HARRT治療組全部標本距離開始治療的時間均小于兩年，經過HARRT治療后觀察到T細胞上表達的NKG2A受體和NKG2C受體數量和健康對照組比較沒有統計學差異。兩組實驗結果中NKG2家族受體的恢復時間有差異，考慮可能是由于兩組實驗收集的人群不同造成的，Costa觀察的是典型HIV感染者，且前期抗病毒感染治療失敗，而我們收集的HARRT組患者都屬于初次治療。

CD4+T細胞數量是衡量人體機體免疫力的重要指標之一。本實驗通過檢測HIV慢性感染者CD4+T細胞數量，并和外周血T細胞上表達的NKG2A和NKG2C受體進行相關性分析時發現， NKG2A+T細胞、NKG2C+NKG2A+T細胞以及NKG2C-NKG2A+T細胞與CD4+T細胞數量成反比例關系，提示T細胞表面NKG2A+，NKG2C+NKG2A+以及NKG2C-NKG2A+的表達將是研究疾病進展的重要指標，對于HIV感染臨床預后評估具有重要意義。

本實驗進一步統計分析了HIV慢性感染者外周血T細胞上NKG2C/NKG2A的比值和與CD4+T淋巴細胞絕對數的關系，結果提示兩者呈正相關關系。由于HIV進入人體后在靶細胞中復制增殖，可通過直接或者間接途徑攻擊和破壞CD4+T 淋巴細胞，導致CD4+T 淋巴細胞絕對數顯著減少，功能嚴重障礙。實驗結果顯示HIV慢性感染者外周血T細胞上NKG2C/NKG2A的比值越低，CD4+T淋巴細胞絕對數越少，機體的免疫功能越低下，NKG2C/NKG2A的比值可作為臨床上預后評估判斷的依據之一。

綜上所述，本實驗研究了HIV慢性感染者和HARRT治療者外周血中T細胞表達的NKG2C和NKG2A受體的變化，首次分析了NKG2A和NKG2C受體與CD4+T 淋巴細胞絕對數的相關性，提示T細胞表面NKG2C/NKG2A受體表達在HIV感染中具有重要意義，為臨床上治療HIV感染和預后評估判斷提供科學依據。而人體感染HIV后表達NKG2C和NKG2A受體的T細胞功能如何變化目前尚無報道，還有待后續進一步的實驗去探索和研究。

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[收稿2016-06-01]

(編輯 倪 鵬)

Research on expression of NKG2C/NKG2A receptors on T cells in HIV infected individuals and relationship with disease progression

TAOAn-Fu，HELei，ZHANGZi-Ning，FUYa-Jing，LIUJing，HUQing-Hai，JIANGYong-Jun.

KeyLaboratoryofAIDSImmunologyofMinistryofHealth，DepartmentofLaboratoryMedicine，theFirstHospitalofChinaMedicalUniversity，Shenyang110001，China

Objective:To study the changes of NKG2C/NKG2A expressed on T cells in HIV chronically infected individuals and HAART-treatment AIDS patients and the relationship with disease progression of HIV.Methods: We collected peripheral blood from HIV chronically infected individuals,HAART-treatment AIDS patients and healthy human and used the flow cytometry by staining fluorescent antibody to detect the NKG2C/NKG2A receptors expressed on T cells.Results: NKG2C+,NKG2A+and NKG2C+NKG2A-expressed on T cells in HIV chronically infected individuals were significantly higher than the healthy control group (P=0.025，P=0.032，P=0.029),while in HAART-treatment AIDS patients were significantly lower than that in HIV chronically infected individuals (P=0.033，P=0.037，P=0.018),returned to the normal levels with no significant difference compared with the healthy control group.The absolute number of peripheral blood CD4+T lymphocytes in HIV chronically infected individuals was negative correlation with T cells which expressing NKG2A+，NKG2C+NKG2A+and NKG2C-NKG2A+(r=-0.697,P<0.000 1；r=-0.463,P=0.015；r=-0.693,P<0.000 1).What was more,the absolute number of peripheral blood CD4+T lymphocytes had positive correlation with the ratio of NKG2C and NKG2A expressed on T cells receptor in HIV chronically infected individuals(r=0.476,P=0.012).Conclusion: Studying the expression of NKG2C and NKG2A receptors on T cell has great significance in HIV infected individuals,which may provide a scientific basis for clinical prognosis of HIV infection.

HIV infected individuals;T cells;NKG2C;NKG2A

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.018

陶安福(1991年-)，男，在讀碩士，主要從事艾滋病免疫學研究，E-mail：taftaf@163.com。

R512.91

A

1000-484X(2017)01-0090-05

①本文為十二五科技重大專項(2014ZX10001002-001-004)和基礎臨床緊密結合平臺項目(醫大發字[2013]5號)。

②通訊作者，E-mail：jiangjun55555@163.com。