噻可拉林協同順鉑促進宮頸癌c4-1及Hela細胞凋亡機制的研究

董紅玲 周 萍 楊文靜

(江漢大學附屬醫院婦產科，武漢430015)

噻可拉林協同順鉑促進宮頸癌c4-1及Hela細胞凋亡機制的研究

董紅玲 周 萍①楊文靜

(江漢大學附屬醫院婦產科，武漢430015)

目的：探討噻可拉林協同順鉑促進宮頸癌c4-1、Hela細胞凋亡的機制。方法：用不同濃度噻可拉林和順鉑單獨或聯合作用于體外培養的c4-1、Hela細胞，MTT法檢測c4-1、Hela細胞生長抑制率，Hoechst 33342 和AO-EB染色法檢測細胞凋亡，Western blot檢測細胞Bax、Bcl2、p53、p21蛋白的表達，流式細胞術檢測細胞增殖周期。結果：c4-1及Hela細胞經不同濃度的噻可拉林和順鉑單獨或聯合作用后，細胞的體外增殖活力被明顯抑制，呈劑量依賴關系，且在聯合使用噻可拉林(10 nmol/L)：順鉑(4 μmol/L)用量時抑制效果最明顯(P<0.05)；AO-EB染色法顯示，噻可拉林和順鉑聯合使用，細胞凋亡更明顯。Western blot則顯示，Bax、p53、p21表達明顯上調，而Bcl2的表達則明顯下調。結論：噻可拉林能協同順鉑上調Bax、p53、p21的表達和下調Bcl2的表達，抑制宮頸癌c4-1、Hela細胞增殖同時促進細胞凋亡。

噻可拉林；順鉑；宮頸癌；凋亡

子宮頸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，它占所有癌癥發病率的13%[1]，人乳頭狀瘤病毒(Human papilloma virus,HPV)感染是子宮頸癌發生的主要因素，該疾病常好發于育齡婦女，中老年婦女因生殖系統易感HPV，也是發病人群之一[2]。最近，有兩個預防HPV的疫苗(Gardasil和Cervarix)上市，但是對于已經感染HPV或患宮頸癌患者而言，該疫苗無任何作用[3]。因此，仍然需要尋找新的治療策略。目前宮頸癌的常規治療方法是放療、化療和手術治療。順鉑無論是單獨使用或與托泊替康組合使用的首選藥物。然而，順鉑治療時產生的副作用如骨髓抑制癥、粒細胞減少、血小板減少、腎毒性和神經毒性貧血會對患者產生嚴重危害[4]。鑒于以上血液系統毒性反應和后天耐藥，在整個化療過程中必須對使用順鉑使用劑量進行嚴格的限制[5]。因此提高低劑量順鉑的化療效果是目前臨床治療有效的治療手段之一[6,7]。噻可拉林是一種硫代縮酚酸肽雙嵌入劑，研究表明，其對很多腫瘤細胞均有一定的細胞毒性，包括乳腺癌細胞、肺癌細胞、結腸癌細胞、腎癌細胞以及黑色素瘤細胞。它能夠誘導腫瘤細胞周期在G1期停滯[7-9]。本研究將探討噻可拉林協同順鉑對宮頸癌c4-1、Hela細胞凋亡的影響，并初步研究其機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與設備 主要試劑包括RPMI1640培養、基胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、MTT、DMSO、青霉素、鏈霉素購自美國Sigma公司，Bax、Bcl2、p53、p21、β-actin抗體購自Santa cruz，ECL試劑購自Thermo fisher，細胞裂解液、PMSF(蛋白酶抑制劑)、BCA試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所，SDS-PAGE試劑購自Bio-Rad，噻可拉林購自馬爾藥品公司，AO-EB染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。主要設備包括CO2培養箱，超凈工作臺， 熒光顯微鏡，Bio-Rad垂直電泳儀，Bio-Rad Western blot化學發光成像系統。人宮頸癌c4-1、Hela細胞株購自中國典型培養物保藏中心(CCTCC)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人宮頸癌c4-1、Hela細胞株培養于含有10%FBS、150 U/ml青霉素、150 U/ml鏈霉素的RPMI1640培養基中，5%的CO2培養箱中37℃常規培養，0.25%胰蛋白消化傳代后按實驗需要接種于6孔板中。

1.2.2 MTT比色法分析不同濃度噻可拉林和順鉑單獨使用或聯合使用對c4-1、Hela細胞增殖活性的影響 取對數生長期的c4-1、Hela細胞，調整細胞濃度為1×106ml-1，接種至96孔板，每孔100 μl，分為對照組，順鉑單獨使用(終濃度為0.75、1、2、3、4 μmol/L )組，噻可拉林單獨使用(終濃度為0、2、4、8、10 nmol/L)組，順鉑和噻可拉林聯合使用組共4組，每組每個濃度設4個復孔。繼續培養48 h，終止培養前4 h向每孔中加入40 μl MTT，使MTT的終濃度為1 mg/ml，4 h后結束培養，棄掉上清，向每孔中加入150 μl DMSO，置低速搖床上10 min，酶聯檢測儀測定每孔吸光度OD值(λ=492 nm)。計算細胞增殖活性：增殖活性(%)=實驗組OD/對照組OD×100%。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞增殖周期 取對數期的c4-1、Hela細胞，收集細胞后 1 200 r/min離心10 min，PBS洗1次去除FBS，用無血清的RPMI1640培養基重懸細胞，然后接種至培養瓶中培養24 h后，終止培養，收集細胞，以16%的RPMI1640重懸細胞，調整細胞密度為106ml-1，將細胞接種于6孔培養板，每孔2 ml細胞，實驗組細胞加入最佳濃度的順鉑和噻可拉林(4 μmol/L和10 nmol/L)，對照組細胞加入等量的無血清培養基。參照文獻[10]的方法，流式細胞儀分析細胞周期，資料經Modfit軟件進行分析。

1.2.4 Hoechst 33342和AO-EB染色檢測細胞凋亡 取對數期的c4-1、Hela細胞，消化后接種于已經放入清洗滅菌蓋玻片的6孔板中，接種量為5×104孔-1，待細胞貼壁后，向其中加入對c4-1、Hela細胞增殖影響最佳濃度的順鉑和噻可拉林，繼續培養，每24 h換液一次，換液時再次加入順鉑和噻可拉林，48 h以Hoechst 33342和AO-EB染色試劑盒進行染色，方法參照文獻[11]進行。染色后，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.2.5 Western blot檢測Bax、Bcl2、p53、p21、β-actin蛋白表達量 取對數期的c4-1、Hela細胞，經順鉑和噻可拉林處理后收集細胞，加入細胞裂解液及PMSF，充分裂解后4℃離心機12 000 r/min離心5 min，取上清，BCA法蛋白定量后，加入5×loading buffer，沸水煮10 min后置冰上，然后進行SDS-PAGE，電泳結束后轉膜、洗膜(5 min×3次)、5%BSA封閉，封閉結束后洗膜(5 min×3次)，孵育一抗，4℃冰箱過夜，然后再次洗膜(5 min×3次)，孵育二抗，37℃低速搖床1 h，結束后洗膜(5 min×3次)，ECL法曝光。

1.3 統計學分析 所有數據均采用SPSS20.0軟件進行分析，計量資料采用單因素方差分析，P<0.05為具有顯著的統計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度噻可拉林和順鉑單獨使用或聯合使用對c4-1、Hela細胞增殖活性的影響 結果顯示，隨著噻可拉林和順鉑濃度的增加，噻可拉林和順鉑單獨使用或聯合使用細胞增殖活性與對照組比明顯下降(P<0.05)，而當噻可拉林和順鉑濃度分別小于等于2 nmol/L和1 μmol/L時，聯合使用組與單獨使用組比較，細胞增殖活性未有明顯變化(P>0.05)；當噻可拉林和順鉑濃度分別10 nmol/L和4 μmol/L時聯合使用，其較單獨使用時細胞增殖活性下降更明顯(P<0.05)，見圖1。

2.2 噻可拉林協同順鉑對c4-1、Hela細胞周期的影響 噻可拉林協同順鉑作用c4-1、Hela細胞后，能夠誘導細胞出現G0/G1期停滯(見表1)，結果顯示，加入8 h后開始起作用，48 h最顯著，與單獨使用組相比，差異具有顯著的統計學意義(P<0.05)。

Group8h24h48h72hControl6003±3416115±3195964±3496631±248Thiocoraline(10nmol/L)5237±2166593±2898702±3597204±262Cisplation(4μmol/L)5021±2036452±2618546±3177019±241Combination(10nmol/L：4μmol/L)6952±2831)7919±3151)9597±4291)7927±3311)

Note：Compared with the control group,thiocoraline and cisplatin group，1)P<0.05.

圖1 不同濃度噻可拉林和順鉑單獨使用或聯合使用對c4-1、Hela細胞增殖活性的影響Fig.1 Influence on cell proliferation activity of different concentration of thiocoraline and cisplatin alone or in combination on c4-1 and Hela cellNote:*.P<0.05.

圖2 噻可拉林協同順鉑對c4-1、Hela細胞凋亡的影響Fig.2 Effect of thiocoraline combination with cisplatin on apoptosis of c4-1 and Hela cell

圖3 噻可拉林協同順鉑對c4-1、Hela細胞Bax、p53、p21、Bcl2表達的影響Fig.3 Effect of thiocoraline combination with cisplatin on the expression of Bax，p53，p21，Bcl2 of c4-1 and Hela cellNote: 1.Control;2.Thiocoraline(100 nmol/L);3.Cisplation(4 μmol/L);4.Combination(10 nmol/L： μmol/L).

2.3 噻可拉林協同順鉑對c4-1、Hela細胞凋亡的影響 Hoechst 33342和AO-EB染色顯示，噻可拉林協同順鉑(終濃度為10 nmol/L和4 μmol/L)能夠明顯的誘導c4-1、Hela細胞凋亡(見圖2)，AO-EB染色顯示聯合使用組較單獨使用組可見更多的細胞核呈現固縮狀橘紅色熒光(見圖2)。

2.4 Western blot檢測結果 噻可拉林和順鉑均能夠明顯上調Bax、p53、p21的表達，噻可拉林則能下調Bcl2的表達，而順鉑單獨使用則不影響Bcl2的表達。協同使用時(終濃度為10 nmol/L和4 μmol/L) Bax、p53、p21表達較單獨使用上調更明顯，而Bcl2則較噻可拉林單獨使用無明顯變化(見圖3)。

3 討論

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，它威脅著全球女性的健康，其中80%的病例發生在發展中國家[12]。且隨著人們的兩性生活觀念的轉變，該疾病發病呈現逐年上升和年輕化趨勢。中老年婦女由于其生理機能的退化和機體免疫力的下降，對HPV呈現易感性，因此中老年婦女和育齡婦女仍是高發人群[13]。我國每年新發病例10萬以上，是導致女性死亡的第二大惡性腫瘤[14]。目前宮頸癌的主要治療手段是手術結合術后化療，而化療對患者機體正常功能又具有極大的損傷，因此如何降低化療對患者的副作用成為宮頸癌術后化療未來治療方案中非常重要的一個環節。順鉑是宮頸癌化療中最常用的藥物，特別是轉移性的宮頸癌，而順鉑治療的毒性反應和獲得性耐藥是臨床宮頸癌化療面臨的重要問題[15]。如何在低劑量的順鉑下更有效的殺死腫瘤細胞，抑制腫瘤生長及轉移，成為使用順鉑治療轉移性宮頸癌的策略之一，某些天然的有毒或無毒的具有抗癌特性的化合物將是解決這一問題的有效途徑。

研究表明，噻可拉林是一種來自海洋放線菌Micromonospora marina的具有抗瘤潛能的天然疏水性化合物，它能夠對細胞的周期進行干擾，其主要作用方式是抑制DNA合成酶的活性，對細胞周期進行調控，影響細胞的增殖[9]。最近的研究表明，噻可拉林能夠抑制甲狀腺髓樣癌TT細胞的增殖。本研究觀察到，噻可拉林單獨使用能夠明顯抑制宮頸癌c4-1、Hela細胞的增殖，同時能夠誘導細胞出現凋亡，當其協同順鉑使用時，能夠明顯提高順鉑促進c4-1、Hela細胞凋亡的作用。細胞凋亡被認為是一種細胞主動參與的“自殺”機制，化療藥物被認為是在這一過程中對細胞內的某些靶點進行作用，從而誘導細胞出現“自殺”現象。本研究觀察到的現象表明，噻可拉林可能是協同順鉑作用于c4-1、Hela細胞后，上調了p53的表達，而上調的p53則能夠導致其下游的p21蛋白表達增加的，同時上調的p53還能夠直接對促凋亡分子Bax的表達進行調控。這表明，噻可拉林協同順鉑的這種誘導表達模式導致細胞p53功能的恢復，從而上調p21和Bax，誘導細胞出現凋亡。此外，本研究還觀察到，單獨使用噻可拉林和與順鉑聯合使用時Bcl-2表達下調效應是一樣的，這表明，噻可拉林還能通過作用于凋亡的線粒體通路Bcl-2家族對細胞凋亡進行調控。而噻可拉林是通過何種途徑調控Bcl-2表達、以及協同順鉑調控p53及其下游調控細胞凋亡基因表達仍需要進一步的研究。

綜上所述，盡管噻可拉林是一種疏水性化合物，其在體內半衰期非常短，同時體內還存在p450及其同工酶對其進行降解，但鑒于其在體外能夠通過下調Bcl-2和協同低濃度順鉑恢復p53功能促進宮頸癌c4-1、Hela的凋亡，這為宮頸癌化療降低順鉑使用濃度提供了聯合用藥的基礎。因此，開發能夠轉變噻可拉林疏水性和降低其在體內降解的途徑，將會為臨床降低宮頸癌化療時使用順鉑的毒性反應和化療耐藥提供新的策略。

[1] Wild CP.International agency for research on cancer[J].Encyclopedia Toxicology,2014,22(12):1067-1069.

[2] Agawu A,Buttenheim AM,Taylor L,etal.Sociodemographic differences in human papillomavirus vaccine initiation by adolescent males[J].J Adolesc Health,2015,57(5):506-514.

[3] Schiller JT,Castellsagué X,Villa LL,etal.An update of prophylactic human papillomavirus L1 virus-like particle vaccine clinical trial results[J].Vaccine,2008,19 (26) :53-61.

[4] Bailleux C,Falk AT,Chand-Fouche ME,etal.Concomitant cervical and transperineal parametrial high-dose-rate brachytherapy boost for locally advanced cervical cancer [J].J Contemp Brachyther,2016,8(1):23-31.

[5] Yu H,Gou S,Wang Z,etal.Toward overcoming cisplatin resistance via sterically hindered platinum(II) complexes[J].Eur J Med Chem,2016,27(114):141-152.

[6] He F,Wang Q,Zheng XL,etal.Wogonin potentiates cisplatin-induced cancer cell apoptosis through accumulation of intracellular reactive oxygen species[J].Oncol Rep,2012,28 (2) :601-605.

[7] Wang XT，Govind SP，Shyama PS,etal.Phenethyl isothiocyanate sensitizes human cervical cancer cells to apoptosis induced by cisplatin[J].Mol Nutr Food Res,2011,55 (10) :1572-1581.

[8] Erba E,Bergamaschi D,Ronzoni S,etal.Mode of action of thiocoraline,a natural marine compound with anti-tumour activity[J].Br J Cancer,1999,80(7):971-980.

[9] Romero F,Espliego F,Pérez Baz J,etal.Thiocoraline,a new depsipeptide with antitumor activity produced by a marine micromonospora.I.Taxonomy,fermentation,isolation,and biological activities[J].J Antibiot,1997,50(9):738-741.

[10] Xu T,Pang Q,Zhou D,etal.Proteomic investigation into betulinic acid-induced apoptosis of human cervical cancer HeLa cells[J].PLoS One.2014,22,9(8):e105768.

[11] 張大勇，項曉霞，陳 律，等.不同年齡大鼠血清對骨髓間充質干細胞衰老影響的實驗研究[J].中國細胞生物學學報，2011,33(10):1109-1115.

[12] Dasari S,Wudayagiri R,Valluru L.Cervical cancer: Biomarkers for diagnosis and treatment[J].Clin Chim Acta,2015,20(445):7-11.

[13] 王 靜,許可葵,史百高,等.4374例宮頸癌患者預后及其影響因素分析[J].中國腫瘤,2014,23(4):281-288.

[14] 張 斌,周愛芬,陳 忠,等.武漢市20余萬農村婦女宮頸癌和乳腺癌篩查情況分析[J].中國婦幼保健,2013,28(9):1398-1402.

[15] Cai L,Wang Z,Liu D.Interference with endogenous EZH2 reverses the chemotherapy drug resistance in cervical cancer cells partly by up-regulating Dicer expression[J].Tumour Biol,2016,37(5):6359-6369.

[收稿2016-03-25 修回2016-05-05]

(編輯 許四平)

Mechanism of thiocoraline combination with cisplatin on promoting apoptosis of cervical cancer cell line c4-1 and Hela

DONGHong-Ling,ZHOUPing,YANGWen-Jing.

ObstetricsandGynecology,AffiliatedHospitalofJianghanUniversity,Wuhan430015,China

Objective:To investigate the apoptosis by thiocoraline in combination with cisplatin on cervical cell line c4-1 and Hela and its mechanism.Methods: Different concentrations of thiocoraline and cisplatin alone or in combination used for cultured c4-1 and Hela cells.The inhibition of cell proliferation was detected by MTT assay,and the apoptosis was detected by Hoechst 33342 and AO-EB staining.The expressions of the protein Bax,Bcl2,p53,p21 were detected by Western blot.The cell cycle of c4-1 and Hela cells were detected by Flow cytometry.Results: The cell proliferation activity of c4-1 and HeLa cells were inhibited obviously by different concentrations of thiocoraline and cisplatin alone or in combination.The inhibition effect was in a dose-dependent manner.Meanwhile,when the concentrations of thiocoraline and cisplatin were 10 nmol/L and 4 μmol/L,respectivity the inhibitory effect was most significant (P<0.05);Hoechst 33342 and AO-EB staining showed that the cell apoptosis effect was more obvious on thiocoraline in combination with cisplatin.The Western blot showed that the expressions of the protein Bax,p53,p21 were significantly up-regulated,and the Bcl2 was significantly down-regulated.Conclusion: Thiocoraline combination with cisplatin could up-regulate the expression of the protein Bax,p53,p21 and down-regulation the expression of Bcl2 to inhibition the proliferation and promotion apoptosis of cervical cell line c4-1 and Hela.

Thiocoraline;Cisplatin;Cervical carcinoma;Apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.020

董紅玲(1980年-)，女，主治醫師，主要從事婦科炎癥、宮頸癌及卵巢腫瘤，妊娠合并內科疾病的診斷及治療等方面的研究，E-mail：donghongling2344@163.com。

及指導教師：周 萍(1980年-)，女，主治醫師，主要從事子宮內膜異位癥、婦科腫瘤等方面的研究。

R711

A

1000-484X(2017)01-0099-04

①武漢市婦女兒童醫療保健中心婦產科，武漢430015。