IL-22在類風濕關節炎中的表達及臨床意義①

邵 勤 高洪燕 周小莉 曹春輝

(重慶市中醫院風濕病科，重慶400021)

IL-22在類風濕關節炎中的表達及臨床意義①

邵 勤 高洪燕 周小莉 曹春輝

(重慶市中醫院風濕病科，重慶400021)

關節炎，類風濕；白細胞介素22；疾病活動性；骨侵蝕

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的慢性自身免疫病，該病的病因和發病機制尚不明確，目前共識其發生和發展是一個免疫介導事件。CD4+T細胞活化和分化，介導免疫應答，刺激B細胞產生抗體，同時產生細胞因子發生鏈級反應，活化滑膜、骨、軟骨多種組織細胞產生效應分子，引起以組織破壞為主要特征的慢性炎癥[1]。但這一免疫事件的啟動刺激因子不明確，參與的T細胞及細胞因子形成復雜的網絡，相互作用，骨與軟骨破壞的確切機制不清楚。輔助性T細胞22(Th22)是新發現的一類CD4+T細胞，其功能主要通過分泌細胞因子IL-22實現。新近報道Th22細胞可能與RA發病相關，但其在RA病理生理中的作用尚不明確[2]。IL-22是RA疾病過程中關鍵性的細胞因子之一，但其在RA的發病機理中究竟起什么作用存在爭議。本研究通過檢測RA患者外周血及關節滑液中Th22細胞比例及IL-22水平，探討Th22/IL-22在RA發病中的作用及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象 選取2015年7月至2016年8月我院治療的RA患者50例，符合1987年ACR或2010年ACR/EULAR對RA的分類標準。其中女性34例，男性16例，年齡20～78歲，平均(51±18)歲，病程2月～39年，平均(8±6)年。DAS28評分1.84～7.30，平均(4.41±2.10)分。隨機選取年齡和性別相匹配的骨關節炎患者15例和體檢中心健康者15例作為對照組。OA組及健康對照組與RA組在性別、年齡構成等方面差異無統計學意義。根據RF檢測將RA患者分為RF陽性RA(40例)和RF陰性RA(10例)。根據抗CCP抗體檢測將RA患者分為抗CCP陽性RA(38例)和抗CCP陰性RA(12例)。RA患者根據關節X線檢查改變分為四期。50例RA患者中12例有關節積液者抽取關節滑液并分析。本研究通過本院倫理委員會批準，并獲得入選對象知情同意，簽署知情同意書。

1.1.2 主要試劑及儀器 FITC 標記的人CD4 抗體，PerCD標記的人IL-22抗體，APC標記的人IL-17抗體，PE標記的人IFN-γ抗體及相應抗體同型對照購自eBioscience公司；佛波酯(PMA)、離子霉素(Ionomycin)、布雷非德菌素A(BFA)、FIX&PERM Kit試劑盒購自MultiSciences公司；Ficoll人淋巴細胞分離液購自TBDscience公司；SepMateTM離心管購自STEMCELL Technologies公司；RPMI1640培養基購自Hyclone公司；胎牛血清購自江蘇MRC公司；人IL-22 ELISA Kit購自PeproTech公司。流式細胞儀為美國BD Accuri C6型；酶標儀為美國伯騰公司Synergy HTX型。

1.2 方法

1.2.1 流式細胞儀檢測外周血及關節滑液Th22 所有受試者抽取清晨空腹靜脈血5 ml，1×PBS稀釋后加入SepMateTM離心管的Ficoll人淋巴細胞分離液中，3 000 r/min離心30 mim，分離獲得PBMCs。RPMI1640培養基重懸PBMCs，細胞懸液加入PMA(50 ng/ml)、離子霉素(1 μg/ml)、BFA(2 μg/ml)，37℃ 5%CO2培養箱培養4 h。收集細胞，加入5 μl FITC標記的抗人CD4，對照管加入5 μl同型對照抗體，震蕩混合均勻，室溫避光染色15 min。加入Medium A 100 μl固定細胞，混勻避光孵育15 min。PBS洗滌后加入100 μl Medium B和5 μl PerCP標記的抗人IL-22抗體，5 μl APC標記的人IL-17抗體，2 μl PE標記的人IFN-γ抗體，相應同型對照抗體加至同型對照管，避光孵育20 min。PBS洗滌后制成細胞懸液，轉移至流式管，上機檢測。12例RA患者抽取關節滑液10 ml，同以上步驟檢測Th22細胞比例。

1.2.2 ELISA檢測血清及關節滑液IL-22 入選對象抽取靜脈血離心后收集血清，12例關節腔積液的RA患者抽取關節滑液10 ml，離心收集上清液，按照試劑盒要求步驟用ELISA法檢測IL-22濃度。

1.2.3 收集整理RA患者臨床資料及檢查指標 記錄RA患者性別、年齡、病程、腫脹及壓痛關節數、疼痛評分、關節外癥狀，檢測ESR、CRP、RF、抗CCP抗體等實驗室指標，計算DAS28評分。根據X線改變分為四期：Ⅰ期無骨質破壞，可見骨質疏松；Ⅱ期顯示骨質疏松，可有輕度軟骨破壞或軟骨下骨質破壞，無關節畸形；Ⅲ期骨質疏松伴軟骨或骨破壞，有關節畸形，無纖維性或骨性強直；Ⅳ期纖維性或骨性強直。

2 結果

2.1 Th22細胞比例和IL-22水平在各組外周血的表達 RA患者外周血Th22細胞比例高于OA組(t=2.290，P=0.021)及健康對照組(t=2.524，P=0.015)，差異有統計學意義。RA患者血清IL-22水平高于OA組(t=2.560，P=0.014)及健康對照組(t=2.768，P=0.009)，差異有統計學意義。見表1。

表1 各組外周血Th22細胞比例及IL-22表達水平比較

Tab.1 Proportion of Th22 and level of IL-22 in peripheral blood in different groups

GroupsnTh22(%)IL?22(ng/L)RApatients50198±0711)2)53746±83271)2)OApatients15121±05237918±5687Healthycontrol15118±04534638±5231

Note：1)P<0.05 vs OA patients;2)P<0.05 vs healthy controls.

表2 RA組血清IL-22水平與RF、抗CCP抗體、關節積液的相關性

Tab.2 Correlation between level of IL-22 and RF,anti-CCP,SF in RA patients

RF(+)(-)anti?CCP(+)(-)SF(+)(-)n401038121238IL?2(ng/L)54875±842639748±421656078±959038638±685260025±765341256±5780t232225042587P003500150012

表3 RA組血清IL-22及實驗室指標相關性分析

Tab.3 Correlation analysis of IL-22 and laboratory indexes in RA patients

ESRCRPRFDAS28r0312016303140332P0036024200320021

表4 IL-22及Th22在RA外周血及關節滑液中的表達

Tab.4 Expression of IL-22 and Th22 in peripheral blood and SF of RA patients

Th22(%)IL?22(ng/L)Peripheralblood198±07153746±8327Synovialfluid167±05172579±8645t11982668P02850011

2.2 RA患者血清IL-22與RF、抗CCP抗體的關系 RF陽性RA血清IL-22水平高于RF陰性RA(t=2.322，P=0.035)。抗CCP抗體陽性RA血清IL-22水平高于抗CCP抗體陰性RA(t=2.504，P=0.015)。見表2。

2.3 RA血清IL-22與炎性指標及疾病活動度的關系 RA血清IL-22水平與ESR、RF、DAS28評分呈正相關關系(P<0.05)，與CRP無明顯相關性(P>0.05)。見表3。

2.5 有關節積液RA患者IL-22及Th22細胞的表達 有關節積液RA患者(12例)血清IL-22水平高于無關節積液RA患者(38例)(t=2.587，P=0.012)，差異有統計學意義。見表2。關節滑液與外周血中Th22細胞比例無統計學差異(t=1.198，P=0.285)。關節滑液IL-22水平高于血清(t=2.668，P=0.011)，與關節滑液Th22細胞比例無相關性(r=0.287，P=0.065)。見表4。

3 討論

IL-22是2000年Renauld小組首次發現的新型細胞因子。IL-22屬IL-10細胞因子家族成員，由多種免疫細胞Th1、Th22、Th17等產生。IL-22受體復合物是IL-10R2和IL-22R1構成的異源雙鏈二聚體， IL-22R1與IL-22親和力低，決定了與IL-22結合的特異性。IL-22與IL-22R結合后，誘導細胞內一些信號轉導級聯途徑活化，包括JAK/STAT信號通路和MAPK/ERK信號通路(MKKS→ERK1/2、JNK/SAPK、p38)，引起特定基因表達，從而參與細胞增生、分化、遷移和凋亡[3]。IL-22是Th22細胞的主要效應因子，目前有關Th22細胞生物學功能研究主要基于對IL-22的認識。新近報道有研究者提出Th22細胞參與RA發病，IL-22可作為RA治療靶點[4]。

幾項人體實驗研究發現，活動性RA患者外周血IL-22水平顯著高于健康對照人群[5]。本研究亦證實RA患者外周血中Th22細胞比例及IL-22水平增高，高于OA患者及健康對照組，從細胞因子表達水平來分析，IL-22與RA有相關性。目前認為IL-22是RA疾病過程中關鍵性細胞因子之一，但其在RA的發病機理中究竟起什么作用存在爭議。大多數學者認為IL-22是一種促炎因子。動物實驗中發現C57BL/6小鼠膠原誘導性關節炎(Collagen induced arthritis,CIA)模型血清及滑膜組織中檢測到高水平的IL-22和IL-22R1；較之野生型小鼠，IL-22基因敲除小鼠CIA發生率低、關節損傷程度輕、血管翳形成少，據此推測IL-22參與CIA致病過程[6,7]。在抗原誘導小鼠關節炎(AIA)發病起始階段，IL-22通過激發IL-1Β產生促炎作用。抗IL-22抗體和IL-22基因敲除可使小鼠關節炎癥反應減輕[8]。但也有報道在關節炎的發病過程中，IL-22/IL-22R表達增加。CIA體外實驗中，IL-22同時誘導促炎因子和抗炎因子產生。IL-22對早期關節炎有保護作用，機制與增加IL-10水平有關。提示IL-22在炎性關節炎中具有保護及致病雙重作用，取決于疾病發展的不同階段[9]。

臨床上RA的早期診斷及準確的疾病活動度評估對該病的診療及預后均有重大意義。目前臨床上評價RA疾病活動度需要綜合諸多因素來判斷，如DAS28評分、晨僵時間、疼痛及CRP、ESR、RF等，但存在相關指標測定復雜、影響因素多等缺點。近年來，炎癥指標的客觀評價受到重視，如找到更加敏感和特異的炎癥指標則能更好地服務臨床。RF與抗CCP抗體作為RA特征性自身抗體，對RA的早期診斷有非常重要的意義，而且與病情活動及預后均有關。血清持續高滴度RF是RA關節破壞及預后不良的因素，抗CCP抗體與RA病情嚴重程度及治療效果差異相關[10]。本研究發現RA外周血IL-22水平與RF及抗CCP抗體有一定相關性，體現在RF陽性RA患者IL-22水平高于RF陰性RA，抗CCP抗體陽性RA患者IL-22水平高于抗CCP抗體陰性RA。而且IL-22水平與DAS28評分、RF、ESR實驗室指標呈正相關，提示IL-22水平與疾病活動性呈正相關，在一定程度上反映了疾病活動度高低。相似的臨床實驗觀察及結果亦見報道[11,12]。由此推斷IL-22有可能成為RA疾病活動性評估的新的炎癥指標，對疾病早期診斷、病情評估及預后判斷均有幫助。

RA以滑膜炎及骨關節軟骨侵蝕為主要特征，骨關節的破壞畸形及功能喪失是RA最為嚴重的不良預后。細胞因子在T細胞活化、遷移致使關節損傷中起關鍵作用。成纖維樣滑膜細胞(Fibroblast-like synoviocyte,FLS)通過產生細胞因子、趨化因子和MMP-1等促進滑膜炎癥持續性和慢性化并導致骨質破壞，在RA滑膜炎的發病機制中發揮關鍵作用。FLS高表達IL-22和IL-22R1，活化FLS呈時間和劑量依賴性產生IL-6，介導炎癥反應[13]。體外實驗中發現IL-22促進破骨細胞增殖，提示IL-22與骨質破壞相關。Leipe等[14]檢測早期RA患者血清IL-22水平，并追蹤觀察2年，監測臨床癥狀及影像學改變，經多元回歸分析表明IL-22升高是RA骨侵蝕的獨立、有顯著意義的相關因素。Kim等[15]研究發現IL-22能上調RA患者RASF中RANKL(Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)的表達，進而激活p38、MAPK/NF-κB與JAK-2/STAT-3信號來促進破骨細胞形成。IL-22抗體可減輕關節炎癥及骨質破壞[16]。本研究發現RA血清IL-22與關節骨破壞X線分期有相關性，即關節破壞越嚴重，IL-22血清水平越高，表明IL-22參與介導RA骨質破壞進程。其臨床意義在于血清高IL-22水平對于骨質破壞有預警作用，IL-22可能成為預測骨破壞的指標。

關節積液為急性或亞急性關節滲出性炎癥所致，常出現在RA患者炎癥活動期，表現為關節的腫脹壓痛及活動受限。關節積液的發生多提示RA疾病活動度高。本研究發現有關節積液的RA患者血清及關節滑液IL-22水平較無關節積液者高，從另一方面驗證了IL-22水平與疾病活動性相關，可作為RA疾病活動性評估的炎癥指標，這與上述的IL-22與ESR、RF、DAS28評分及疾病活動度的正相關性結論是一致的。本研究同時發現關節滑液IL-22水平高于血清，且與關節滑液Th22細胞比例無相關性。這一結果提示關節滑膜作為RA主要和特征性的病變部位，亦是免疫反應的主要場所，局部的免疫細胞和細胞因子高濃度聚集。已有相關報道RA滑液IL-22水平高于OA[17]。同時也說明了免疫反應的復雜性。Th22細胞分泌的IL-22占體內IL-22總量的65%。IL-22水平與Th22細胞呈正相關。但IL-22除Th22細胞外，還可由多種免疫細胞(Th1、Th17、NK、γδT)和淋巴結組織誘導細胞(Lymphoid tissue inducer，LTi)、LTi樣細胞產生[18]。Th17細胞除分泌IL-22外，更主要的是分泌IL-17、IL-21。Th17細胞及其分泌的細胞因子在RA中的作用已有較多報道[19]。IL-22參與Th17細胞的效應功能，IL-22與IL-17協同作用，可以增強炎癥反應并造成組織損傷，IL-17與IL-22共同表達被認為是自身攻擊性T細胞和促炎T細胞的標志。相關文獻研究證實NK-22細胞分泌的高濃度IL-22參與RA發生和發展過程。RA患者關節囊滑液和外周血NK-22細胞比例均明顯升高，分泌高濃度IL-22促進RA滑膜成纖維細胞增殖[20]。由此推斷，RA關節滑液中高濃度的IL-22由多種活化的免疫細胞產生，它們共同參與免疫反應，構成復雜的網絡系統發揮作用。

綜上所述，Th22細胞與IL-22參與RA發病機制，阻斷IL-22/IL-22R作用環節是RA可能的免疫靶向治療途徑。鑒于IL-22與疾病活動性的相關性，IL-22水平有可能成為RA疾病活動度評估的新指標。同樣道理，由于IL-22在RA影像學進展中起作用，可成為RA骨侵蝕的血清學標志。這可能是IL-22在下階段最為實際的臨床診斷方面的意義。

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[收稿2016-09-07]

(編輯 倪 鵬)

Expression and clinical significance of interleukin-22 in patients with rheumatoid arthritis

SHAOQin,GAOHong-Yan,ZHOUXiao-Li,CAOChun-Hui.

DepartmentofRheumatology,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400021,China

Arthritis,rheumatoid;Interleukin-22;Disease activity;Bone erosion

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.021

邵 勤(1977年-)，女，碩士，主治醫師，主要從事風濕病方面研究，E-mail：qinshao2011@126.com。

R593.22

A

1000-484X(2017)01-0103-05

①本文為重慶市衛計委醫學科研項目(2015MSXM080)。