水稻糙米重金屬鎘(Cd2+)含量的QTL定位分析

郭小蛟，楊 莉,*，張 濤,，蔣開(kāi)鋒,，楊乾華，游書(shū)梅，曹應(yīng)江，李昭祥，羅 婧，高 磊，萬(wàn)先齊，鄭家奎,(.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所/農(nóng)業(yè)部西南水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 德陽(yáng) 68000；.國(guó)家水稻改良中心瀘州分中心，四川 瀘州 64600)

水稻糙米重金屬鎘(Cd2+)含量的QTL定位分析

郭小蛟1，楊 莉1,2*，張 濤1,2，蔣開(kāi)鋒1,2，楊乾華1，游書(shū)梅1，曹應(yīng)江1，李昭祥1，羅 婧1，高 磊1，萬(wàn)先齊2，鄭家奎1,2

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所/農(nóng)業(yè)部西南水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 德陽(yáng) 618000；2.國(guó)家水稻改良中心瀘州分中心，四川 瀘州 646100)

本研究利用日本晴與瀘恢99構(gòu)建的188個(gè)重組自交系群體，根據(jù)已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜，采用混合線(xiàn)性模型方法，在高鎘含量環(huán)境A和低鎘含量環(huán)境B進(jìn)行糙米Cd2+含量的QTL定位分析。在A環(huán)境中檢測(cè)到2個(gè)控制糙米Cd2+含量的QTLs，分別位于第7、8染色體，貢獻(xiàn)率分別為29.8%、8.87%；在B環(huán)境中檢測(cè)到1個(gè)控制糙米Cd2+含量的QTL，位于第7染色體，貢獻(xiàn)率為7.35%；A、B兩個(gè)環(huán)境下的增效基因均來(lái)自于親本瀘恢99。試驗(yàn)表明：鎘濃度對(duì)該基因的表達(dá)有影響，糙米Cd2+含量QTL基因更易在Cd2+高濃度環(huán)境中表達(dá)，因此，Cd2+低吸收水稻材料創(chuàng)制及選育應(yīng)在Cd2+含量較高的土壤中進(jìn)行。

水稻；糙米Cd2+含量；QTL定位

水稻(Oryzasativa)是世界上最主要的糧食作物，有50%以上的人口以稻米為主食。近年來(lái)，隨著工業(yè)“三廢”排放量的增加，各種化學(xué)產(chǎn)品、農(nóng)藥、化肥的廣泛無(wú)節(jié)制使用，使農(nóng)田土壤中有毒重金屬含量急劇增加，我國(guó)面臨的土壤環(huán)境及糧食安全問(wèn)題日益突出。中國(guó)水稻研究所與農(nóng)業(yè)部2010年的研究稱(chēng)，全國(guó)受到鎘污染的耕地涉及11個(gè)省份25個(gè)地區(qū)。在湖南、江西等長(zhǎng)江以南地帶，這一問(wèn)題更加突出。南京農(nóng)大潘根興團(tuán)隊(duì)在全國(guó)多個(gè)縣級(jí)以上市場(chǎng)隨機(jī)采購(gòu)樣品，結(jié)果表明，10%左右的市售大米鎘超標(biāo)。2008年以來(lái)，相繼出現(xiàn)了湖南、廣州等地“鎘大米”事件，在社會(huì)上引起了強(qiáng)烈反響。重金屬污染特別是Cd2+污染已嚴(yán)重危及食物安全，因此引起世界各國(guó)的廣泛重視。大量研究表明,不同水稻品種由于遺傳上的差異，在對(duì)稻田重金屬元素的吸收和分配上存在很大差異，這種差異不僅存在于種間(不同種和屬)，而且在種內(nèi)(不同變種或品種)也存在[1、2、3、4、5、6、7、8]。針對(duì)重金屬污染土壤的治理方法，國(guó)內(nèi)外學(xué)者作了大量研究，取得了一系列的成功技術(shù)，但這些方法在有效性、持久性及經(jīng)濟(jì)性方面難以達(dá)到預(yù)期效果。日本岡山大學(xué)教授馬建鋒等[9]研究發(fā)現(xiàn)，種植不含Nramp5基因的水稻，可以有效地解決水稻中Cd2+富集的問(wèn)題，但是卻破壞了攝取錳元素的能力，導(dǎo)致產(chǎn)量比正常水稻降低了近90%，這在生產(chǎn)上顯然是不能接受的。而通過(guò)品種選擇，將作物食用部位的重金屬濃度控制在允許范圍被認(rèn)為是治理污染的有效途徑，并在向日葵(Helianthus annuus)和硬質(zhì)小麥上成功應(yīng)用[10、11、12]，這為該方面的深入研究奠定了基礎(chǔ)。因此，針對(duì)土壤重金屬污染，開(kāi)展作物耐重金屬污染基因的發(fā)掘、分子標(biāo)記及利用研究，開(kāi)展作物耐重金屬污染品種的篩選、鑒定和選育研究，必將是有效、持久和經(jīng)濟(jì)的重金屬污染土壤治理策略的發(fā)展趨勢(shì)。近年來(lái)，有關(guān)糙米中Cd2+含量的QTL定位研究也取得了一定的進(jìn)展[13、14、15]，但總的來(lái)說(shuō)定位的QTL還很少，且貢獻(xiàn)率均不大，還不足以用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。本研究將利用日本晴×瀘恢99構(gòu)建的RIL群體分析控制糙米中Cd2+含量的QTL，旨在發(fā)掘更多有利基因，為分子標(biāo)記輔助選擇Cd2+低吸收品種提供一定的理論和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以測(cè)序品種日本晴(粳稻)為母本，與我所選育的恢復(fù)系瀘恢99(秈稻)雜交，F(xiàn)2代始經(jīng)單粒傳法獲得369個(gè)株系的F8代重組自交系群體(Recombinant inbred lines，RIL)，選取188個(gè)株系為試驗(yàn)材料。

1.2 田間試驗(yàn)與表型分析

2012年夏季，選取2個(gè)土壤Cd2+含量不同的田塊進(jìn)行了試驗(yàn)，其中A環(huán)境土壤Cd2+含量為1.45mg/kg，B環(huán)境土壤Cd2+含量為0.15mg/kg(國(guó)家規(guī)定，pH值≤7.5土壤安全標(biāo)準(zhǔn)為0.3mg/kg，pH值 ≥7.5時(shí)為0.6mg/kg，大米中的安全鎘含量為0.2mg/kg)。2個(gè)親本及188個(gè)株系于4月1日播種，5月8日移栽。每個(gè)株系種植4行，每行10株，株行距16.67cm×26.67cm，兩環(huán)境田間肥水管理、病蟲(chóng)害防治同常規(guī)大田管理。

正季稻成熟時(shí)，收取2、3行各5株種子，自然風(fēng)干后儲(chǔ)存3個(gè)月，送四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測(cè)試中心，采用GB/T5009.15-2003方法檢測(cè)糙米中的Cd2+含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析和QTL定位

用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行表型數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。根據(jù)已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜(趙建國(guó)，2013)[16]，利用基于混合線(xiàn)性模型[17]的QTL Network2.0[18]軟件進(jìn)行QTL分析。以P = 0.005為統(tǒng)計(jì)檢測(cè)閾值, 即當(dāng)標(biāo)記的P 值小于統(tǒng)計(jì)檢測(cè)閾值時(shí), 認(rèn)為該標(biāo)記處存在1個(gè)QTL；最后將檢測(cè)到的所有QTL 以及它們之間的上位性互作以及與環(huán)境的互作整合到一個(gè)全QTL 模型中, 用基于Gibbs 抽樣的Bayesian 方法估計(jì)遺傳效應(yīng)。QTL的命名參照McCouch[19]水稻QTL命名方法。

2 結(jié)果分析

2.1 親本及群體表型

在2個(gè)不同Cd2+含量的土壤環(huán)境下(表1)，雙親糙米Cd2+含量性狀差異均達(dá)極顯著水平，其中秈稻瀘恢99糙米Cd2+含量明顯比粳稻日本晴高。A環(huán)境下，糙米Cd2+含量性狀在RIL群體中表現(xiàn)為連續(xù)變異，株系間變異幅度很大，變異范圍在0.18～5.54mg/kg之間，差異明顯。大多數(shù)株系性狀值居于雙親中間，部分株系呈超親優(yōu)勢(shì)，個(gè)別株系甚至比土壤背景值高出幾倍，糙米Cd2+含量性狀表現(xiàn)正態(tài)分布(圖1)，表明糙米Cd2+含量是受多基因控制的數(shù)量性狀。B環(huán)境中性狀亦呈連續(xù)變異，株系間的變異范圍為0.0039～0.27mg/kg，幅度變較大，但大多數(shù)株系糙米Cd2+含量很低，大約60%的株系Cd2+含量集中在0.0039～0.037mg/kg之間，株系間差異不明顯，性狀表現(xiàn)出一定的偏分離，不符合正態(tài)分布，這可能與B環(huán)境土壤Cd2+含量低有關(guān)。從本試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，土壤背景值對(duì)水稻籽粒Cd2+含量這一性狀的表達(dá)有影響，Cd2+含量高的土壤背景下更有利于鑒別株系間的性狀差異。

表1 雙親及群體在兩種環(huán)境下的性狀表現(xiàn)值

圖1 A環(huán)境188個(gè)家系糙米Cd2+含量的正態(tài)分布圖

2.2 QTL定位分析

根據(jù)已構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜[16]，該圖譜包含有覆蓋水稻全基因組12條染色體的207個(gè)DNA分子標(biāo)記。其中SSR標(biāo)記136個(gè)，STS標(biāo)記24個(gè)，Indel標(biāo)記47個(gè)。連鎖圖譜全長(zhǎng)為2397cM，標(biāo)記間平均距離為12.29cM。在A環(huán)境中檢測(cè)到2個(gè)糙米Cd2+含量的QTL，即位于第7、8染色體上的qCCBR-7-1和qCCBR-8，均表現(xiàn)出增效作用，增效基因均來(lái)自瀘恢99。貢獻(xiàn)率分別為29.8%和8.87%，加性效應(yīng)分別為-0.4943和-0.2154。同時(shí)還檢測(cè)到qCCBR-7-1和qCCBR-8之間存在上位性互作，但效應(yīng)值較低僅為2.37%。B環(huán)境中檢測(cè)到1個(gè)QTL，qCCBR-7-2位于第7染色體SSR標(biāo)記RM214與RM11之間，與A環(huán)境中檢測(cè)到qCCBR-7-1位置相近(圖2)，貢獻(xiàn)率為7.35%，增效基因來(lái)自于親本瀘恢99。

3 討論

3.1 QTL定位結(jié)果比較

數(shù)量性狀易受環(huán)境影響，同一數(shù)量性狀的QTL在不同定位群體、不同環(huán)境及不同年份等QTL檢測(cè)結(jié)果均會(huì)有所不同。Ishikawa等[13]利用含39個(gè)片段代換系的圖譜檢測(cè)到位于第3、6、8染色體上的3個(gè)控制糙米中Cd2+含量的QTLs。沈希宏等[14]利用協(xié)青早B×中恢9308構(gòu)建的RIL群體在不同的土壤環(huán)境下分別檢測(cè)到2個(gè)、1個(gè)控制糙米中Cd2+含量的QTLs，分別位于第5、7和11染色體上，貢獻(xiàn)均在9%左右。陳志德[15]利用韭菜青×IR26的重組自交系群體(RIL),在5 mg/kg Cd2+脅迫下進(jìn)行糙米Cd2+濃度的QTL定位，在第11染色體上檢測(cè)到2個(gè)控制糙米Cd2+濃度的QTL。本研究利用日本晴與R99的RIL群體，在土壤Cd2+濃度較高的A環(huán)境中在第7和第8染色體上各檢測(cè)到了1個(gè)QTL，B環(huán)境中第7染色體上檢測(cè)到1個(gè)QTL。與前人的研究比較發(fā)現(xiàn)，是3個(gè)新的糙米Cd2+含量QTL位點(diǎn)。位于第7染色體的2個(gè)QTL在物理位置上比較近，qCCBR-7-1(鎘較高濃度)的貢獻(xiàn)率較大29.8%，沈希宏等[14]在第7染色體上也定位了1個(gè)控制糙米Cd2+含量QTL位點(diǎn)，可能該區(qū)域是控制糙米Cd含量的基因區(qū)域。而qCCBR-7-2(低濃度)貢獻(xiàn)率小，可能是因?yàn)椴诿證d含量QTL基因在土壤低Cd濃度下不易表達(dá)。因此，在此研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步開(kāi)展qCBBR-7-1基因的精細(xì)定位和克隆研究，開(kāi)展水稻與Cd2+的分子生物學(xué)研究，探明控制水稻糙米Cd含量基因的遺傳、分子和生理生化機(jī)制，發(fā)掘更多有利基因，最終利用分子標(biāo)記輔助選擇或轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良雜交水稻不育系和恢復(fù)系親本，選育水稻籽粒Cd2+低吸收品種，對(duì)于解決我國(guó)面臨的糧食生產(chǎn)安全問(wèn)題具有理論和技術(shù)指導(dǎo)意義。

表2 QTL定位結(jié)果及遺傳參數(shù)估算

圖2 控制糙米中Cd2+含量的QTL圖譜(▲環(huán)境A ●環(huán)境B)

3.2 性狀與環(huán)境的相關(guān)性

沈希宏等[14]在不同Cd2+污染程度土壤中，檢測(cè)到了顯著的QTL與環(huán)境互作效應(yīng)，說(shuō)明環(huán)境對(duì)基因表達(dá)有顯著影響。本實(shí)驗(yàn)中，環(huán)境A和環(huán)境B土壤Cd2+濃度分別為1.45 mg/kg和0.15mg/kg。A環(huán)境中出現(xiàn)了比親本高數(shù)倍的株系，株系間的性狀差異明顯，而在B環(huán)境中株系間差異不如A環(huán)境顯著，尤其是吸收量低的株系所占比例較大,這很可能與B環(huán)境的土壤Cd2+濃度較低導(dǎo)致了糙米Cd2+含量QTL基因不易表達(dá)有關(guān)。從本研究結(jié)果看，土壤Cd2+濃度高更有利于Cd2+含量QTL基因的表達(dá)。楊莉[8]曾利用不完全雙列雜交材料在較高鎘環(huán)境下研究了鎘的遺傳效應(yīng)，結(jié)果表明，籽粒低Cd2+雜交稻組合的選育，雙親的遺傳改良和組合的評(píng)價(jià)篩選都很重要，不育系改良的效果比恢復(fù)系好。因此，Cd2+低吸收材料(品種)的鑒定及選育最好選擇在Cd2+含量較高的環(huán)境中進(jìn)行。

4 結(jié)論

(1)發(fā)現(xiàn)3個(gè)新的糙米Cd2+含量QTL位點(diǎn)，其中第7染色體的2個(gè)QTL在物理位置上比較近，qCCBR-7-1(鎘較高濃度)的貢獻(xiàn)率較大29.8%，值得做進(jìn)一步研究。第7染色體上可能存在一個(gè)Cd2+含量基因區(qū)域。

(2)土壤Cd2+濃度高更有利于Cd2+含量QTL基因的表達(dá)，因此Cd2+低吸收材料(品種)的鑒定及選育最好選擇在Cd2+含量較高的環(huán)境中進(jìn)行。

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2016-11-19

四川省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2015SZ0048)、四川省財(cái)政現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與示范項(xiàng)目。

郭小蛟(1988-)，女，研究實(shí)習(xí)員，碩士，專(zhuān)業(yè)方向?yàn)樗具z傳育種。E-mail：gxiaojiao@163.com。*為通訊作者。