益脾養肝方對大鼠肝癌癌前病變組織PCNA、GGT蛋白表達的影響 *

劉亞珠，李京濤△，魏海梁，閆曙光，何 超，陳曉婷， 常占杰

1.陜西中醫藥大學附屬醫院(咸陽712000),2.陜西中醫藥大學( 咸陽712000)

益脾養肝方對大鼠肝癌癌前病變組織PCNA、GGT蛋白表達的影響*

劉亞珠1，李京濤1△，魏海梁1，閆曙光2，何 超2，陳曉婷2， 常占杰1

1.陜西中醫藥大學附屬醫院(咸陽712000),2.陜西中醫藥大學( 咸陽712000)

目的：研究益脾養肝方對二乙基亞硝胺(DEN)誘導的大鼠肝癌癌前病變病理組織和PCNA、GGT蛋白表達的影響。方法：將大鼠隨機分成空白組、模型組、益脾養肝方大、小劑量組。采用腹腔注射DEN誘發大鼠肝癌前病變模型，給藥16周后處死。觀察大鼠一般情況和體重，肝功變化，肝組織HE染色以及免疫組化檢測PCNA和GGT蛋白表達。結果：與模型組比較，養脾益肝方大、小劑量組的ALT、 AST、GGT和ALP均明顯降低，其中YPYGF大劑量組效果最佳(P<0.01)。病理組織結果顯示，益脾養肝方可以改善大鼠肝癌癌前病變的病理形態，能顯著抑制肝組織PCNA和GGT的蛋白表達。結論：益脾養肝方對于大鼠肝癌癌前病變具有抑制作用，其作用可能與抗細胞異常增殖和抗細胞氧化損傷有關。

肝癌前病變是具有細胞不典型性和分化異常的增生性病變，介于正常組織和癌組織之間，如能阻止肝癌癌前病變的惡性進展，就有可能阻止或延緩肝癌的發生發展。益脾養肝方是陜西省名中醫常占杰教授治療肝硬化進展的驗方[1-2]，長期臨床隨訪提示該方可能具有抗肝癌癌前病變的作用。研究表明PCNA和GGT蛋白的表達與肝癌細胞增殖和肝細胞氧化損傷有密切聯系[3-4]。本實驗采用二乙基亞硝胺(DEN)誘導大鼠肝癌癌前病變模型，觀察益脾養肝方對大鼠肝癌癌前病變組織病理和PCNA、GGT蛋白表達的影響，為益脾養肝方抗肝癌癌前病變提供實驗依據。

材料與方法

1 藥品與主要試劑 DEN(0.95 g/ml)購于美國Sigma公司，PCNA、GGT試劑盒購買于陜西博達生物有限公司。DAB染色液、免疫組化染色試劑盒購于武漢博士德生物技術有限公司。

2 益脾養肝方的制備 益脾養肝方藥(黨參、白術、熟地、枸杞、姜黃、鱉甲、郁金、半枝蓮、白花蛇舌草)，均由陜西中醫藥大學附屬醫院藥劑科統一購買和制備凍干粉，每克含生藥5 g，凍干粉密封保存于4℃冰箱內備用，使用時100℃水溶解，配置為小劑量0.5 g/ml和大劑量1.0 g/ml的藥液。

3 動物造模 清潔級wistar大鼠70只，雄性，體重(100～120)g，購于西安交通大學實驗動物中心。大鼠肝癌癌前病變模型制備[5]：大鼠適應性飼養3 d后進入實驗，模型組和給藥組均以0.5 ml/100g的DEN腹腔注射，每周50 mg/kg(分2次給，即每84 h 1次)，連續給藥16周；對照組給予等量無菌蒸餾水。

4 分組以及給藥方法 將70只大鼠隨機分為4組：空白組10只、模型組和益脾養肝方(YPYGF)大、小劑量組各20只/組。造模當日起，對YPYGF大、小組大鼠灌胃給予相應劑量藥物：YPYGF小劑量(0.5g/ml)按10 ml/kg大鼠體重灌胃，1次/d。YPYGF大劑量(1.0 g/ml)按10ml/kg大鼠體重灌胃，1次/d。空白組、模型組大鼠同步灌胃等量無菌蒸餾水，直至16周末停藥。

5 動物處理 于第16周處死大鼠。采用10%水合氯醛(0.3 ml/l00g)腹腔注射給藥麻醉，待大鼠完全麻醉時，剪去腹毛，剖開腹腔，分離整個肝臟，拍照留取肝臟大體形態圖。分別切取肝右葉、肝左葉、尾葉適當大小肝組織，于10%甲醛溶液常規固定。

6 肝組織HE染色和 PCNA及GGT蛋白表達 肝組織常規HE染色。肝組織于10%中性甲醛液固定24 h，梯度酒精脫水，石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟脫水，3%H2O2室溫孵育5～10 min，蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min×2，5%～10%山羊血清封閉，室溫孵育10 min，一抗4℃過2夜，二抗37℃孵30～60 min，滴加適量SABC，37℃孵育10～30 min，顯色劑顯色3～15 min，沖洗、復染、脫水、透明、封片后顯微鏡下觀察。

7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件，組間比較采用t檢驗和單因素方差分析，P<0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 一般情況和體重 空白組大鼠背毛光澤順滑，活動和進食水均正常，無死亡。模型組、YPYGF大、小劑量組從實驗第8周后，大鼠進食水量均減少，模型組死亡2只，YPYGF大、小劑量組各死亡1只。實驗結束時各組大鼠體重有顯著差異，體重順序依次為空白組>YPYGF大劑量組>YPYGF小劑量組>模型組。

2 肝功能檢測結果 益脾養肝方對肝癌癌前病變大鼠的肝功影響結果見表1。與空白組比較，各組大鼠的 ALT、 AST、GGT和ALP均明顯升高。與模型組比較，YPYGF大、小劑量組的ALT、 AST、GGT和ALP均明顯降低，其中YPYGF大劑量組效果最佳。經統計學分析，YPYGF大劑量組與模型組比較均有顯著性差異(P<0.01)，YPYGF小劑量組與模型組比較，ALT、 AST和GGT有顯著性差異(P<0.05)，而ALP無顯著性差異(P>0.05)。

表1 各組大鼠第16周肝功比較(U/L)

注： 與模型組比較，*P>0.05；與模型組比較，△P<0.05；與模型組比較，#P<0.01

3 組織病理結果 益脾養肝方對大鼠肝癌癌前病變病理組織的影響見圖1。空白組肝小葉結構、肝索排列以及肝細胞核均正常，其余各組肝小葉結構破壞，增生細胞有異型性表現，可見雙核細胞，肝小葉匯管區有淋巴細胞浸潤和膽管增生等。與模型組比較，YPYGF兩組的增生細胞異型性顯著變小，雙核細胞減少，并且炎癥情況較輕，而YPYGF大劑量組效果更佳。

圖1 各組大鼠病理組織結果比較(HE×100)

4 PCNA和GGT蛋白表達結果 益脾養肝方對大鼠肝癌癌前病變PCNA和GGT蛋白表達的影響見圖2。由圖可見模型組肝組織PCNA和GGT的表達均明顯增強，主要見于癌前病變組織和周圍組織。YPYGF大、小劑量組均能顯著抑制PCNA和GGT的表達，大劑量組效果最佳。

圖2 PCNA和GGT蛋白表達結果(HE×100)

討 論

肝炎-肝硬化-肝癌，是肝病演進的“三部曲”，從肝硬化到肝癌會經歷一個較長的肝癌癌前病變階段[6]。2015年《原發性肝癌規范化病理診療指南》[7]指出：肝細胞癌癌前病變的病理類型可分為肝細胞異型增生、異型增生灶、低度異型增生結節(LGDN)、高度異型增生結節(HGDN)、肝細胞腺瘤(HCA)。中醫“治未病”理論強調：未病先防，既病防變，如能篩選有效中藥復方或單體延緩、阻斷、甚至逆轉肝癌癌前病變的惡性演進，從而阻止肝癌的發生。

益脾養肝方由黨參、白術、熟地、枸杞、姜黃、鱉甲、郁金、半枝蓮、白花蛇舌草九味藥物組成，具有益脾養肝、行氣活血，解毒散結的功效。本研究顯示益脾養肝方能夠改善大鼠肝癌癌前病變的病理形態，益脾養肝方兩組的增生細胞異型性顯著變小，雙核細胞減少，并且炎癥情況較輕，而益脾養肝方大劑量組效果更佳，說明益脾養肝方對肝癌癌前病具有抑制作用。

肝癌癌前病變的形成和惡性進展與細胞異常增殖、細胞氧化損傷密切相關[8-10]。PCNA的合成、表達與細胞增殖顯著相關，在多種腫瘤的發生過程中均有著重要意義。PCNA陽性表達與肝細胞的異常增殖密切相關，PCNA 陽性細胞更具有癌變傾向。GGT的表達與肝細胞的氧化損傷明顯相關，在癌變過程中GGT陽性顆粒的出現程度與肝細胞癌變過程呈正相關，GGT為肝癌發生的早期標志酶。本研究顯示大鼠肝癌癌前病變肝組織PCNA和GGT均大量表達，PCNA主要在肝癌癌前病變組織和周圍組織，而益脾養肝方能顯著抑制PCNA和GGT的蛋白表達，大劑量組效果優于小劑量組。

綜上所述，益脾養肝方對于大鼠肝癌癌前病變具有抑制作用，其作用可能通過抑制PCNA和GGT蛋白的表達，達到抗細胞異常增殖和抗細胞氧化損傷的作用。該研究結果為益脾養肝方抗肝癌前病變作用機制的深入探討和進一步研究提供了一定的實驗依據。

[1] 李京濤, 郭 師, 席 奇,等. 益脾養肝方聯合肝動脈化療栓塞術治療原發性肝癌的療效觀察[J]. 陜西中醫, 2015,36(8):944-945.

[2] 南 然, 宋春榮. 常占杰教授用益脾養肝法治肝病經驗談[J]. 光明中醫, 2012, 27(12):2408-2409.

[3] 馬文群,李利敏,宋國智. 增殖細胞核抗原與腫瘤關系的研究進展[J].河北醫藥，2011,33(4):600-602.

[4] 吳 芳，孫鳳霞，徐春軍. γ-谷氨酰轉肽酶在肝臟疾病診斷和預后中的意義[J].中華實驗和臨床感染病雜志，2015,9(5)：616-620.

[5] 宋藝君, 楊史軍, 王 湘, 等. 丹皮酚對二乙基亞硝胺誘發大鼠肝癌前病變的預防作用[J]. 陜西中醫, 2015,36(9):1270-1271.

[6] Tommaso L, Sangiovanni A, Borzio M,etal. Advanced precancerous lesions in the liver[J]. Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2013, 27(2):269-284.

[7] 中國抗癌協會肝癌專業委員會, 中華醫學會肝病學分會肝癌學組, 中國抗癌協會病理專業委員會, 等. 原發性肝癌規范化病理診斷指南(2015年版) [J]. 中華肝膽外科雜志, 2015,21(3):145-151.

[8] 張莉莉, 王 立. 肝癌癌前病變防治機制的研究概況[J]. 中國中西醫結合雜志 ,2010 , 29(9):113-118.

[9] 黃晶晶, 黃鴻娜, 毛德文,等. 肝癌的癌前病變研究進展[J]. 遼寧醫學雜志,2013,27(5) :26-28.

[10] 陳曉婷, 何 超, 李京濤,等. 中醫藥防治肝癌癌前病變的研究現狀 [J]. 中西醫結合肝病雜志,2016,26(5) :314-316.

(收稿：2016-09-11)

Compound Yipi Yanggan decoction exerts inhibits liver precancerous lesion by mediating expression of PCNA and GGT proteins

Liu Yazhu,Li Jingtao,Wei Hailiang ,et al.

The Hospital Affiliated to Shaanxi University of Chinese Medicine( Xianyang 712000)

Objective:To study the effects of Yipi Yanggan decoction on the amelioration of pathological morphology and expression of PCNA and GGT proteins in diethylnitrosamine (DEN) induced rat liver precancerous lesion. Methods : Rats were randomly divided into the normal control, the DEN group, and two Yipi Yanggan decoction (0.5, and 1.0 g/ml) treatment groups. The hepatic precancerous lesion model of male Wistar rats induced by intraperitoneal injection of DEN was used. After 16 weeks of administration, rats were sacrificed. To observate general conditions, body weight and liver function of rats. Liver tissues were measured by HE staining, and the expression of PCNA and GGT proteins of liver tissues were measured by immunohistochemical detection. Results : Compared with model group, ALT, AST, GGT and ALP of two Yipi Yanggan decoction groups were significantly lower, which the best was high-dose group of Yipi Yanggan decoction (P<0.01). Conclusion: Yipi Yanggan decoction can improve the rat liver precancerous pathological morphology, and can remarkably inhibit the cell abnormal proliferation and cellular oxidative damage.

Liver neoplasms/traditional Chinese medicine therapy @ Liver precancerous lesion @ Yipi Yanggan decoction Animal experimentation Rsts @PCNA

*國家自然科學基金資助項目(81603612) 陜西省科技廳課題(2012SF2-11，2014K11-02-04-06, 2016SF-234)

肝腫瘤/中醫藥療法 @肝癌前病變 @益脾養肝方 動物實驗 大鼠 @PCNA

R735.7

A

10.3969/j.issn.1000-7369.2017.02.058

陜西省中醫藥管理局課題(15-JC009)

北京醫學獎勵基金會課題(YJHYXKYJJ-276)

△通訊作者