Pichiapastoris細胞的酶法水解

張永杰，牛丹丹,*，吳海洋，黃磊，董自星，劉曉光，葉秀云，路福平*

1 (天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津,300457) 2(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州,350116) 3 (天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，生物化工系，天津,300457)

Pichiapastoris細胞的酶法水解

張永杰1，牛丹丹1,2*，吳海洋1，黃磊1，董自星3，劉曉光3，葉秀云2，路福平1*

1 (天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點實驗室，天津,300457) 2(福州大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建省海洋酶工程重點實驗室，福建 福州,350116) 3 (天津科技大學(xué) 化工與材料學(xué)院，生物化工系，天津,300457)

以工業(yè)酶制劑生產(chǎn)中的廢棄畢赤酵母細胞為對象，研究并建立了酶法制備酵母浸出物的新工藝。新工藝為：10%(w/v)廢棄畢赤酵母菌體中加入β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶，于50 ℃作用12 h；再加入中性蛋白酶，于50 ℃作用7 h；再加入DNA酶和RNA酶，于37 ℃作用4 h。離心收集上清液，真空冷凍(或噴霧)干燥獲得酵母浸出物。運用這一技術(shù)，酵母細胞組分的溶出率達到66.2%，固形物收得率為65.7%。使用該研究制得的酵母浸出物培養(yǎng)重要工業(yè)微生物菌種，其支撐細胞生長繁殖的效果顯著優(yōu)于市售酵母粉。

酵母浸出物；酶法制備；畢赤酵母

酵母細胞抽提物或浸出物(yeast extract)是以酵母細胞(主要是啤酒酵母或面包酵母)為原料，經(jīng)過自溶或酶解等制得。酵母浸出物含有18種以上的氨基酸，尤其含有谷物中含量不足的賴氨酸；還富含B族維生素和鈣、鎂、鋅、鐵、硒等微量元素[1]。酵母浸出物除了作為微生物培養(yǎng)基的主要組成外，近年來已發(fā)展成為食品工業(yè)中的原/輔料，在營養(yǎng)、調(diào)味和保健方面發(fā)揮其獨特功效。

酵母細胞及其浸出物長期以來一直是食品發(fā)酵工業(yè)研究的重要內(nèi)容，國內(nèi)外有關(guān)酵母浸出物的研究主要集中在制備過程的影響因素[2]、生產(chǎn)方法[3]、下游工藝[4]、富含5’-單磷酸鳥苷(5’-GMP)的酵母抽提物的生產(chǎn)[5-6]以及酵母浸出物在生產(chǎn)紅酒澄清劑[7]、芳香成分[8]、棕櫚油酸[9]和治療肉雞的壞死性腸炎[10]等方面。但就酵母浸出物的生產(chǎn)技術(shù)研究，長期停留在以自溶為基礎(chǔ)的工藝優(yōu)化方面，深入研究不多。

酵母浸出物的生產(chǎn)技術(shù)主要有：自溶法、酶解法和酸解法，其中自溶法仍然是我國酵母浸出物制備的主要方法；酸解法因為污染嚴重、產(chǎn)品質(zhì)量低等已經(jīng)不再被使用。酵母浸出物的生產(chǎn)原料主要為啤酒釀制后的酵母廢棄生物體，所采用的生產(chǎn)工藝的關(guān)鍵步驟是物理誘導(dǎo)酵母細胞自溶，在細胞自溶時釋放相關(guān)水解酶系使得細胞生物體酶解，此法簡便易行但收得率較低[2]。酶解法制備酵母浸出物是一種高效、綠色制造技術(shù)，目前，世界上僅日本采用酶法生產(chǎn)酵母浸出物；我國利用酶法技術(shù)生產(chǎn)酵母浸出物工藝尚未成熟[1]，其中各關(guān)鍵因素、酶制劑的種類與使用方式等有待深入研究。

新型酵母資源替代啤酒酵母制備酵母浸出物是一個值得關(guān)注的研究方向，其中備受關(guān)注的便是能夠進行高密度培養(yǎng)的巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)[11]。作為重要酶制劑工業(yè)生產(chǎn)宿主的巴斯德畢赤酵母，在其完成酶制劑的生產(chǎn)后，主要作為廢棄物通過烘干等物理處理，用作動物飼料的添加劑或輔料，營養(yǎng)價值遠遠沒有得到應(yīng)有的開發(fā)與利用。為此，本研究探索全酶法處理巴斯德畢赤酵母廢棄細胞制備酵母浸出物的新方法，并評價所獲得酵母浸出物的營養(yǎng)價值。

1 材料與方法

1.1 酶與菌種

巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)GS115為本實驗室保藏，用YPD培養(yǎng)基(酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%)進行培養(yǎng)。地衣芽胞桿菌CBBD302為本課題組前期研究中選育的可用于多種工業(yè)酶高效表達的工業(yè)宿主細胞，大腸桿菌JM109為分子克隆常用實驗菌株，均由本實驗室保藏，以M9’培養(yǎng)基(以M9培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，添加12.05%的酵母膏并去除其中含磷元素的成分)進行培養(yǎng)。

β-甘露聚糖酶(60 000 U/g)、β-葡聚糖酶(20 000 U/g)和果膠酶(100 000 U/g)購自江蘇銳陽生物科技有限公司；中性蛋白酶(20 000 U/g)、DNA酶(330 U/g)、RNA酶(35 000 U/g)為通過本實驗室前期研制的重組菌發(fā)酵制備獲得。其他藥品和試劑均為分析級，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 酶活測定方法

中性蛋白酶活性測定采用福林酚法[13]。核酸酶活性測定采用紫外分光光度法[14]。其基本方法是：將0.1 mL酶液與0.2 mL 2 mg/mL熱變性的小牛胸腺DNA在37 ℃孵育30 min后，用7%的高氯酸終止反應(yīng)，再加入3 mL預(yù)冷的蒸餾水，在10 000×g，4 ℃條件下離心15 min，再用紫外分光光度計在260 nm下測定上清液的吸光值。反應(yīng)液與對照的吸光值之差為1時定義為1個酶活力單位(U)。

1.3 單酶水解試驗

離心收集廢棄的畢赤酵母細胞，然后將其用每種酶的最適緩沖液配制成10% (w/v)的酵母液，分別用β-甘露聚糖酶(50 ℃，pH 5.5)、β-葡聚糖酶(50 ℃，pH 4.8)、果膠酶(50 ℃，pH 5.0)、中性蛋白酶(50 ℃，pH 7.0)、DNA酶(37 ℃，pH 7.0)和RNA酶(37 ℃，pH 7.0)在各自最適反應(yīng)條件下對酵母細胞進行單獨作用。在不同時間點取樣分析酵母細胞溶出情況，以溶出率進行描述。

(1)

式中：η，溶出率，%；m0,初始酵母細胞質(zhì)量，g;m1剩余酵母細胞質(zhì)量，g。

1.4 組合酶水解試驗

在10% (w/v)的酵母液中，分別添加β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶以及果膠酶中的任意兩種酶或同時添加3種酶，于50 ℃對酵母細胞進行酶解，并在不同時間點取樣，通過測定上清中還原糖的含量來判斷組合酶的作用效果，以單個酶對酵母的酶解作用為對照。

在β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶以及果膠酶作用至酵母泥質(zhì)量不再變化后，用0.1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，再加入中性蛋白酶于50 ℃對酵母細胞進行作用，考察中性蛋白酶的協(xié)同作用效果。

1.5 酶法制備酵母浸出物的基本流程

在上述實驗的基礎(chǔ)上，確定酶法制備凍干酵母浸出粉的基本工藝流程，并與現(xiàn)有工藝進行比較。采用該工藝流程制備酵母浸出物，并通過不同時間點取樣，確定該工藝流程中酵母泥質(zhì)量的變化情況。再取3個250 mL三角瓶，分別加入等量(約0.85 g)的酵母泥。然后采用上述工藝流程酶解酵母細胞，離心后(12 000 r/min，10 min)，將上清液在烘箱中烘至恒重，并稱重，計算細胞組成溶出率與固形物收得率。

(2)

式中：R，固形物收得率，%;m0′,酶解前酵母干重,g;m1′,酶解酵母細胞上清液總質(zhì)量,g;m2,反應(yīng)過程中外加入的酶制劑，調(diào)pH時所加的NaOH等干重總和，g;ρ，上清液固形物含量，%。

1.6 微生物生長試驗

采用1.1描述的培養(yǎng)基，并用含有25 mL M9培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，在37 ℃、220 r/min下分別培養(yǎng)地衣芽胞桿菌CBBD302和大腸桿菌JM109，通過測定細胞生物量，考察并比較其生長情況。同樣，將YPD培養(yǎng)基中的酵母浸出粉替換為本研究獲得的酵母浸出物，30 ℃、220 r/min下培養(yǎng)畢赤酵母GS115，研究其對酵母細胞生長的影響。細胞生物量的測定采用分光光度計法進行[12]。

1.7 酵母浸出物的組成分析

酵母浸出物的全組成成分采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進行分析。色譜條件如下：色譜柱：Agilent HP-5毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)，載氣：高純氦氣，載氣流速：1.0 mL/min；進樣方式：不分流；進樣量：1 μL。初始溫度70 ℃，維持4 min，以3 ℃/min升到133 ℃，再以2 ℃/min升到200 ℃，再以3℃/min升到220 ℃，最后以5 ℃/min升到260 ℃。進樣口溫度：270 ℃；接口溫度：280 ℃；離子化方式：電子轟擊(EI)，溫度230 ℃，電子能量70 eV；四級桿溫度150 ℃，質(zhì)譜掃描范圍為85～500m/z。

此外，還原糖含量的測定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS法)[15]；酵母干物質(zhì)含量測定按照文獻方法進行[1]。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同酶制劑對巴斯德畢赤酵母細胞的作用特征

酵母浸出物制備的相應(yīng)酶制劑的首選需要其能打開酵母的細胞壁[16-17]。據(jù)估算60 min內(nèi)酶解1 g酵母細胞時酶的添加量為：β-甘露聚糖酶508.5 U、β-葡聚糖酶508.5 U、果膠酶56.5 U、中性蛋白酶56.5 U。以此為基礎(chǔ)，在酶的最適作用條件下酶解酵母細胞，結(jié)果如圖1a所示。

在加入β-甘露聚糖酶、中性蛋白酶、β-葡聚糖酶或果膠酶作用1 h后，酵母細胞的溶出率達到21%～43%。可見，上述酶皆能明顯加速酵母細胞的裂解效率與程度、促進內(nèi)含物的釋放。其中，果膠酶的作用效果最好，這可能是因為除了作用于果膠外，它還可以降解幾丁質(zhì)、β-葡聚糖等[18]，從而有利于細胞組成的水解與內(nèi)含物的快速釋放。酶解5 h后酵母細胞的溶出率達到42%～48%，繼續(xù)延長作用時間，酶解作用不明顯(圖1a)。此外，通過增加酶的添加量，溶出率增加不顯著(未發(fā)表數(shù)據(jù))。可見，本實驗中計算出的用酶劑量適合巴斯德畢赤酵母細胞的溶出。

▲-DNA酶；▼-RNA酶；●-未加酶的對照圖1 不同的酶制劑對畢赤酵母細胞的作用Fig.1 Effects of different enzymes on the hydrolysis of P. pastoris GS115 cells (注：50℃、pH 7.0條件下自溶6 h，冷卻至37℃后，再加入DNA酶或RNA酶。)

本研究進一步考察了DNA酶或RNA酶對酵母細胞浸出物形成的影響，采用自溶后的酵母細胞為作用對象，結(jié)果如圖1b所示。在330 U/g DNA酶或3.5萬 U/g RNA酶的作用下，前期對細胞組成的溶出作用不明顯，后期DNA酶呈現(xiàn)明顯的作用而RNA酶作用效果一般。由此也可以看出，通過細胞自溶獲得酵母浸出物的工藝過程中DNA酶相對不足。

2.2 組合酶對酵母細胞的水解作用

細胞的不同組分意味著酶的組合可以對酵母細胞溶出具有協(xié)同作用。為此，以可溶性還原糖釋放量為指標，研究了β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶之間的可能協(xié)同作用對畢赤酵母細胞的酶解作用。在酶的作用下，隨著反應(yīng)時間的延長，酶解上清中還原糖含量不斷增加。其中，3種酶共同作用明顯優(yōu)于2種酶之間的組合作用，并顯著優(yōu)于單酶的作用(圖2)。

▲-β-甘露聚糖酶+果膠酶；▼-果膠酶；△-β-葡聚糖酶；◆-β-甘露聚糖酶圖2 組合酶對酵母細胞的作用Fig.2 Effects of different enzyme combinations on the hydrolysis of yeast cells

在β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶共同作用至酵母泥質(zhì)量不再變化時(約12 h)，補加中性蛋白酶，酵母細胞的溶出率和上清中還原糖的含量隨作用時間不斷增加(圖3)。可見，中性蛋白酶顯著提高酵母細胞蛋白組分的溶出；蛋白酶的添加進一步激發(fā)了還原糖的釋放，可見蛋白酶與糖基水解酶之間也存在協(xié)同作用。

圖3 中性蛋白酶對畢赤酵母的作用Fig.3 Effects of neutral protease on the degradation of yeast cells

2.3 酶法制備酵母浸出物工藝流程

基于上述研究結(jié)果，擬定的酶法制備酵母浸出物新工藝為：(1)制備100 g/L酵母液，pH 5.5；(2)按干菌體質(zhì)量計算，每克干菌體質(zhì)量加入：508.5 U β-甘露聚糖酶、508.5 U β-葡聚糖酶和56.5 U果膠酶，于50 ℃酶解12 h；(3)調(diào)pH至7.0后，加入56.5 U中性蛋白酶，于50 ℃酶解7 h；(4)65 ℃滅酶30 min后，冷卻至37 ℃，加入18.8 U DNA酶和300 U RNA酶解，繼續(xù)酶解4 h；(5)離心(12 000 r/min，5 min)取上清液，經(jīng)冷凍干燥或噴霧干燥獲得粉狀酵母浸出物。

以廢棄的畢赤酵母細胞為原料，采用上述工藝流程制備酵母浸出物，在1.0 L反應(yīng)體系下，主要工段酵母細胞溶出率分別是：β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶和果膠酶協(xié)同作用后，酵母細胞的溶出率達到60.5%；進一步加入蛋白酶后的溶出率為64.5%；再在DNA酶和RNA酶的作用下，酵母細胞組分溶出率達到66.2%，固形物收得率達到65.7%。明顯高于已有報道中采用酶促自溶法以啤酒廢酵母為原料制備酵母浸出物的59.16%[1]、50%的固形物收得率[4]或用鮮酵母制備酵母抽提物的56.32%的收得率[16]。

在酶促自溶法制備酵母浸出物的生產(chǎn)工藝中，除了利用細胞自身的水解酶系(蛋白酶、核酸酶、糖基水解酶等)外，通過外加木瓜蛋白酶和溶壁酶等進行酶促自溶，并后續(xù)再使用中性蛋白酶、5’磷酸二酯酶以及磷酸腺苷脫氨酶等進行酶解[16]。顯然，用酶成本過高且復(fù)雜，特別是溶壁酶、磷酸二酯酶和磷酸腺苷脫氨酶等屬于特別昂貴的酶種[1]。可見，與酶促自溶法相比，本研究建立的酶法制備酵母浸出物路線，是從酵母的細胞壁開始對其大分子物質(zhì)組成進行逐步酶法拆解(水解)，具有水解效率高、操作簡單、生產(chǎn)周期短、便于操作與自動化控制等優(yōu)點，有利于后續(xù)的工業(yè)化放大與應(yīng)用。

2.4 酵母浸出物組成分析與營養(yǎng)

采用GC-MS對所本研究制得的酵母浸出物的單體組成成分進行全分析。其中匹配度高于85%的部分物質(zhì)列于表1中。該酵母浸出物的主要成分有糖類、氨基酸、核苷、脂肪酸及有機酸等物質(zhì)，這些單體物質(zhì)對生物體營養(yǎng)支持與細胞生長繁殖是十分重要的。

表1 GC-MS分析酵母浸出物的單體組成成分

分別用本研究中制備的酵母粉替換1.1中描述的M9’培養(yǎng)基和YPD培養(yǎng)基中的酵母抽提物(OXOID)，進行培養(yǎng)基配制，以此培養(yǎng)基分別培養(yǎng)地衣芽胞桿菌CBBD302、大腸桿菌JM109以及畢赤酵母GS115，結(jié)果如圖4所示。采用本法制備的酵母浸出物能夠很好支持包括地衣芽胞桿菌、大腸桿菌JM109和畢赤酵母的生長，搖瓶條件下，地衣芽胞桿菌、大腸桿菌和畢赤酵母的最大細胞生物量(A600)分別為4.495、3.902和42.03，較對照分別提高了1.9倍、1.3倍和0.1倍；對細菌營養(yǎng)與繁殖具有極為顯著的營養(yǎng)支撐作用。

a：地衣芽胞桿菌CBBD302；b：大腸桿菌JM109；c：畢赤酵母GS115；■：培養(yǎng)基中采用用自制酵母粉；○：培養(yǎng)基中采用酵母抽提物(OXOID)圖4 酵母浸出物對微生物生長的作用Fig.4 Effects of yeast extracts on the cell growth of different microorganisms

3 結(jié)論

本研究依據(jù)酵母細胞組成大分子的基本特征，采用酶法水解路線實現(xiàn)了酵母細胞浸出物的高效酶法制備，由此獲得的酵母浸出物可更好滿足常見工業(yè)菌株如大腸桿菌、地衣芽胞桿菌、巴斯德畢赤酵母細胞的營養(yǎng)與生長需求。研究結(jié)果還將有利于現(xiàn)有酵母浸出物制備工藝的改進，也為發(fā)酵工業(yè)中廢棄菌體資源化利用提供新的技術(shù)支持。

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Enzymatic hydrolysis ofPichiapastoriscells

ZHANG Yong-jie1, NIU Dan-dan1,2*,WU Hai-yang1,HUANG Lei1,DONG Zi-xing3, LIU Xiao-guang3, YE Xiu-yun2, LU Fu-ping1*

1(Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology, Ministry of Education, College of Biotechnology,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457,China) 2 (Fujian Provincial Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering, College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350116,China) 3 (Department of Biological Chemical Engineering, College of Chemical Engineering and Material Sciences,Tianjin University of Science & Technology, Tianjin 300457,China)

Yeast extract contains abundant nutrition and has wide applications in condiment, pharmaceuticals, health care, microbial fermentation and other industries. Using spent yeast cell mass ofPichiapastorisformed during the production of industrial enzymes as raw materials, a novel enzymatic process for preparing yeast extract was established as follows. Spent cells ofP.pastoriswere re-suspended to a final concentration of 10% (w/v). β-Mannases, β-glucanase and pectinase were then added simultaneously to hydrolyze yeast cells at 50 ℃ for 12 h. The hydrolysis was then continuously carried out with neutral protease at 50 ℃ for 7 h. Additionally, the reaction mixture was treated with DNase and RNase for another 4 h. After all enzymatic treatments had been administered, the hydrolysate was centrifuged, and yeast extract was obtained from the supernatant by vacuum freeze-drying or spray drying, with a dissolution rate of 66.2% and a dry matter yield of 65.7%. Yeast extract prepared in this study was much better than that from commercial sources in cultivating microorganisms, including industrially important strainsEscherichiacoli,Bacilluslicheniformis, andP.pastoris.

yeast extract; enzymatic preparation;Pichiapastorisbiomass

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701014

碩士研究生(牛丹丹,路福平教授為通訊作者,E-mail: ddniu0529@fzu.edu.cn，lfl@tust.edu.cn)。

天津市高等學(xué)校科技發(fā)展基金計劃項目(20130628)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃(青年基金項目)(14JCQNJC09200)；福建省教育廳產(chǎn)學(xué)研(JA15049)；國家自然科學(xué)基金國際(地區(qū))合作與交流項目(31461143026)

2016-06-22，改回日期：2016-07-29