采后贛南臍橙熱水處理的保鮮效果

林麗萍，葉明娥，陳于隴 ，張鳳英，吳國平*

1(江西農業大學 南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室，江西 南昌，330045) 2(江西省果蔬采后處理關鍵技術與質量安全協同創新中心，江西 南昌，330045) 3(廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東 廣州，510610)

采后贛南臍橙熱水處理的保鮮效果

林麗萍1,2，葉明娥1，陳于隴3，張鳳英1，吳國平1*

1(江西農業大學 南昌市農產品加工與質量控制重點實驗室，江西 南昌，330045) 2(江西省果蔬采后處理關鍵技術與質量安全協同創新中心，江西 南昌，330045) 3(廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所，廣東 廣州，510610)

為研究熱水處理技術在柑橘類水果采后保鮮中的應用可行性。試驗以江西省贛南臍橙為試材，設計2因素(溫度和時間)5水平均勻試驗，分別考查熱水處理后贛南臍橙貯藏品質相關指標(呼吸速率、可溶性固形物含量和硬度)和貯藏發霉情況，并研究了熱水處理對贛南臍橙青、綠霉病原菌(意大利青霉和指狀青霉)孢子的致死作用機制。綜合分析，得出贛南臍橙熱水處理較優條件為：50 ℃，5 min。該條件處理后的贛南臍橙呼吸速率最低，為42.89 mg CO2/(kg·h)。 25 ℃溫箱保藏20 d，該處理組贛南臍橙均未發病，優于對照組。加贛南臍橙皮到病原菌孢子懸液中進行熱水處理，病原菌孢子死亡率檢測及Hoechst 33342/PI熒光雙染色結果顯示，贛南臍橙皮成分與熱對病原菌有協同抑殺作用，病原菌孢子細胞膜受到損傷。50 ℃，5 min熱水處理應用于贛南臍橙采后保鮮具有可行性。

贛南臍橙；熱水處理；保鮮效果；病原菌

江西贛南自上世紀70年代引種栽培臍橙成功以來，目前已發展成為我國臍橙主產區，約占我國臍橙總種植面積的60%。贛南臍橙種植不僅促進了當地農業結構優化和農民脫貧致富，也使贛南臍橙成功躋身全球三大臍橙品牌之一[1-2]。2014年，贛南臍橙以其優良的品質作為江西省唯一產品，入圍商務部、質檢總局中歐地理標志協定談判的地理標志產品清單[3-4]。贛南臍橙以紐荷爾臍橙為主栽品種，占贛南臍橙總種植面積的90%。由于品種單一，采收期高度集中，加之采后初、深加工嚴重不足，使得贛南臍橙采后貯藏保鮮成為調控市場供給、維持銷售價格的重要方式。然而，臍橙等柑橘類果品收獲、貯運、保鮮期間極易遭受柑橘青、綠霉菌病害[5]，導致果品腐爛變質，造成的經濟損失甚至可達10%～30%[6]，嚴重影響了果農的收益和產業的健康發展。

目前臍橙霉菌病害的防控，主要是用化學殺菌劑對果品進行噴霧、浸泡等貯藏保鮮預處理[7-8]，取得了較好的效果。但這一方法有其缺點，如農藥在果品內殘留，霉菌抗藥性的產生，藥效維持時間短等。目前，一種環境友好、無藥殘的新型貯藏保鮮技術——熱水處理，即用熱水噴淋果品，以有效預防柑橘類果實采后霉菌病的發生[9-10]。熱水處理采用的溫度一般在43～53 ℃，時間維持數分鐘至2 h[11-12]，具有消毒效果好，無污染、能耗低、便于操作、可清潔果實等優點，已發展成為柑橘類果品貯藏保鮮的一種實用技術。但是，目前熱水處理在贛南臍橙采后貯藏、保鮮中防控霉菌病害的應用條件和機制鮮見報道。

由于果實本身的呼吸、代謝、蒸騰等作用，使得果品在貯藏過程中會出現失重、軟化、風味變差等品質劣化現象，最終會縮短果品貯藏期，降低其價值[13-15]。本文主要研究熱水處理對贛南臍橙貯藏品質相關指標(呼吸速率、硬度和可溶性固形物含量)、贛南臍橙貯藏發霉情況的影響；并進一步探索熱水處理對贛南臍橙青、綠霉菌孢子致死作用機制，以解析熱水處理防控霉菌病害的可行性和生物機制，為贛南臍橙霉菌病害的物理防控措施提供實驗數據和理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 病原菌

意大利青霉(Penicilliumitalicum)和指狀青霉(Penicilliumdigitatum)：中國農業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 贛南臍橙

贛南臍橙，來自贛州市安遠縣果園樹齡為8.5年的紐荷爾臍橙。采收期為2014年11月中旬，果實大小、成熟度(九成熟)均勻一致，平均單果重200 g左右，表皮完好，無傷口。

1.1.3 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，水1000 mL，瓊脂20 g，pH自然，121 ℃滅菌20 min。作病原菌的活化、培養及計數用。

再生培養基： NaNO32 g ，KCl 0.5 g ，K2HP41 g ，MgSO40.5 g ，蔗糖3 g ，酵母膏5 g。 以0.7 mol/L NaCl配制1 000 mL，pH自然。作病原菌孢子熒光染色用。

1.1.4 主要試劑

蝸牛消化酶(90 U/g)，上海研域生物科技有限公司，Hoechst33342/PI雙染試劑盒，購于南京建成生物工程研究所；滲透壓穩定劑，用0.1mol/L pH 5.5～6.0磷酸緩沖液配制0.7 mol/L NaCl。

1.2 儀器與設備

LDZX-40B自動立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫療器械廠；SHP-160型生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司；HH-6數顯恒溫循環水浴鍋，國華電器有限公司；WYT-J手持式折光儀，成都青羊華瑞光學儀器廠；GY-1果實硬度計，北京時代恒宇科技有限公司；3051H果蔬呼吸測定儀，均方理化科技研究所；HC-2518R高速冷凍離心機，安徽中科中佳學儀器有限公司；ZEISS Ver.A1熒光顯微鏡，德國卡爾蔡司光學儀器公司；BK5000數碼生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限責任公司。

1.3 贛南臍橙熱水處理試驗設計

考慮贛南臍橙個體大小、質地均與現有報道[11-12]應用熱處理的水果有差異，為獲得合適的贛南臍橙熱水處理溫度和時間條件，設置溫度和時間2個因素多個水平的試驗(表1)。綜合考慮本試驗涉及的因素、水平及回歸系數估計的可靠性，采用U*10(108) 擬水平表[16]，形成本試驗的熱水處理試驗方案。

表1 因素水平表

1.4 試驗方法

1.4.1 贛南臍橙熱水處理方法

選取大小均勻，表面完好，無傷口的6個贛南臍橙為1個處理組，呼吸速率、硬度及可溶性固形物測定試驗重復3次。于預熱好的循環水浴鍋內，臍橙上施泡沫及重物按壓，使其浸沒在熱水中，并不斷來回推動泡沫以使臍橙均勻受熱。以溫度指示進行計時，熱水處理后的贛南臍橙立即置碎冰上冷卻10 min，晾干贛南臍橙表面水分，分別用于贛南臍橙呼吸速率、硬度、可溶性固形物含量3個指標的測定。

1.4.2 贛南臍橙呼吸速率的測定

取熱水處理后的一組贛南臍橙，分別稱量其質量并記錄，果蔬呼吸測定儀測定呼吸速率，記錄5 min內呼吸室CO2的摩爾濃度變化值，測定時的檢測室內溫度t(℃)。以室溫下未經熱處理的贛南臍橙的呼吸速率測定結果作對照。呼吸速率計算公式：

(1)

式中：R，贛南臍橙的呼吸速率，mgCO2/(kg·h)；ΔCO2，5 min內CO2摩爾濃度變化量，μmol/mol；V，果蔬呼吸測定儀容器內自由體積，L；M，CO2的摩爾質量，g/mol；m，贛南臍橙的質量，kg；V0，測定溫度下CO2的摩爾體積，L/mol。

1.4.3 贛南臍橙硬度的測定

果實去皮，果實硬度計測定贛南臍橙硬度，即在同一贛南臍橙的頸部，腰部，尾部測量3個數據，取其平均值作為該贛南臍橙的硬度值，以室溫下未經熱處理的贛南臍橙的硬度測定結果作為對照。

1.4.4 贛南臍橙可溶性固形物含量的測定

以手持式折光儀測定贛南臍橙可溶性固形物含量(soluble solid content，SSC)，以室溫下未經熱處理的贛南臍橙的可溶性固形物為對照。

1.4.5 熱水處理后贛南臍橙的貯藏保鮮試驗

取6個贛南臍橙為1組按1.4.1法進行熱水處理，晾干贛南臍橙表面的水分，單個贛南臍橙套上PE保鮮袋(d=0.04 mm)，置于25 ℃的培養箱內保溫20 d ，逐日觀察并記錄果實發病情況，每組熱處理試驗重復4次。對照組為相同數量的贛南臍橙，以2%次氯酸鈉溶液浸泡贛南臍橙10 min，然后以無菌水(自來水敞蓋煮沸、晾涼)沖洗后自然晾干，同樣套上PE保鮮袋，置于25 ℃的培養箱內保溫20 d ，逐日觀察并記錄果實發病情況。

1.4.6 熱水處理后病原菌孢子死亡率的測定

選取健康贛南臍橙，清洗干凈，用2%次氯酸鈉進行表面消毒處理。取消毒后的贛南臍橙果皮，用無菌模具將贛南臍橙的果皮切成直徑為3 mm的圓片(厚度約2 mm)，取20片果皮加入10 mL霉菌孢子懸液(孢子濃度為n×106個/mL，n<10)試管中，試管于50 ℃，5 min水浴后，碎冰中冷卻至室溫，采用平板菌落計數法測定熱水處理后霉菌孢子的死亡率，設置不添加贛南臍橙皮同樣熱水處理的霉菌孢子懸液對照組，同樣采用平板菌落計數法檢測其死亡率，試驗重復3次。

1.4.7 熱水處理后病原菌孢子的熒光染色

對霉菌孢子懸液加贛南臍橙皮進行熱水處理，參考宋愛環等[17]的原生質體制備方法對霉菌孢子去壁：滲透壓穩定劑配制5 mg/mL的蝸牛酶，50～60 r/min，33 ℃振蕩保溫3.0 h。 去壁后的霉菌孢子以滲透保護劑洗滌2次，收集原生質體(105～106個細胞/mL)懸浮于1 mL再生培養基中，按照Hoechst33342/PI雙染試劑盒說明書進行染色后置于熒光顯微鏡下觀察。Hoechst 33342用氪激光激發的紫外光，激發波長為352 nm，發射波長為400～500 nm，產生藍色熒光；PI用氬離子激光激發熒光，激發光波波長為488 nm，發射光波波長大于630 nm，產生紅色熒光。

1.5 數據分析

數據為重復試驗的平均值和標準差，采用 IBM SPSS 20 數據處理軟件進行回歸分析和方差分析。

2 結果與分析

2.1 熱水處理后贛南臍橙貯藏品質相關指標的直觀分析

不同條件熱水處理，對贛南臍橙貯藏品質相關指標的影響結果見表2。所有熱水處理組贛南臍橙的呼吸速率均高于對照組，與對照組相比，差異極顯著。相同處理溫度下，熱水處理時間長的，贛南臍橙呼吸速率數值增加明顯。經熱水處理后，贛南臍橙可溶性固形物含量均比對照組的可溶性固形物含量略微升高；而硬度則有所下降(除50 ℃，14 min組)。除55 ℃，17 min及60 ℃和65 ℃處理組的贛南臍橙表皮均有明顯的灼傷外，45 ℃，14 min和50 ℃，5 min處理組的可溶性固形物與對照組相比，差異不顯著；45 ℃，11 min和45 ℃，14 min處理組的硬度與對照組相比，差異不顯著。

表2 熱水處理后贛南臍橙貯藏品質相關指標測定結果

注：小寫字母代表是在0.05水平下比較，不同字母間為差異顯著；大寫字母代表在0.01水平下比較，不同字母間為差異極顯著。

2.2 熱水處理后贛南臍橙貯藏品質相關指標的回歸分析

根據均勻設計試驗所得熱水處理贛南臍橙的10組數據，采用逐個引進法進行二次多項式逐步回歸，得到呼吸速率y與熱處理溫度x1和熱處理時間x2的回歸方程：

y=-19.32 + 0.12x12+0.06x1x2

(2)

回歸方程偏回歸系數的檢驗結果(表3)表明，溫度x1和溫度與時間的交互作用x1×x2對熱水處理贛南臍橙的呼吸速率y有顯著的影響，且rx1×x2>rx1×x1，tx1×x2>tx1×x1，說明溫度與時間的交互作用比變量溫度對方程的貢獻更大。

表3 回歸方程偏回歸系數的檢驗結果

注：臨界值：r0.01(7)=0.798，t0.01(7)=3.449。

以呼吸速率極小值法對熱水處理溫度時間條件進行尋優分析，得到最低指標值的因素組合為：熱處理溫度x1=45 ℃，時間x2=5 min，呼吸速率的最小值y=30.30 mgCO2/(kg·h)。

進一步對表2中贛南臍橙熱水處理后的可溶性固形物含量和硬度指標分別對熱處理溫度和時間進行回歸分析，發現回歸方程在統計學上不顯著。

2.3 熱水處理后贛南臍橙的貯藏試驗結果

為縮短試驗周期，將熱水處理與未進行熱處理的贛南臍橙保藏于25 ℃溫箱中保溫20 d，比較各組贛南臍橙的發病情況。熱水處理組與對照組發病癥狀基本一致，符合青、綠霉病害的典型特征，起初橙皮表面形成褐色水漬斑，2～3 d后長出白色菌絲，4～5 d即長出青綠色霉層，6～7 d全果腐爛。這說明青、綠霉病害是贛南臍橙采后貯藏的主要霉菌病害。

試驗結果發現，不同熱水處理組贛南臍橙的發病情況不同，詳見表4。其中，55 ℃ 8 min處理組，贛南臍橙表皮雖未見明顯灼傷，但有輕度脫水，這可能是其被侵染的主要原因。45 ℃，14 min，50 ℃，5min和50 ℃，14 min處理的3組臍橙均未發病。

表4 不同處理組贛南臍橙的發病情況

注：—，代表該組贛南臍橙已全部發病。

2.4 熱水處理對病原菌孢子致死機制分析

2.4.1 熱水處理對病原菌孢子死亡率的影響

為探究贛南橙皮對病原菌孢子死亡率的影響，將病原菌孢子懸液加入一定量的贛南臍橙皮進行熱處理，以未加贛南臍橙皮熱處理的霉菌孢子為對照組。試驗選擇45 ℃兩組、50 ℃兩組及55 ℃(8 min)共5組熱水處理條件，測定熱水處理后意大利青霉和指狀青霉孢子的死亡率。試驗結果見表5，試驗組病原菌孢子死亡率明顯高于對照組，差異極顯著(P<0.01)。說明贛南臍橙皮可協同增強熱水處理致死霉菌孢子。該結果與前期研究贛南臍橙皮與熱同時處理可明顯降低柑橘霉菌致病力結果相符[18]。

表5 不同熱水處理病原菌孢子的死亡率 單位：%

注：大寫字母代表在0.01水平下比較，不同字母間為差異極顯著；意大利青霉與指狀青霉孢子死亡率的顯著性比較分別標注。

2.4.2 熱水處理致病原菌孢子細胞膜的影響

采用試驗設計中綜合指標較優的熱水處理方案50 ℃，5min，對熱耐受性好的意大利青霉熱水處理后制成的原生質體進行Hoechst 33342/PI熒光雙染色。未加贛南臍橙皮熱處理的病原菌，其原生質體中大多細胞呈藍色熒光(圖1-A，黑白圖中亮度高者發藍色熒光,)，表明大多霉菌孢子熱水處理后的細胞膜仍完整；加了贛南臍橙皮熱水處理的病原菌原生質體，大多細胞呈紅色熒光(圖1-B，黑白圖中亮度高者發紅色熒光)，說明試驗組大多霉菌孢子熱水處理后細胞膜遭破壞，因而使PI熒光染料通過破損的細胞膜進入胞內與核物質結合，呈紅色熒光。前期的研究發現加贛南臍橙皮熱水處理的柑橘霉菌懸液上清的電導率值和OD260nm值明顯升高[18]，說明霉菌孢子細胞內容物溢出。本試驗結果進一步說明加贛南臍橙皮熱水處理殺死柑橘霉菌孢子的機制可能主要是破壞了霉菌孢子的細胞膜完整性。

圖1 霉菌孢子熒光染色結果Fig.1 The results of fluorescence staining of mould spores

3 結論

(1)贛南臍橙采后熱法保鮮效果

相比正交試驗，均勻設計不僅可以大大減少試驗點，用較少的試驗獲得較多的信息；并可以通過數據的回歸分析，研究各因素變化與指標值之間的關系。試驗得到呼吸速率y與熱處理溫度x1和熱處理時間x2的回歸方程：y=-19.32 + 0.12x12+0.06x1x2，且溫度與時間的交互作用比變量溫度對方程的貢獻更大。

雖然根據回歸分析，推斷出的贛南臍橙最優熱水處理條件為45 ℃ 5 min，但是本試驗涉及的45 ℃，11 min處理組的贛南臍橙在溫箱保藏過程中有贛南臍橙被侵染發病，且該條件下處理的兩種病原菌孢子的死亡率也較低，綜合分析熱水處理對贛南臍橙貯藏品質相關3個指標的影響、贛南臍橙貯藏發霉情況及對病原霉菌孢子致死作用的影響，判斷熱水處理試驗條件為50 ℃，5 min用于贛南臍橙采后熱水處理保鮮具有可行性。

(2)贛南臍橙采后熱水處理保鮮的機制

病原菌孢子熱水處理試驗證實，加入贛南臍橙皮熱水處理的病原菌孢子死亡率明顯高于對照組，這可能是由于贛南臍橙皮釋放的檸檬烯、檸檬醛等抑菌成分起到了協同殺菌作用[19-20]。進一步熒光染色試驗證實了加贛南臍橙皮熱水處理的霉菌孢子細胞膜遭受了更為明顯的破壞，從而導致霉菌孢子的死亡。

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Research of the preservation effect on postharvest Gannan navel orange by hot water treatment

LIN Li-ping1,2, YE Ming-e1, CHEN Yu-long3, ZHANG Feng-ying1, WU Guo-ping1*

1 (Key Lab for Agricultural Products Processing and Quality Control of Nanchang City, Nanchang 330045, China)2(Collaborative Innovation Center of Post-harvest Key Technology and Quality Safety of Fruits andegetables in Jiangxi Province，Nanchang 330045, China) 3(Sericulture and Agri-food Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510610, China)

In order to study the feasibility of hot water treatment technology applied to citrus fruits postharvest preservation, two factors (temperature and time) and five level uniform experiments were carried out to study the effect of different heat treatment on the storage quality, mildew during the storing at room temperature, and the lethal effect on spores suspension ofPenicilliumitalicumandPenicilliumdigitatum. The results showed that the optimum hot water treatment conditions of Gannan navel orange was 50 ℃, 5 min. Under this heat treatment conditions, the respiration rate of navel orange was the lowest of 42.89 mgCO2/(kg·h); no mildew during 20 days storage period at room temperature; pathogenic spore suspension was treated by heat and peel of Gannan navel orange. The results suggested that Gannan navel orange peel composition and hot water had combinative inhibiting and killing effect on pathogenic spores, better than the control group. Moreover，pathogenic spore cell membrane was damaged obviously showing with Hoechst 33342/PI fluorescence double staining. The conclusion is that hot water treatment (50 ℃, 5 min) was feasible to preserve postharvest Gannan navel orange.

Gannan navel orange; hot water treatment; preservation effect; pathogenic fungi

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701042

碩士研究生(吳國平副教授為通訊作者,E-mail：jdwgp@163.com)。

江西省教育廳青年基金項目(GJJ14315)；廣東省農業科學院農業部功能食品重點實驗室開放基金項目(201351)；江西農業大學大學生創新創業訓練計劃項目(DC201336)

2016-05-25，改回日期：2016-07-02