啤酒發酵過程中酵母環境壓力應答機制研究進展

王金晶，楊靜靜，丁華建，鄭梅瑩，李崎*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 2 (江南大學 釀酒科學與工程研究室,江蘇 無錫,214122)

啤酒發酵過程中酵母環境壓力應答機制研究進展

王金晶1,2，楊靜靜1,2，丁華建1,2，鄭梅瑩1,2，李崎1,2*

1(江南大學 生物工程學院，工業生物技術教育部重點實驗室,江蘇 無錫,214122) 2 (江南大學 釀酒科學與工程研究室,江蘇 無錫,214122)

在啤酒發酵過程中，生產高質量的啤酒要求相應的工藝條件以保證啤酒的質量以及酵母的活力。大多數的風味物質都是在后熟的過程中形成，在后熟過程中，啤酒酵母暴露在不同的壓力條件下，包括滲透壓、pH、酒精濃度、營養以及溫度等。在長期的馴化過程中，啤酒酵母自身表現出各種壓力應答機制以適應啤酒發酵過程。本論文概述了啤酒發酵過程中啤酒酵母受到的壓力，重點探討了啤酒酵母在后酵期經受的壓力以及壓力應答的分子機制，并對如何提高啤酒酵母環境壓力應答能力進行了展望。

啤酒發酵; 酵母; 環境壓力; 全局應答系統

啤酒酵母是啤酒釀造的靈魂，啤酒的風味主要由啤酒酵母代謝產生的風味物質綜合形成，啤酒酵母的質量控制決定了啤酒的質量。現代啤酒高濃度釀造的工業發酵條件給酵母不同于實驗室培養的條件，造成啤酒酵母自溶的壓力貫穿了整個啤酒釀造過程，主要包括發酵初期的高糖、高滲透壓，發酵過程中的氧化壓力，以及發酵后期尤其是后酵期來自于酒精的毒性和營養缺乏的壓力[1]。當酵母細胞感受到壓力或者對細胞來說產生一種毒性刺激而無法抵御時，細胞開始自我降解。研究指出，當超過5%酵母發生自溶時，啤酒質量將發生不可挽回的破壞。啤酒酵母(Saccharomycespastorianus)自溶將會給啤酒的風味、品質帶來重大影響，包括影響啤酒風味，影響啤酒膠體穩定性，影響泡沫性能以及引起微生物污染等[2-4]。因此，在啤酒生產過程中，不希望發生酵母自溶或希望盡量的減少發生酵母自溶。

啤酒酵母作為啤酒釀造的重要因素，其環境壓力應答對啤酒發酵過程的正常進行有著舉足輕重的作用。本文綜述了啤酒酵母在發酵過程中的環境壓力應答以及相關的應答機制，以期為提高啤酒品質提供理論依據和參考。

1 啤酒酵母抗氧化應力應答

盡管酵母屬于兼性厭氧微生物，在啤酒發酵過程中，氧氣仍然對啤酒酵母的代謝起到非常重要的作用。在發酵初期通氧是必須的，充足的氧氣能夠保證酵母的生長，同時也保障了細胞膜脂類的合成，以及甾醇和不飽和脂肪酸的合成[1]。但是氧氣的存在也是造成酵母以及啤酒老化的最主要原因，其中最主要的因素即活性氧自由基(ROS)[5]。

啤酒中老化物質的形成機理復雜，老化物質種類繁多。啤酒酵母代謝過程中所形成的內源性抗氧化物質對啤酒的風味穩定性具有重要作用。不同的啤酒酵母菌株的抗氧化能力取決于其細胞內的抗氧化分子的多少，這些抗氧化分子包括了一些非酶分子如谷胱甘肽(GSH)、金屬硫蛋白、海藻糖、泛醌、麥角固醇和酶分子如過氧化氫酶、細胞色素c過氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷氧還蛋白、谷胱甘肽還原酶、硫氧還蛋白還原酶等[1]。不論是在實驗室小規模發酵或者工業生產過程中都發現了啤酒酵母能夠在氧化壓力下非常迅速的應答環境壓力。CLARKSON等人[6]發現在發酵過程中加氧或除氧會造成胞內錳超氧化物歧化酶以及過氧化物酶活力的變化。WALKER等[7]人報道隨著酵母接種的進行，過氧化物酶活性提高。GSH作為一種非常出色的抗氧化劑，其在氧脅迫下的生物合成機制一直是研究人員關注的熱點。GIBSON等人[1]發現在發酵過程中釀酒酵母胞內GSH含量受氧濃度調控。GSH由GSH1和GSH2基因催化合成，研究發現，酵母的GSH的合成與二氧化硫、硫化氫合成途徑密切相關。通過對啤酒酵母GSH合成過程中GSH1基因的調控，發現在啤酒酵母中過表達GSH1基因能夠提高啤酒酵母的GSH合成量，提高啤酒酵母的抗氧化能力[8-9]。在啤酒發酵后期，酵母細胞中抗氧化基因轉錄增加，使抗氧化物質得到積累以抵抗氧自由基對酵母帶來的壓力[10]。研究發現，啤酒發酵后期，啤酒酵母中與抗氧化壓力相關的途徑中，谷胱甘肽合成途徑中GPX1，GRX6，GSH1，GLR1幾個重要基因的表達量明顯上調；超氧游離基消除途徑中SOD1，CTT1，CTA1基因發生了明顯上調，僅有SOD2基因水平發生輕微下調；其他抗氧化壓力相關基因PRX1，SNT2，ERV1，YAP1，YRR1，AFT2都發生了不同程度的上調[11-12]。

海藻糖是一類非常重要的壓力保護劑，在酵母中含量非常高，可達到細胞干重20%以上。海藻糖的抗氧化壓力主要體現在其保護細胞組分免受ROS破壞。研究發現，與海藻糖合成TPS1、TPS2、TSL1、TPS3)與降解(NTH1、NTH2、ATH1)相關的基因受STRE元件的調控[13-14]。在酵母自溶過程中，與海藻糖降解相關基因ATH1和NTH1的表達水平發生了相應的下調，使海藻糖降解速度減慢，從而保證了海藻糖在啤酒酵母細胞中的積累，保護細胞不受發酵液中的氧自由基侵襲[15]。當細胞缺乏鋅指轉運激活因子Msn2p和Msn4p時，細胞將無法合成海藻糖。另外，在發酵后期，缺氧條件下控制酵母細胞壁合成相關的基因如CWP1和CWP2表達上調，以應答缺氧條件的環境壓力[1]。

2 啤酒酵母抗滲透壓力應答

對啤酒酵母而言，滲透壓力貫穿整個發酵過程，從發酵起始的高濃度糖至發酵后期的高濃度酒精都給啤酒酵母帶來一定的滲透壓力。現代啤酒工業生產中的高濃釀造技術要求啤酒酵母具有較好的抗滲透壓能力。而酵母的滲透壓調節能力可以分為自身具有的物理抗滲透能力以及長期適應環境形成的適應性抗滲透能力。啤酒酵母的物理抗滲透能力因菌株而異，并且穩定期細胞抗滲透能力較對數期好[1]。啤酒發酵后期，酵母處在一個低糖高酒精環境中，來自酒精的壓力為細胞造成了一定的滲透壓力。研究表明，酵母細胞壁的結構組成會影響細胞的抗滲透能力，增加細胞壁中葡聚糖、甘露聚糖含量能夠有效提高酵母的抗滲透壓能力[16-17]。BURATTINI及CAVAGANA等人發現酵母葡聚糖的代謝與細胞壁增厚存在一定的關聯性[18-19]。葡聚糖合成酶包括兩個亞單元，分別膜結合催化亞基以及GTP結合調節亞基，其中FKS1、FKS2和FKS3基因被認為是催化亞基的編碼基因，而RHO1、ROM2、WSC3、WTL1、LRE1、ZDS1等基因則屬于調節亞基的編碼基因[20]。在啤酒酵母的選育過程中，我們基于啤酒酵母細胞壁組成的特點，通過紫外誘變篩選獲得的酵母采用壓力抗性平板復篩，最終獲得了抗壓能力明顯提高的啤酒酵母菌株。分析該啤酒酵母誘變菌株的細胞壁成分，發現其葡聚糖含量是出發菌株的1.5倍以上，甘露聚糖含量也有了一定量的提高，其總多糖的含量比出發菌株提高了近49%。酵母細胞壁多糖的含量的增加有效地提高了啤酒酵母對外界滲透壓的抗逆能力[21]。

酵母細胞中存在著多種信號傳遞系統，其中由蛋白激酶C(Pkc1p)介導的MAPK級聯系統在維持細胞壁完整性方面起著重要的作用，因此被稱為酵母細胞壁完整性(CWI)信號途徑。MAPK級聯系統的核心是由蛋白激酶C的磷酸化觸發了下游一系列的磷酸化過程，使該系統處于激活態，進而介導細胞內一系列生物學變化。CWI途徑為酵母細胞提供一種加強和修復細胞壁損傷以抵御環境壓力的方式。在細胞中表達的Mid2p、Wsc1p、Mtl1p等感應因子感受到環境壓力變化后會將信號傳遞給Rom2p，然后至Rho1p，Rho1p激活Pkc1蛋白激酶，由Pkc1再激活MAPK模塊；同時，Pkc1p使Bck1p磷酸化并將信號傳導給Mkk1和Mkk2p，進一步激活Slt2/Mpk1[22]。CWI途徑作為細胞中最重要的應激反應途徑之一，其感知因子WSC1、MID2及MTL1在啤酒酵母感受到壓力過程中表達發生下調，而其他基因如BCK1、RLM1及SKN7等則發生了不同程度的上調，進而引起酵母細胞的應激反應[15]。

適應性抗滲透能力來自于對環境的適應，尤其明顯的是細胞的大小。當滲透壓增大時，酵母細胞迅速的變小，而當壓力消失之后，細胞會逐漸恢復原來的大小。LEVIN等人發現這一現象與HOG1/MAP激酶途徑相關，細胞壁上的Wsc1p感受到壓力時，HOG途徑中的相關酶被激活，調整細胞壁的流動性以改變細胞的大小。在啤酒酵母的自溶過程中，HOG途徑中SLN1，HKR1，MSB2，YPD1，SSK1，SSK2/22，PBS2，STE50基因表達發生明顯上調，表明啤酒酵母在自溶過程中細胞抗滲透壓力能力被激活[12]。在酵母細胞膜上存在一個水通道蛋白，是跨膜蛋白家族中主要內在蛋白(MIP)中最大的一個蛋白，它還包含了質膜內在蛋白(PIPs)和液泡膜內在蛋白(TIPs)。而水通道蛋白編碼基因AQY1和AQY2與酵母細胞的適應性抗滲透壓能力有著非常密切的關系[23]。近期研究發現在某些啤酒酵母中AQY2基因并沒有功能，而只需要有AQY1基因即可以執行水通道蛋白功能。適應性抗滲透壓能力的獲得對啤酒酵母釀造后期適應發酵環境提供了便利。

3 酵母抗酒精毒性壓力應答

在啤酒釀造過程中，麥汁中的酒精濃度不斷升高，對酵母來說就是暴露在毒性越來越強的酒精溶液中。在正常的發酵情況下，發酵結束時，酒精濃度大約在3%～6%，但是在高濃釀造中，發酵結束時酒精的濃度會達到10%以上[24]?，F今，因高濃度釀造具有提高啤酒產量、減少能耗、降低成本的獨特優勢，而成為啤酒釀造中一種標準的釀造方法，。有報道稱高濃釀造生產的啤酒有更好的風味和穩定性[25]。然而高濃釀造很大程度是建立在損害啤酒酵母本身的生理狀態和后續發酵性能的基礎上的。在現代高濃釀造生產中，發酵結束時酒精濃度可高達16% vol，遠遠超過了12 P麥汁發酵產生的3%～6% vol的酒精度，由此導致細胞活力減弱，后續發酵能力降低。

酒精對酵母細胞膜的破壞最嚴重，其中主要的影響包括限制細胞的生長，限制細胞的大小，使細胞活力下降，呼吸能力下降，葡萄糖同化能力減弱，發酵性能下降，脂肪的改造，質子穿膜能力的喪失，膜的通透性增加，膜內pH值下降等[26]。有許多研究報道指出酵母細胞膜的變化是細胞酒精耐受的重要原因。酵母細胞通過增加膜的不飽和度以增加其流動性來抵抗酒精濃度的提高。研究發現，油酸是抵制酒精最重要的脂肪酸之一。釀酒酵母質膜中最主要的游離脂肪酸是軟脂酸(C16∶1)和油酸(C18∶1)，是由兩者各自的飽和脂肪酸分別去飽和化所形成的。該反應由去飽和酶(OLE1基因編碼)催化進行，在發酵過程中OLE1基因表達上調使不飽的脂肪酸含量增加，增加了細胞膜的流動性[27]。近年來的研究進一步證明了油酸(C18∶1)是酵母能夠抑抗酒精毒性的主要因素之一[28]。這種不飽和脂肪酸含量上升、相應的飽和脂肪酸含量下降，同時發生在上面發酵酵母和下面發酵酵母中。但是，是否僅因為膜的脂肪酸組成發生了變化使酒精耐受性提高而導致發酵性能的提高，或者僅因為營養條件的改善而導致發酵性能提高還無從論證。另外，有研究指出海藻糖的積累與酒精耐受機制也有一定的聯系，ALEXANDRE等[29]報道將酵母細胞置于酒精濃度為7%的壓力環境下，海藻糖合成基因表達將會上調。

通過轉錄組學分析發現在發酵后期，一些抗氧化相關的基因表達水平上調。JAMES等發現在啤酒發酵過程中，發酵3 d或8 d后，不管是否處于無氧狀態，有9個與抗氧化相關的基因表達上調。但是，這種抗氧化基因的表達上調是由于其它的壓力存在或者是直接暴露于酒精的壓力下所造成的還不明確[27, 30]。將酵母暴露在7%的酒精中30分鐘后發現CTT1基因的表達量增加了12倍[29, 31]。

4 啤酒酵母抗饑餓壓力應答

麥汁是一個復雜的生長環境，主要包含碳水化合物(90%麥汁固形物)和含氮物質(5%麥汁固形物)，還有一部分磷酸鹽、無機離子、脂類、有機酸、多酚和核酸衍生物。啤酒酵母對可發酵糖和可利用氮源耗盡的反應就是進入穩定期。進入穩定期后，酵母不再經歷復制而停留在G0期，進入沉默期。沉默是細胞對抗營養消耗的一種普遍的現象。

細胞的沉默機制可以在營養缺乏的狀態下保護細胞。這種脅迫應答途徑通常包括細胞分裂停止，細胞壁增厚，細胞的孔洞減少，細胞壁甘露聚糖蛋白結構變化以增加對抗裂解酶的能力，胞內蛋白酶積累，液泡中多磷酸鹽積累，貯存性碳水化合物增加，以及抗壓力性能加強[31-32]。這些改變使沉默期的細胞對外界的環境變化敏感性降低，以保證細胞能夠在營養不足的情況下抵御某些特定的壓力。隨著營養物質的消耗，細胞進入到穩定期時，胞內糖元和海藻糖的含量也發生了相應的變化。研究發現，在發酵后期，控制糖元以及海藻糖合成的基因表達水平明顯上調[33-34]。由于氮缺乏會誘導酵母細胞的全局應答即GSR現象，因此推測海藻糖的積累和降解是一個壓力應答單元(STRE)介導的氮源缺乏應答途徑。另外，海藻糖也有調節糖酵解的作用。研究證實海藻糖-6-磷酸抑制己糖激酶的活性，限制了糖酵解途徑中糖的同化作用，在發酵起始調控中具有重要的用，而這個途徑具體的調控機制至今也沒有研究。

5 酵母的全局壓力應答系統

現代啤酒發酵過程中，酵母是通過壓力泵送到發酵罐中的，在發酵過程中需要經歷一系列的環境壓力變化。面對這一系列不同的壓力，酵母具有一套完整的壓力應答系統，各個代謝途徑相互協調統一，并具有相對的穩定性，無論是分解代謝還是合成代謝，均能做到既不過量，也不缺少。當外界條件發生變化并足以對細胞產生影響時，這套靈敏、可塑性強和精確性高的自我代謝調節系統就會適時作出調控，從而保證細胞極其復雜的生化反應能準確無誤、有條不紊地進行。這種調控常表現為多水平的協同作用，即稱為全局應答系統(GSR)。

GSR可被一系列環境因素激活，包括氧化、pH、熱力、滲透壓以及氮饑餓。GSR被認為是一種抗逆機制，從進化角度來看，這種應答機制允許酵母適應不良環境，以保持繁殖能力。受到壓力脅迫時，GSR機制被激活，大約200個基因的表達上調，同時相應的蛋白表達量也增加，參與到相應的細胞應答途徑中[1]。這些基因的表達是依賴于被誘導基因的啟動區中CCCCT基因序列來啟動的，這些序列被稱為是壓力應答單元(STRE)，它首先是在壓力誘導細胞質過氧化氫酶編碼基因CTT1的表達及其伴侶蛋白編碼基因DDR2的表達中被發現的[35]。后續研究發現與STRE單元的激活、相關的基因誘導與兩個鋅指轉運激活因子(Msn2p和Msn4p)相關[36-37]，在一系列壓力條件下會被激活。GSR是一個短暫的過程，在壓力消失后，Msn2p會被快速降解，所表達的蛋白也會逐漸被降解對細胞的基因轉錄水平變化的研究近年來被廣泛應用于酵母應對各種環境壓力的耐受性機制研究中。同時，自2009年NAKAO等人完成了第一株啤酒酵母(S.pastorianus)的全基因組測序工作[38]之后，明確了工業啤酒酵母的來源，為進一步研究啤酒酵母分子機制提供了方便。基于基因組序列的microarray研究發現了許多工業啤酒酵母存在獨特的抗逆機制。通過傳統育種方式，SANCHEZ等人將上面發酵酵母的基因與下面發酵酵母的基因進行了融合，獲得了1株耐高溫、高滲透壓等壓力因素的新型工業啤酒酵母菌株[32]。

6 結語

我國作為啤酒生產大國，2014年統計結果顯示中國的啤酒產量首次出現了下劃趨勢，并且這一趨勢在這一兩年內持續發生，在這個產量已無法主導市場利潤的特殊時代，啤酒的質量成為制約企業行業發展的重要因素，而啤酒酵母的質量直接影響著啤酒的質量。了解啤酒酵母壓力應答機制，從源頭控制酵母質量，提高酵母抗壓能力，有效解決國內啤酒行業酵母使用代數少，生產成本高的問題。

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Research progress in yeast global stress response during beer brewing

WANG Jin-jing1,2, YANG Jing-jing1,2, DING Hua-jian1,2,ZHENG Mei-ying1,2,LI Qi1,2*

1 (The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China)2 (Lab of Brewing Science and Technology, School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

In beer brewing, production of beer with high quality requires relative producing techniques to ensure the quality of beer and the yeast. Most of the flavor compounds are produced during post fermentation process, wherein brewer’s yeasts are exposed to various kinds of stress such as osmotic pressure, pH, alcohol, nutrition and temperature. In the process of long term domestication, brewer’s yeasts have developed different stress response mechanisms to adapt the beer brewing process. The different stresses experienced by brewer’s yeast during beer brewing especially the post fermentation process are reviewed in this paper, and the stress response mechanisms of brewer’s yeast are discussed. Meantime, the methods for improving the stress response ability of brewer’s yeast are discussed.

beer brewing; brewer’s yeast; global stress; global stress response

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701044

博士，副教授(李崎教授為通訊作者,E-mail：liqi@jiangnan.edu.cn)。

國家自然科學基金(31301539)；國家自然科學基金(31271919)；國家自然科學基金(31571942)

2016-07-08，改回日期：2016-08-04