基于石墨烯量子點的熒光探針應用于抗壞血酸檢測的研究

趙麗敏, 陳麗妮, 趙書林*

(1. 安陽市質量技術監督檢驗測試中心， 河南 安陽 455000；2. 廣西師范大學化學與藥學學院 教育部藥用資源化學與藥物分子工程重點實驗室， 廣西 桂林 541004)

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基于石墨烯量子點的熒光探針應用于抗壞血酸檢測的研究

趙麗敏1, 陳麗妮2, 趙書林2*

(1. 安陽市質量技術監督檢驗測試中心， 河南 安陽 455000；
2. 廣西師范大學化學與藥學學院 教育部藥用資源化學與藥物分子工程重點實驗室， 廣西 桂林 541004)

基于石墨烯量子點(GQDs)的熒光性能建立了一種非標記熒光方法，用于靈敏和選擇性測定抗壞血酸(AA)。GQDs溶液在紫外光激發下發出很強的藍色熒光，當向溶液中加入AA后，GQDs溶液的熒光被猝滅。猝滅機理可能為在弱酸性介質中，AA與GQDs發生氧化還原反應，AA轉移電子給GQDs。熒光猝滅強度與AA濃度在5.0×10-6～7.5×10-5mol/L范圍內呈良好的線性關系，檢出限低至1.0×10-6mol/L。該體系成本低、操作簡單，并且在多種可能干擾的物質存在下對AA表現出很高的選擇性。本方法應用于生物樣品中AA的檢測，回收率在95.2%～115.3%之間。

石墨烯量子點； 熒光探針； 非標記方法； 抗壞血酸

1 引 言

石墨烯量子點(GQDs)是最近發現的粒徑小于100 nm具有0維結構的石墨烯納米片[1-3]。與石墨烯類似，GQDs也有大的表面積和π-π共軛網狀結構。作為一種新的碳納米熒光材料，GQDs由于其優越的光穩定性、優良的光學和電化學性能、高的熒光活性、抗光漂白能力和低細胞毒性[4-8]，已經在化學、材料、物理學和生物學領域引起較大關注并成為當前的研究熱點之一，目前已用于氯離子[9]、磷酸[10]、三磷酸腺苷[11]、三價鐵離子[12]、過氧化氫[13]、葡萄糖[14-15]、免疫球蛋白G[16]、生物巰基化合物[17-18]、脫氧核糖核酸[19]和胰蛋白酶[120]的檢測，以及用于藥物釋放[21]和生物成像[22-24]等領域。

抗壞血酸(AA)是一種重要的抗氧化劑，在人體平衡氧化壓力中起重要作用。AA在人體液中存在的濃度相對較高，例如，人血液中AA的濃度為6～15 μg/mL[25]。AA是治療壞血病、藥物中毒、肝臟疾病、過敏反應和動脈粥樣硬化的藥物，并能幫助促進健康細胞的發展、鈣的吸收和正常組織的生長。在制造果汁和飲料時，AA也作為一種抗氧化劑使用。因此，AA的檢測對制藥、臨床和食品工業均具有重要意義[26]。目前檢測AA的方法主要有電化學方法[27]、化學發光法[28]、高效液相色譜法[29]、分光光度法[30]、毛細管電泳法[31]和熒光分析法[32]等。電化學方法由于靈敏度高，是檢測AA的主要方法。但是，與AA具有相似還原性質的分子如尿酸(UA)和多巴胺(DA)對該方法造成的干擾較大，而且AA的氧化產物會吸附在電極表面，影響體系的穩定性和重現性。熒光分析法具有簡單、方便和快速等優點。 因此，本工作以GQDs作為熒光探針，建立了基于GQDs的熒光猝滅檢測AA的新方法。

2 實 驗

2.1儀器與試劑

LS-55型發光光度計(Perkin-Elmer，USA)；Cary 60型紫外可見分光光度計(Agilent Technologies, USA)；PHSJ-4A型pH計(上海精密科學儀器有限公司)；XW-80A型漩渦振蕩混合器(上海醫科大學儀器廠)；TGL-16G-A型高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)等；SZCL-3B數顯智能控溫磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；78-1磁力加熱攪拌器(常州國華電器有限公司)；BS 110S電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)；FL3-P-TCSPC時間分辨熒光儀(HORIBA JOBIN JVON，France)；JEM-2100F場發射透射電子顯微鏡(JEOL)；Multimode 8原子力顯微鏡(Bruker，USA)。

抗壞血酸(AA)、人血清白蛋白(HSA)購于美國Sigma-Aldrich公司；多巴胺(DA)購于Alfa Aesar公司；D-色氨酸(D-Trp)、DL-蘇氨酸(DL-Thr)、L-α-丙氨酸(L-α-Ala)、L-組氨酸(L-His)、D-絲氨酸(D-Ser)、L-賴氨酸(L-Lys)、L-亮氨酸(L-Leu)、L-苯丙氨酸(L-Phe)由中國醫藥(集團)上海化學試劑公司提供；尿酸(UA)購于上海生工生物有限公司；半乳糖(Gal)、果糖(Fru)、甘露糖(Man)購于比利時Acros Organics公司；檸檬酸購于廣州化學試劑廠。

實驗所用其他化學試劑均為國產分析純，實驗用水為18.2 MΩ·cm的超純水。

實驗所用的緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液(1.0×10-2mol/L，pH 4.0～7.5)：稱取0.78 g NaH2PO4·2H2O，溶于450 mL超純水中，定容至500 mL，用H3PO4和NaOH溶液調節pH值。

2.2人血清樣品的預處理

人血清樣品取自桂林市第五人民醫院。取200 μL人血清，置于1.5 mL離心管中，加入400 μL乙腈，漩渦震蕩混合5 min，在高速冷凍離心機上以1.2×104r/min的速度離心20 min，取上層清液，用氮氣吹干，殘留物用1 000 μL超純水溶解，試液置于冰箱中4 ℃保存備用。

2.3GQDs的合成

GQDs的合成方法參照文獻[33]。稱取2.0 g檸檬酸加入試管中，加熱至200 ℃，當檸檬酸全部融化后開始計時。20 min后，溶液顏色變為橘紅色。在磁力攪拌作用下，將橘紅色液體用滴管逐滴加入100 mL 含10 mg NaOH的溶液中，用HCl調節pH至7.0，得到GQDs水溶液，濃度為14 mg/mL，于4 ℃下避光保存。

2.4實驗方法

在一系列0.6 mL的離心管中，依次加入10 μL 1.4 mg/mL GQDs、10 μL不同濃度的AA以及80 μL pH=4.5的磷酸鹽緩沖液，充分混勻后，在37 ℃下孵育4 h。冷卻后，采用LS-55型發光光度計(Perkin-Elmer，USA)記錄樣品在453 nm處的熒光強度，設置電壓為750 V，激發、發射狹縫寬度均為15 nm，掃描速度為1 000 nm/min，激發波長為367 nm。

3 結果與討論

3.1GQDs的表征

所合成的GQDs的透射電子顯微鏡和原子力顯微鏡圖像、紅外光譜、紫外吸收光譜和熒光光譜均參見文獻[34]。本實驗合成的GQDs的粒徑為17～21 nm，平均厚度為1.5 nm。GQDs表面存在羧基和羥基，這些官能團賦予了GQDs優良的水溶性。GQDs在紫外區有較強的吸收，在360 nm處有一吸收峰，并且在365 nm紫外燈照射下可觀察到藍色熒光。GQDs具有對稱的激發和發射光譜，其最大激發波長為367 nm，最大發射峰波長為453 nm。

3.2熒光猝滅機理

GQDs的熒光猝滅機理如圖1所示。GQDs本身在激發光照射下發出藍色熒光。已有研究證明，氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)能被AA還原[35]。因為本實驗合成的GQDs表面帶有—COOH，與GO具有相似的表面基團，因此加入AA后，AA與GQDs發生氧化還原反應，AA被氧化為脫氫抗壞血酸(dehydro-AA)并轉移電子給GQDs，GQDs的熒光被猝滅。

圖1 基于GQDs的熒光傳感體系檢測AA的原理圖

3.2.1 紫外吸收光譜

猝滅機理也可通過紫外光譜來證明。如圖2所示，加入AA后，GQDs在360 nm處的特征峰消失，說明GQDs與AA反應生成了其他物質。

圖2 AA加入前后的GQDs的紫外-可見吸收光譜

Fig.2 UV-Vis absorption spectra of GQDs in the absence and presence of AA

3.2.2 熒光壽命

為了進一步證實AA對GQDs的猝滅機理，實驗測定了體系的熒光壽命。圖3是AA加入前后GQDs的熒光衰減曲線。

圖3 AA加入前后的GQDs的熒光衰減動力學曲線

Fig.3 Fluorescence decay curves of GQDs in the absence and presence of AA

表1是GQDs猝滅前后的熒光壽命值。從表中可以看到，AA加入前后，體系的熒光壽命發生了明顯變化，說明猝滅過程是動態猝滅[36-37]。動態猝滅是碰撞過程，因此AA猝滅GQDs的熒光機理可解釋如下：

GQDs-+AA+(還原態的電子轉移)[38]

激發態分子*GQDs遇到AA，兩者相互作用導致電子和能量的轉移，最終導致*GQDs的熒光猝滅。

表1 GQDs猝滅前后的熒光壽命

3.3可行性驗證

為了考察本方案的可行性，我們對GQDs與AA反應前后的樣品溶液進行了熒光光譜掃描，如圖4所示。AA加入后，GQDs 在453 nm的熒光強度降低，熒光被猝滅了79.6%，說明該方法能用于AA的檢測。

圖4 AA加入前后的GQDs熒光光譜

Fig.4 Fluorescence spectra of GQDs in the absence and presence of AA

3.4AA與GQDs作用時間的優化

實驗考察了AA加入后，GQDs溶液的熒光強度隨時間的變化，結果如圖5所示。從圖中可見，體系的熒光強度隨時間的延長而逐漸下降，在大約4 h以后，熒光強度降低速度減慢，之后熒光強度變化不大。為了保證測定的靈敏度同時縮短分析時間，實驗選擇4 h作為AA與GQDs的作用時間。

圖5 體系熒光強度隨時間的變化曲線

Fig.5 Time-dependent fluorescence response of the proposed method

3.5pH值的優化

實驗以磷酸鹽為緩沖液，考察其pH值對AA猝滅GQDs熒光的影響，結果如圖6所示。GQDs本身的熒光會受pH的影響。當pH在4.0～7.5之間時，GQDs的熒光隨pH的升高而增強，但體系在pH=4.5時有最高的信噪比。因此，實驗選擇pH=4.5的磷酸鹽緩沖液作為AA與GQDs的反應緩沖液。

圖6 pH值對體系熒光強度的影響

Fig.6 Fluorescence response of the proposed method at different pH values

3.6線性范圍和檢出限

在上述優化的條件下，實驗對一系列不同濃度的AA進行了檢測，實驗結果如圖7所示。從圖中可以看出，隨著AA濃度的增大，體系在453 nm處的熒光強度逐漸降低，并且熒光強度值的比值F0/F(F0為GQDs的熒光強度，F為加入AA之后體系的熒光強度)與AA的濃度在5.0×10-6～7.5×10-5mol/L范圍內呈現良好的線性關系，其線性方程為F0/F=0.0537C+ 0.7467，R=0.997 1(C為AA的濃度，單位10-6mol/L)，檢測限(3σ，σ=S0/S，S0為空白溶液多次測量的標準偏差，S為標準曲線的斜率)為1.0×10-6mol/L。我們將本方法與其他檢測AA的方法做了對比，見表2。從表2中可以看出，該方法與其他方法相比具有較高的靈敏度。

圖7 (a)檢測體系在不同濃度AA存在下的熒光光譜；(b)熒光強度比值對AA濃度之間的線性曲線。

Fig.7 (a) Fluorescence emission spectra of the sensing system after addition of various amounts of AA (a-j: 0, 5.0, 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 500×10-6mol/L). (b) Relationship between the florescence quenching and the concentration of AA.

表2 檢測AA的方法對照

為了考察該方法的精密度，實驗將7.5×10-5mol/L AA與GQDs反應進行了11次平行測定，得到熒光強度的相對標準偏差(RSD)為3.4%。

3.7特異性考察

為了考察所建立方法的特異性，實驗選用幾種糖類以及HSA、尿素(Urea)和幾種氨基酸作為對照樣品進行分析。GQDs的濃度為0.14 mg/mL，AA的濃度為7.5×10-5mol/L，其他作為干擾物質的濃度均為7.5×10-5mol/L。實驗結果如圖8所示。從圖中可以看出，只有AA的加入能引起信號的明顯變化，其他物質均不存在干擾，特別是DA、UA這兩種與AA有相似電化學性質的物質，也不存在干擾。因為在本實驗中，AA與GQDs的反應介質為pH=4.5的磷酸鹽緩沖液，在這個pH值下，DA、UA均不干擾AA的測定。

圖8 干擾存在下的信號響應圖

3.8實際樣品分析

為了考察本研究所建立的方法是否可用于實際樣品的檢測，實驗對人血清樣品進行了分析。

表3 人血清樣品中AA的測定

從醫院取的血清樣品按照2.2節方法進行處理，在稀釋50倍后的血清中進行加標實驗，實驗結果如表3所示。從表中可以看到，人血清中AA的加標回收率在95.2%～115.3%范圍內。

4 結 論

建立了一種基于GQDs熒光猝滅檢測AA的新方法，該方法操作簡便，靈敏度高，檢出限低至1.0×10-6mol/L，特異性強，一些糖類和氨基酸的存在均不干擾AA的測定，甚至是與AA有相似電化學性質的DA、UA的存在對AA的檢測也沒有影響。本實驗用到的所有原料都價廉易得且不需要任何修飾過程，GQDs相對于其他量子點的合成更簡單而且具有低毒性，有望應用于生物體內生物活性物質的檢測。

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趙麗敏(1987-)，女，河南安陽人，助理工程師，2014年于廣西師范大學獲得碩士學位，主要從事新型碳納米發光材料、化學與生物傳感器、石油化工等方面的研究。

E-mail: lynuzhaolimin_ok@126.com趙書林(1957-)，男，湖南慈利人，博士，教授，2006年于四川大學獲得博士學位，主要從事納米材料、化學與生物傳感器、微流控芯片分析、毛細管電泳分析、單細胞分析及藥物活性成分的篩選等方面的研究。

E-mail: zhaoshulin001@163.com

Detection of Ascorbic Acid by Fluorescence Probe Based on Graphene Quantum Dots

ZHAO Li-min1, CHEN Li-ni2, ZHAO Shu-lin2*

(1.QualityandTechnicalSupervision,InspectionandTestingCenter，Anyang455000,China;
2.KeyLaboratoryforTheChemistryandMolecularEngineeringofMedicinalResourcesofEducationMinistry,
CollegeofChemistryandPharmacy,GuangxiNormalUniversity,Guilin541004,China)
*CorrespondingAuthor,E-mail:zhaoshulin001@163.com

A label-free fluorescence method based on the fluorescence property of graphene quantum dots (GQDs) was developed for sensitive and selective detection of ascorbic acid (AA). The initial strong blue fluorescence of the GQDs in aqueous solution was effectively quenched upon addition of AA. The quenching mechanism may involve transfer of electrons from AA to GQDsviathe redox reaction of AA and GQDs in weak acid solution. The quenching efficiency was linearly proportional to the concentration of AA within the range of 5.0×10-6-7.5×10-5mol/L with a low detection limit down to 1.0×10-6mol/L. The proposed sensing system is simple and low-cost with facile experimental operations, and has a high selectivity for AA over a number of possible interfering species. Additionally, this method was successfully applied to the determination of AA in biological samples with satisfactory recoveries (95.2%-115.3%).

graphene quantum dots; fluorescence probe; label-free method ; ascorbic acid

2016-06-23；

2016-09-23

國家自然科學基金(21305020,21175030)； 廣西自然科學基金(2014GXNSFBA118041)資助項目 Supported by Natural Science Foundation of China(21305020,21175030); Natural Science Foundation of Guangxi Province of China(2014GXNSFBA118041)

1000-7032(2017)01-0124-08

O482.31

A

10.3788/fgxb20173801.0124