外源過氧化物酶在畢赤酵母中的優化表達

楊靜+吳慧+潘一展

摘要：為提高外源過氧化物酶基因在畢赤酵母中的表達量，對甲醇畢赤酵母誘導表達培養基進行優化，在培養基中添加0.5 g/L高鐵血紅素，每12 h補加100%甲醇至終濃度為0.5%，待酵母生長量達到最大值時加入0.5 mL/L微量元素混合物。結果表明，優化后培養基表達量是普通培養基的10.6倍，研究為后期外源蛋白進入發酵罐生產提供了理論依據。

關鍵詞：過氧化物酶基因；畢赤酵母；優化培養基；血紅素；微量元素

中圖分類號：Q814文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0051-02

近年來，酶工程在生物技術領域得到很大發展，過氧化物酶被應用于疾病診斷及治療、農作物品種選育及病蟲害防治、染料中脫色劑生產[1]、有機物和聚合物合成[2]、農業廢棄物處理[3]等領域。但是，天然酶在開發和應用中受到一定限制。本研究采用基因重組技術生產酶，研究外源蘿卜過氧化物酶在甲醇畢赤酵母中的表達，旨在探討高表達量的優化培養條件。

1材料與方法

1.1材料

菌株：野生型畢赤酵母GS115（GS115）及商丘學院風景園林學院實驗室構建的轉蘿卜過氧化物酶基因（RsPrxl）型畢赤酵母GS115（GSRP25）均由該實驗室保存。

培養基 YPD、BMGY/BMMY組成和配制參見 Invitrogen 公司畢赤酵母操作手冊。

1.2方法

1.2.1菌種活化挑取菌株 GSRP25在 YPD上進行平板劃線培養，分離后，挑取單菌落進行優化誘導培養。

1.2.2轉基因酵母的誘導表達培養挑取2個GSRP25單菌落分別接種于200 mL BMGY培養基中，pH值7.4、26 ℃、0.5%甲醇、225 r/min條件下培養[4]。待D600 nm達到2～3時，靜置，收集菌體分別重懸于20 mL BMMY中和含有0.5 g/L血紅素[5]的20 mL BMMY中培養，每12 h補加甲醇至終濃度為 0.5%，80～90 h間酵母生長量達到最大值，此刻向培養基中加入0.5 mL/L微量元素混合物（0.5 g/L MgCl2，30 g/L FeCl2·6H2O，1 g/L ZnCl2·4H2O，0.2 g/L CoCl2·6H2O，1 g/L Na2 MoO4·2H2O，0.5 g/L CaCl2·2H2O，1 g/L CuCl2和0.2 g/L H2BO3）[6]繼續培養。

1.2.3各項指標的測定每12 h取1 mL菌液，4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，取上清，測D600 nm；采用愈創木酚法[7]測過氧化物酶（POD）活性；采用Bradford的微量法[8]測定可溶性蛋白含量，以小牛血清白蛋白作標準曲線。

1.2.4表達產物聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測POD同工酶活性電泳采用垂直板聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳方法，凝膠采用Lopes等的方法[9]制備，電泳后POD用聯苯胺染色[10]。用天能GIS-1000凝膠成像和分析系統拍照分析。

2結果與分析

2.1不同誘導培養條件下菌體生長狀態

D600 nm代表菌株生長速度，由圖1可知，在2種培養條件下，D600 nm隨時間的延長都有所增加，說明酵母生長比較穩定；但從60 h開始，普通培養基培養的酵母生長速度緩慢，而優化培養基培養的酵母生長速度開始加快；96 h取樣檢測發現，D600 nm達到72.3，比普通培養基培養的酵母增加了近37%。

2.2POD活性的變化

由圖2可見，優化培養基中POD的活性顯著高于普通培養基。轉基因酵母GSRP25在普通誘導培養基條件下，隨著培養時間延長，外源POD的表達量增加不明顯，在培養72 h后趨于穩定。在優化后的誘導表達培養基培養下，隨著培養時間延長，外源POD活性顯著增加，在培養72 h后也慢慢趨于穩定，培養96 h酶活性達到最大值，為 30.9 U/mL，是普通BMMY培養基酶活性的5.9倍；且在培養12 h時，酶活性為4.7 U/mL，幾乎達到普通培養基培養的最大酶活量，說明優化后的誘導表達培養基對酶活性的表達有顯著提高作用。

2.3可溶性蛋白含量變化

巴斯德畢赤酵母作為外源基因表達的酵母宿主，自身分泌的蛋白非常少，外源POD的表達量可以用培養基上清中蛋白含量來衡量。由圖3可知，在普通BMMY培養基條件下，外源蛋白的表達量很低，培養96 h后蛋白含量只有 0.018 g/mL；而優化BMMY培養基培養的外源蛋白表達量很高，培養36 h后蛋白含量迅速增加，培養72 h后蛋白表達量趨于穩定，培養96 h時蛋白表達量達到最大值，為 0.18 g/mL，約是普通 BMMY 培養基表達量的10倍。說明優化BMMY培養基顯著提高了外源POD蛋白的表達量。

2.4SDS-PAGE檢測目的蛋白

已知目的蛋白的分子量約37 ku，由圖4可見，優化后培養基培養目的蛋白的條帶比普通培養基培養的目的蛋白條帶粗、顏色深，說明優化后的培養基誘導表達的蛋白量明顯增多。

3結論與討論

縱觀近年來的文獻報道，提高外源蛋白在巴斯德畢赤酵母中表達量主要有2種途徑，一是優化誘導表達的時間、溫度、pH值、搖床轉速、通氧量、添加微量元素等，如RsPHGPx在1%甲醇、pH值6、28 ℃條件下誘導60 h后得到最大表達量，產率約為102 mg/L[11]。本研究結果與文獻報道一致，在0.5%甲醇、pH值7.4、26 ℃、通氣面積1.5 cm2、225 r/min 條件下，有利于蘿卜過氧化物酶RsPrx1表達。二是結合外源目的蛋白自身的結構特點，利用適合外源蛋白合成的某些誘導劑可以提高重組蛋白的表達量[12]。POD蛋白分子的活性中心含Fe（Ⅲ）-原卟啉Ⅸ（血紅素）輔基，只有在輔基存在的條件下，酶才被稱為全酶，具有活性。所以血紅素是組成POD分子的必需基團，在一定程度上增加血紅素含量，有助于輔基卟啉含量的增加，從而促進POD合成。Gu等報道，利用甲醇畢赤酵母GS115表達外源錳過氧化物酶時，在培養基中添加0.5 g/L血紅素，錳過氧化物酶的表達量增加[5]。有報道表明，在添加0.5 g/L高鐵血紅素的培養基中，錳過氧化物酶在曲霉菌中的表達量增加[13]。Conesa等研究證實，用曲霉菌表達錳過氧化物酶，在培養基中加入0.5 g/L血紅素，過氧化物酶的產量達到100 mg/L[14]。以上研究為本研究中添加0.5 g/L高鐵血紅素提供一定的理論依據。另外，無機鹽或礦物質元素在微生物生長過程中提供了各種重要元素，在配制酵母誘導表達培養基時添加必要的微量元素，有助于酵母生長。其中Fe是目的蛋白POD的分子成分，Na+維持滲透壓，Mg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+可以作為酶的激活劑[15]。表達系統中含有適量的Mg2+、K+、NH+4、Ca2+有利于降低蛋白質合成中的錯讀[16]。因此在本研究中，在優化誘導培養基中添加了各種微量元素。結合以上理論依據，本研究從培養條件、培養基成分入手進行改良，結果表明，在BMMY培養基中添加0.5%甲醇、0.5 g/L高鐵血紅素、0.5 mL/L微量元素，獲得的酶活性達30.9 U/mL，是普通培養基的5.9倍，說明優化后的誘導表達培養基有效提高了外源蛋白的表達量。

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