24個抗瘟基因與哈爾濱市稻瘟病菌互作分析

馬軍韜+張國民+辛愛華+張麗艷+鄧凌韋+王永力+王英+肖佳雷+任洋+宮秀杰

摘要：為明確24個抗瘟基因與哈爾濱市稻瘟病菌的互作情況，應用田間自然感病結合室內接種的方式完成試驗，得出以下結論：（1）2012年有[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]Pi-sh[WTBZ][STBZ] 7個基因對稻瘟病表現免疫，2014年又新增[WTBX][STBX]Pi-km和Pi-5（t）[WTBZ][STBZ] 2個基因表現免疫；（2）Pi-i和Pi-k是植株發病率和葉片發病率上升幅度最大的基因，Pi-t和Pi-z是植株發病率和葉片發病率下降幅度最大的基因；（3）2012年病情指數最高的3個基因為Pi-z、Pi-kh和Pi-k，其病情指數分別為14.04、13.50和12.40，2014年病情指數最高的3個基因為Pi-k、Pi-a和Pi-i，其病情指數分別為65.39、33.64、29.38，葉片發病率與病情指數相關度最高；（4）從室內接種結果看，24個抗瘟基因都存在被稻瘟病菌侵染的風險，其致病性相似系數介于0.20～0.75之間。綜合分析，24個抗瘟基因對稻瘟病的抗性在年際間存在波動，稻瘟病菌的致病性呈集中化趨勢。

關鍵詞：水稻單基因系；抗瘟基因；稻瘟病菌；病情指數

中圖分類號： S435.111.4+1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0164-05

哈爾濱市是北方粳稻主產市之一，年種植面積超過 60萬hm2，稻瘟病是該區域水稻生產上的主要病害，年均產量損失超過5.00%[1-2]。目前，當地生產上主要通過化學藥劑來進行病害的防控，成本高，污染環境[3-4]，不是病害的最佳解決途徑。以往的研究表明，水稻抗性品種對稻瘟病具有明顯的抵抗能力，而水稻品種的抗性主要來源于其自身攜帶的抗瘟基因。因此，分析水稻抗瘟基因對稻瘟病的田間真實抗性，可以為抗性品種選育及品種合理布局奠定理論基礎。

前人的相關研究主要集中在以抗瘟基因為鑒別體系，在分析稻瘟病菌致病性變化的同時，分析基因的抗性價值。馬軍韜等應用日本清澤鑒別體系對黑龍江省稻瘟病菌生理小種進行分析后認為，抗瘟基因[WTBX][STBX]Pi-ta2、Pi-zt[WTBZ][STBZ]可在黑龍江省優勢小種區利用，Pi-ks、Pi-t不可大規模利用[5]。劉文德等分析了24個抗瘟基因對福建省稻瘟病菌的抗性情況，結果顯示，Pi-kh抗性最強，抗性頻率為98.15%，是優質抗源[6]。蘭波等分析了30個水稻抗瘟基因品系對江西省稻瘟病菌的抗性情況，結果顯示，Pi-zt和Pi-k抗性最強，抗性頻率分別為85.11%和82.95%，是優質抗源[7]。此外，李湘民等也進行過類似研究[8-10]。上述研究都對解決當時、當地稻瘟病危害問題起到了積極的推動作用，但在研究方法上均采用室內接種方式，由于試驗條件極為適宜，易導致試驗結果偏重情況的出現；此外，由于供試菌株數量多寡及采集地點不均衡等問題，易導致菌株群體代表性不強情況的出現，造成人為誤差。本研究在對外部環境進行測評的前提下，結合田間自然感病和室內接種2種鑒定方式進行分析，可以部分彌補上述不足，相對較好地反映抗瘟基因的真實抗性。

本研究以哈爾濱市道外區民主鄉為試驗地點，該區域地理、氣候條件適中，既利于水稻連片種植，也利于稻瘟病菌定殖、擴繁，直接導致當地稻瘟病長期發生。以此為契機，本研究以區域內稻瘟病菌為試驗靶標，通過田間自然感病的方式，分析了24個水稻單基因系與區域內稻瘟病菌的互作情況；通過室內接種的方式，分析了24個水稻單基因系的抗性及稻瘟病菌的致病性情況，以期為抗瘟基因綜合評價及抗性未來發展趨勢等研究提供基礎數據。

1材料與方法

1.1試驗材料

水稻單基因系，24個，各含有1個已知抗瘟基因；感病對照品種為麗江新團黑谷（LTH），不含任何抗瘟基因，由中國農業科學院作物科學研究所提供。供試菌株，18個，于2014年從哈爾濱市道外區民主鄉感病水稻植株上分離獲得，由黑龍江省農業科學院耕作栽培研究所提供。田間自然感病菌株，為混合菌株群，分別來源于2012年和2014年哈爾濱市道外區民主鄉。

1.2試驗方法

水稻單基因系田間發病情況分析，采用田間自然發病方法完成試驗。每個水稻單基因系播1行，15株，每行單基因系間插播1個誘發行，品種為蒙古稻，3次重復，四周保護行品種也為蒙古稻。2012年，環境條件適宜后，當年混合菌群首先在誘發品種和部分高感單基因系上完成初侵染，形成大量分生孢子后，逐步完成多次再侵染，發病完全后，按下列標準進行調查[11]。病情分為6級，即0級：葉片上無任何病斑；1級：直徑小于0.50 mm的褐色病斑；2級：直徑為0.50～1.00 mm 的褐色病斑；3級：直徑為1.00～3.00 mm的橢圓形病斑，周圍褐色，中央灰白色；4級：紡錘形病斑，直徑超過 3 mm，病斑無融合或略微融合；5級同4級，但由于病斑融合，葉片上半部枯死。統計分析時，將0～3級歸為抗病反應型，4～5級歸為感病反應型。于2014年在相同地點、應用相同方法，以當年混合菌群為侵染源，完成重復性試驗。

水稻單基因系室內發病情況分析，通過噴霧接種的方式完成。稻瘟病菌株的分離、培養及擴繁參照周江鴻等的方法[12]。幼苗以草碳土、黑土為基質，育秧盤育苗，每個水稻單基因系保苗15株，3次重復。待幼苗長至3葉1心時，搬入人工氣候室，應用孢子懸浮液進行噴霧接種，懸浮液濃度為 5×105 個孢子/mL（含0.025%吐溫-20），劑量為每盤 100 mL。接種完成后，在26 ℃、相對濕度100%條件下暗培養30 h，光照培養96～144 h，發病完全后按上述標準進行調查[11]。將能夠給水稻單基因系植株造成4～5級傷害的稻瘟病菌株稱為致病菌株，其余稱為非致病菌株。

1.3數據分析

[JZ（]植株發病率=100%×（發病分蘗數/植株總分蘗數）；[JZ）]

[JZ（]葉片發病率=100%×（發病葉片數/總葉片數）；[JZ）]

葉瘟病情指數=100×∑（發病葉片數×發病級別）/（總葉片數×最高發病級別）；

[JZ（]室內發病率=100%×（致病菌株數/總菌株數）。[JZ）]

將抗瘟基因與稻瘟病菌的互作反應型作為性狀，當抗瘟基因對稻瘟病菌表現抗病時記為“1”，表現感病時記為 “0”，構成二態性狀。利用DPSv7.05分析軟件，以類平均法進行致病性相似度聚類分析，相似系數=1-相異系數。以SNK法進行抗瘟基因間差異顯著性分析，同時應用該軟件進行指標間的相關分析。

應用Excel 2010進行數據統計與計算。

2結果與分析

2.1水稻單基因系田間植株發病情況分析

以當年田間混合菌株群為選擇壓力，對水稻單基因系植株發病情況進行了分析，結果（表1）顯示：2012年，在24個供試基因中，對稻瘟病菌表現免疫的基因有7個，分別為[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2[WTBZ][STBZ]和Pi-sh。在表現感病的17個基因中，其發病率介于2.58%～47.03%之間，平均發病率為19.93%。其中，[WTBX][STBX]Pi-11[WTBZ][STBZ]基因發病率最低，Pi-k基因發病率最高。此外，感病對照品種麗江新團黑谷發病嚴重，發病率為73.13%。

2個免疫基因。在表現感病的15個基因中，其葉片發病率介于2.21%～81.74%之間，平均發病率為18.83%，升高趨勢明顯。其中，Pi-zt基因發病率最低，Pi-k基因發病率最高。此外，感病對照品種麗江新團黑谷發病加重，發病率升至 90.18%。

從葉片發病率的年際變化角度分析，感病對照品種麗江新團黑谷發病明顯且程度較重，證明結果真實可信。對比2012年與2014年水稻單基因系試驗結果，穩定中同樣存在較大波動，主要存在3種類型：（1）表現免疫的抗瘟基因，包括[WTBX][STBX]Pi-12（t）[WTBZ][STBZ]等7個基因。（2）葉片發病率降低的抗瘟基因，包括Pi-z等8個基因，其中Pi-z基因發病率下降12.04百分點，降幅最大；[WTBX][STBX]Pi-5（t）[WTBZ][STBZ]基因發病率下降1.16百分點，降幅最小。（3）葉片發病率上升的抗瘟基因，包括Pi-k等9個基因，其中Pi-k基因發病率上升64.84百分點，升幅最大；[WTBX][STBX]Pi-19（t）[WTBZ][STBZ]基因發病率上升1.22百分點，升幅最小。

應用病情指數對葉瘟發生的普遍率和嚴重度進行了綜合分析，結果（表3）顯示：2012年，在24個供試抗瘟基因中，對稻瘟病菌表現免疫的基因有7個，分別為[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-7（t）、Pi-9（t）、Pi-z5、Pi-20、Pi-ta2和Pi-sh[WTBZ][STBZ]。在表現感病的17個基因中，其病情指數介于0.70～14.04之間，平均病情指數為5.43。其中，[WTBX][STBX]Pi-5（t）[WTBZ][STBZ]基因病情指數最低，Pi-z基因病情指數最高。此外，感病對照品種麗江新團黑谷綜合發病情況嚴重，病情指數為32.34。從抗瘟基因差異性角度分析，在0.05、0.01差異水平上，24個基因均被劃分為10個差異梯度，其中Pi-kp基因與其他23個基因表現顯著差異。

3討論

稻瘟病作為一種侵染性病害，其危害程度與環境條件有直接關系。針對哈爾濱市的生產實際，每年7—9月的溫度、濕度等氣象因子對稻瘟病菌的侵染及循環影響較大。2012年哈爾濱市7—9月的平均氣溫分別為23.97、22.1、16.75 ℃，2014年7—9月的平均氣溫分別為23.78、2201、15.97 ℃，比較接近；而且，這2年7—9月的平均相對濕度均在70%～78%，也比較接近；整體分析，氣象因子在2年間差異不大。此外，本研究中的2年試驗是在同一地點、田間無明顯病株殘留物前提下，應用同一類型種質完成分析的，試驗環境基本一致。因此，粗略認為，整體外部環境因素在年際間差異較小，病菌致病性及致病力的年際變化可能主要是內在變異或與種質互作的結果。

本研究之所以從植株發病率指標和葉片發病率指標進行稻瘟病菌分析，主要是因為這2個發病率指標可以部分代表病菌在水稻中的寄生與分布狀態。植株發病率是以水稻的單個分蘗為調查基數，可部分代表病菌在水稻群體中的分布廣度；葉片發病率是以水稻的單個葉片為調查基數，可部分代表病菌在水稻個體中的分布集中度。例如：3個水稻分蘗株上各有1個葉片發病和1個水稻分蘗株上有3個葉片發病，粗看結果一致，都是3個葉片發病，但實際意義不同。前者在水稻群體中分布更廣，后者在水稻個體中分布更集中，一旦外界環境適應，前者可能造成分散式發病，后者可能造成有核心的擴展式發病，如果進行化學防治，前者必須全面噴灑農藥方能取得理想效果，后者可能在尋找核心發病區的基礎之上進行有重點的噴灑農藥即可取得理想效果。由此可見，進行水稻種質2個發病率指標的分別調查有其科學性和現實指導意義。

綜合24個水稻單基因系植株發病率、葉片發病率和葉瘟病情指數等指標的變化情況后認為，稻瘟病菌或抗瘟基因可能存在下列幾點變異規律：（1）表現感病的抗瘟基因數量在年際間呈下降趨勢，說明病菌的整體致病性可能呈集中化趨勢。（2）年際間植株發病率與葉片發病率上升基因數量上多于發病率下降基因，在變化程度上前者也明顯大于后者，加之感病對照麗江新團黑谷的發病率也呈明顯上升趨勢，側面說明病菌的整體致病力可能呈增強趨勢，同時也說明抗瘟基因群體的整體抗性可能呈下降趨勢。（3）各個指標的內部差值在年際間呈擴大趨勢，抗瘟基因的差異梯度在年際間呈增加趨勢，說明抗瘟基因的抗性差異化趨勢明顯，高抗性基因與低抗性基因進一步分開。結合各個指標的信息綜合評價，Pi-k、Pi-i、Pi-ta和Pi-a基因抗性喪失速度過快，建議不要應用；[WTBX][STBX]Pi-12（t）、Pi-9（t）[WTBZ][STBZ]等7個基因抗性很好且相對穩定，可以廣泛應用，這一結論與蘭波、李進斌和張國民等的研究結果比較類似；Pi-z基因抗性提升很快，可以有限度的應用。

從幾個指標的相關度方面分析，病菌在水稻個體中的分布集中度與綜合發病程度關聯性最強，病菌在水稻群體中的分布廣度與綜合發病程度關聯性較強，而發病級別與病害的綜合發生程度關聯性較差，這可能與2年間發病程度相對均勻有直接關系。

從水稻單基因系的室內接種結果分析，由于選擇壓力更大，侵染條件更加適宜，沒有出現免疫抗瘟基因，各供試基因都存在或高或低的發病風險。鑒于試驗菌株數量偏少，定量分析結果可能存在誤差，但仍可以說明一定的問題：（1）每個稻瘟病菌株的致病型各不相同，說明來源于相同地點的菌株間仍然存在明顯的致病性分化；（2）菌株彼此間致病性相似系數差值較大，說明菌株間的致病性分化程度比較劇烈；菌株間侵染抗瘟基因的數量差別較大、平均值不高，說明菌株間的致病力存在明顯差別，但目前整體水平不高。

此外，鑒于水稻單基因系都存在發病風險，需進一步關注新型抗源的應用工作。目前，國內外共發現各類抗瘟基因超過100個[13-21]，但轉育成水稻單基因系的明顯較少[22]，多數基因由于缺乏單基因系載體而無法評價其真實抗性，從而限制了相關工作的深入開展。

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