拮抗軟腐病菌的魔芋內生細菌多樣性研究

林天興+龔明福+管芩瀾

摘要：生活在魔芋組織中的內生細菌具有拮抗魔芋軟腐病病菌的潛力。通過組織分離法從魔芋塊莖中分離得到內生細菌，用牛津杯法皿內測試內生細菌對魔芋軟腐病菌的拮抗作用，使用腸桿菌重復居間序列聚合酶鏈式反應（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）方法研究其遺傳多樣性。結果表明，從魔芋塊莖中分離得到35株內生細菌，35株內生細菌對魔芋軟腐病菌均有不同程度的拮抗活性，ERIC-PCR指紋圖譜顯示35株內生細菌在Watson距離為0.60時可分為4個ERIC群和4株獨立成群菌株，表明35株拮抗性內生細菌的遺傳多樣性明顯。

關鍵詞：魔芋；內生細菌；胡蘿卜軟腐歐文氏菌；多樣性

中圖分類號： S182文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0197-02

魔芋（Amorphaphallus konjac）是天南星科魔芋屬單子葉多年生草本植物。魔芋塊莖中葡甘聚糖（KGM）含量非常豐富，已被應用于食品、醫藥、化工行業和農業，因此魔芋在中國有廣泛的栽培。魔芋軟腐病是魔芋的主要病害，已經嚴重影響到魔芋的生產，是魔芋產業發展的重要障礙。該病是由胡蘿卜軟腐歐文氏菌（Erwinia carotovora subsp. carotovora，簡稱Ecc）引起的細菌性病害[1]，除了魔芋，Ecc還可能導致花椰菜、番茄、辣椒、白菜、蘿卜、豆科植物及其他植物的軟腐病。

芽孢桿菌在自然界存在非常普遍，可以生產各種抗菌物質，抑制植物病原菌[2]，有許多利用芽孢桿菌來生物防治魔芋軟腐病的例子[3-7]。筆者課題組近年來從四川省夾江縣、峨眉山和沐川縣魔芋塊莖中分離得到35株內生細菌，對內生細菌拮抗魔芋軟腐病菌的能力進行了測定，使用總DNA序列腸桿菌重復居間序列聚合酶鏈式反應（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction，ERIC-PCR）方法，研究了35株魔芋拮抗性內生細菌的遺傳多樣性，為魔芋軟腐病的生物防治提供菌株資源。

1材料與方法

1.1魔芋內生細菌的分離

從四川省夾江縣、峨眉山、沐川縣的魔芋種植區中采集150個魔芋的球莖，每個球莖表面用0.1% HgCl2消毒，漂洗后用滅菌蒸餾水清洗5次。表面消毒的球莖用無菌粉碎機粉碎，取汁液劃線于營養瓊脂培養基（NA，包括牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化鈉5.0 g/L，瓊脂15.0 g/L）平板上，28 ℃ 恒溫培養3 d后對單個菌落進一步純化，多次重復上述操作，得到的純菌落接種到試管斜面中保存備用。最后1次球莖表面消毒的水接種在NA培養基上，并在28 ℃恒溫培養箱中培養72 d來徹底檢查表面消毒是否徹底。

1.2抑制魔芋軟腐病菌的拮抗菌篩選

在NA板涂布接種0.1 mL軟腐病菌培養液（109～1010 CFU/mL）。取4個規格相同的滅菌牛津杯（內徑6 mm、外徑8 mm）均勻插入NA板之間并保證牛津杯不能接觸到NA平板的底部。分裝100 μL測試供試內生菌菌液于3個牛津杯中。最后1個牛津杯中裝入100 μL的滅菌的菌液作為對照組，每處理重復3次，28 ℃下培養48 h后測量抑菌圈的大小。內生細菌對病原細菌的拮抗活性用菌落抑制大小（colony inhibited size，CIS）表示，CIS=供試菌株抑菌圈-牛津杯外徑。

1.3拮抗性內生細菌ERIC-PCR指紋圖譜分析

拮抗性內生細菌總基因組DNA提取參考徐琳等的方法[8]。特異性引物選擇ERIC1R和ERIC2L[9]，由上海香農生物工程技術服務有限公司合成。反應體系為25 μL，其成分是10×緩沖區（Biorule）2.5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）2.0 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL，ERIC1R（20 pmol/μL）0.5 μL，ERIC2L（20 pmol/μL）0.5 μL，添加13 μL ddH2O，增加總DNA模板（40～80 ng）4.0 μL。ERIC-PCR反應過程參考馬溪平等描述的方法[10]。反應結束采用1%瓊脂糖凝膠電泳 3.5 h，凝膠成像，圖像掃描至計算機保存圖譜，在有條帶的位置記為“1”，沒有的記為“0”。采用DPS軟件，根據組平均連鎖聚類法（UPGMA）樹形聚類圖進行0-1的聚類分析[11]。

2結果與分析

2.1魔芋內生細菌的分離

從健康魔芋球莖中分離得到35株內生細菌，其中10株采自夾江縣（菌株編號為AKEB01至AKEB10），15株采自峨眉山（菌株編號為 AKEB11至AKEB25）及10株采自沐川縣（菌株編號為AKEB25至AKEB35）。

2.2抑制魔芋軟腐病菌的拮抗菌篩選

從魔芋中分離得到的35株內生細菌對魔芋軟腐病菌均具有不同程度的拮抗活性（表1），不同菌株的拮抗活性有顯著差異，7株拮抗性內生細菌（AKEB06、AKEB16、AKEB20、AKEB23、AKEB28、AKEB32、AKEB35）的拮抗活性較強，平均抗菌距離超過15.0 mm，其中AKEB06拮抗活性最強，平均抗菌距離19.3 mm。

3結論

從健康魔芋球莖中分離得到35株內生細菌菌株，這些內生細菌對魔芋軟腐病菌均有不同程度的拮抗活性，其中7株抗菌距離超過15.00 mm。ERIC-PCR分析表明，當Watson距離0.60時，35株拮抗性內生細菌菌株可分為4個ERIC群和4個獨立成群的菌株，當Watson距離為1.00時所有測試菌株聚集在一起。研究結果表明拮抗性內生細菌存在遺傳多樣性。

目前，拮抗細菌性病原的物質大多基于體外抗菌法從草藥及其提取物中篩選獲得，從魔芋中分離得到的內生細菌菌株表現出較好的拮抗活性，并且多樣性明顯，因此，從魔芋內生細菌中篩選具有軟腐病抗性的內生細菌菌株資源非常豐富。

參考文獻：

[1]Toth I K，Bell K S，Holeva M C，et al. Soft rot erwiniae：from genes to genomes[J]. Molecular plant pathology，2003，4（1）：17-30.

[2]Tamehiro N，Okamoto-Hosoya Y，Okamoto S，et al. Bacilysocin，a novel phospholipid antibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J]. Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2002，46（2）：315-320.