大鯢虹彩病毒套式PCR診斷方法的建立及應用

王芳??+康超??+李永霞??+余波+周思旋

摘要：根據GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設計2對特異性的引物，通過對第1步和第2步PCR反應條件進行優化，建立大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白套式PCR診斷方法。結果表明，該方法重復性好，第1次PCR擴增敏感性達10 pg/mL，第2次PCR敏感性是1 fg/mL，對錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif；%95%95，JZ]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA擴增結果均為陰性。表明建立的套式PCR方法適合于大鯢虹彩病毒臨床樣品的快速診斷。

關鍵詞：大鯢虹彩病毒；套式PCR；臨床樣品

中圖分類號： S852.65+9.1文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0291-03

近年來，大鯢人工養殖發展迅速，工廠化水平較高，苗種之間流通比較多，加之今年大鯢價格下降，養殖戶大量采購苗種，忽視引種檢疫，造成疾病大量暴發。其中，大鯢虹彩暴發最為嚴重，在陜西、四川、貴州等地報道較多，該病毒可引起大鯢大面積死亡[1-3]。目前，大鯢虹彩病毒的疫苗還處于研究階段，市面上還沒有商品化的疫苗[4-6]。因此，對大鯢虹彩病毒病的早期診斷及防治尤為重要。本研究根據GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設計2對特異性的引物，根據PCR反應條件優化，建立大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白套式PCR診斷方法，以期為臨床樣品的快速診斷、防治大鯢虹彩病毒病提供科學依據。

1材料與方法

1.1試驗材料

毒株、菌株和細胞：大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌均由貴州重大疫病監測防制重點實驗室保存。鯉上皮瘤細胞購自上海拜力生物科技有限公司。

主要試劑：MIX PCR酶、核酸染料、1×TAE電泳緩沖液、DL2000購自北京天根生物科技有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒，病毒基因組DNA提取試劑盒，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計根據GenBank中大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白MCP基因序列，設計2對引物。

1.2.2病毒和細菌核酸的提取（1）病毒細菌核酸。將大鯢虹彩病毒液接種于鯉上皮瘤細胞，待細胞出現病變后收集細胞毒液，將其放入-70 ℃冰箱反復凍融3次，5 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用病毒基因組DNA試劑盒提取基因組。（2）細菌核酸。細菌核酸DNA提取參照細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。（3）組織樣品。取患病大鯢肝臟組織約1.0 g，加入0.1 mol/L PBS緩沖液2 mL進行研磨，然后置于-70 ℃反復凍融3次，5 000 r/min離心 10 min，取上清液490 μL加入10%SDS 5 μL，蛋白酶K 5 μL（20 mg/mL），55 ℃孵育30 min，5 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL用病毒基因組DNA試劑盒提取基因組。

1.2.3套式PCR擴增條件優化對套式PCR的退火溫度（50、55、60 ℃）和引物濃度（5、10、20 μmol/L）進行優化。第1次和第2次PCR反應體系和反應程序相同：在25 μL體系中加上下游引物各1 μL（5、10、20 μmol/L）、MIX PCR酶 12.5 μL、模板2 μL，ddH2O加至25 μL。反應條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃（55 ℃、60 ℃）1 min，72 ℃ 1 min，30個循環；最后72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR擴增產物于1%瓊脂糖凝膠中電泳。

1.2.4敏感性試驗將提取的病毒和細菌核酸用核酸蛋白儀檢測后，進行10倍稀釋用于套式PCR反應。從每個稀釋度中取2 μL作為模板進行第1次PCR擴增，如第1次PCR擴增為陰性，再將第1次PCR產物取出2 μL作為模板，進行第2次PCR擴增，以確定建立的套式PCR敏感性。

1.2.5特異性試驗以大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA為模板分別進行第1次和第2次PCR反應，以確定建立的套式PCR特異性。

1.2.6建立的套式PCR對臨床樣品的檢測應用建立的套式PCR對貴州省20個大鯢養殖場采集的46份大鯢肝臟（其中，21份為有臨床癥狀的病鯢，25份為無臨床癥狀但感染虹彩病毒的養殖場采集的樣品），44份大鯢餌料魚病料，20份大鯢養殖場水樣（其中9個養殖場以前發生過虹彩病毒），20份引種的鯢苗進行檢測，同時參照Mao等建立的普通PCR方法[7]進行對比。

2結果與分析

2.1套式PCR反應條件優化

25 μL反應體系中最佳反應條件為退火溫度55 ℃，引物濃度10 μmol/L，第1次和第2次PCR能有效擴增出目的片段，分別為700、300 bp，引物間無非特異性片段產生（圖1）。序列送生工生物工程（上海）有限公司測序，結果與GenBank中大鯢虹彩病毒MCP基因相似性為99.9%。

2.2敏感性試驗

大鯢虹彩病毒DNA經蛋白質核酸儀測定濃度為 1 μg/mL，經10倍稀釋的病毒核酸進行套式PCR，以檢測方法的敏感性。結果（圖2）表明，第1次PCR擴增產物大小約700 bp，大鯢虹彩病毒 DNA最低檢測量為10 pg/mL。在第1次PCR擴增未見DNA亮帶，取第1次PCR產物2 μL進行第2次PCR擴增，擴增產物大小約300 bp。第2次PCR敏感性為1 fg/mL（圖3）。

2.3特異性試驗

以大鯢虹彩病毒、錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA為模板用2對引物進行PCR反應。結果（圖3、圖4）顯示，大鯢虹彩病毒DNA第1次和第2次擴增均為陽性，而錦鯉皰疹病毒、斑點叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水氣單胞菌、檸檬酸桿菌、黃桿菌DNA第1次和第2次擴增均為陰性。

2.4建立的套式PCR對臨床樣品的檢測

應用建立的套式PCR檢測46份大鯢肝臟樣品陽性率為36.9%（17/46），普通PCR方法陽性率為19.5%（9/46）。套式[CM（25]PCR檢測44份大鯢餌料魚病料陽性率為0%，普通PCR[CM）]

方法陽性率為0%。套式PCR檢測20份大鯢養殖場水樣陽性率為10%（2/20），普通PCR方法陽性率為0%。套式PCR檢測20份引種的鯢苗陽性率為20%（4/20），普通PCR方法陽性率為15%（3/20）。

46份大鯢肝臟樣品中21份為有臨床癥狀的病鯢套式PCR檢測陽性率為42.8%（9/21），普通PCR方法陽性率為42.8%（9/21）。25份為無臨床癥狀但感染過虹彩病毒的養殖場采集的樣品陽性率為32%（8/25），普通PCR方法陽性率為4.7%（1/21）。9個養殖場以前發生過虹彩病毒水樣陽性率22.2%（2/9），普通PCR方法陽性率為0%。

3討論

近2年，隨著大鯢市場的走低，養殖戶對大鯢疫病防控的重視度下降。大鯢虹彩病毒是目前養殖大鯢最大的威脅，感染虹彩病毒可導致養殖場出現大規模大鯢死亡，而虹彩病毒的暴發多是引種所致。因此，建立快速簡便經濟適用的引種檢疫方法對大鯢虹彩病毒病的防治尤為重要。

目前，研究者主要依據大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白設計引物建立快速的診斷方法。周勇等根據大鯢虹彩病毒主要衣殼蛋白設計引物，建立大鯢虹彩病毒TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法，敏感性約1.1×10-3 pg/μL病毒核酸，較之常規PCR的敏感度高出約1 000倍[8]。李惠芳等依據虹彩病毒蛙病毒屬主衣殼蛋白基因，建立虹彩病毒蛙病毒屬病毒實時熒光PCR檢測方法，該方法對虹彩病毒蛙病毒屬成員（新加坡石斑魚虹彩病毒除外）的檢測有高度的特異性，敏感性達到4.5×10-3 pg/μL，比傳統PCR的敏感度高出100倍[9]。這些熒光定量PCR檢測方法對人員和設備的要求較高，在基層水產技術推廣站推廣多只配備了普通PCR儀器，該方法推廣較難。劉星星等據大鯢蛙病毒主要核衣殼蛋白MCP設計合成4條特異性引物建立環介導等溫擴增檢測方法，最低檢測限為5 copies/μL，而巢氏PCR和常規PCR的檢測限為 50 copies/μL和5×103 copies/μL，該LAMP方法檢測時間較快，但成本較高[10]。

套式PCR成本較低，敏感性較普通PCR高100倍左右，敏感性略低于熒光定量PCR，適合基層水產技術推廣站推廣應用。賈坤同等依據大菱鲆紅體病虹彩病毒的腺苷三磷酸酶基因序列，設計了特異性的引物，建立了一種檢測大菱鲆紅體病虹彩病毒的套式PCR方法，該方法比普通PCR敏感性100倍[11]。本研究建立的診斷方法敏感性達到1 fg/mL，比普通PCR敏感性1 000倍。對感染過虹彩病毒的養殖場進行大鯢樣品和養殖用水樣品檢測發現該養殖場還存在陽性樣本，說明該養殖場可能還存在隱性感染。因此，建立的診斷方法可應用于大鯢虹彩病毒引種檢疫和隱性感染檢測，有利于大鯢養殖場虹彩病毒的凈化。

參考文獻：[HJ1.7mm]

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