烏鱧（Channa argus）線粒體Ⅰ[QX）]基因序列測定及其系統發育關系分析

陳晨+賀晶晶+邵青臣+劉坤+王加連

摘要：為了進一步探討烏鱧（Channa argus）的分類地位及其系統發育關系，通過測定其線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）基因部分序列，并從GenBank獲取鱧科另外18種魚類的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同源序列，以銀鯧（Pampus argenteus）為外群，采用非加權配對算術平均法（UPGMA）構建分子系統樹。結果表明：（1）支持鱧科分為鱧屬和副鱧屬；（2）烏鱧與同屬的斑鱧（C. maculata）等魚類的親緣關系較近。

關鍵詞：烏鱧；CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]；序列測定；系統發育

中圖分類號： S917文獻標志碼：

文章編號：1002-1302（2016）08-0297-03

鱧科隸屬于魚綱鱸形目，包括2屬29種。其中鱧屬26種，分布于中東、南亞和東亞等地；而副鱧屬只有3種，主要分布于西非地區[1]。烏鱧（Channa argus）別稱北方蛇頭魚、黑魚、生魚、烏魚等，是鱧科鱧屬中個體大、生長快、經濟價值高的名貴經濟魚類。烏鱧原產于中國、俄羅斯和韓國，國內主要分布于長江和黑龍江流域的大部分地區[2]，通常棲息于水草叢生、底泥細軟的靜水或微流水中。因烏鱧具有肉質好、味道鮮美、營養豐富等特點，成為我國重要的淡水經濟魚類。長期以來，人們關于烏鱧的形態學、生態學以及人工養殖技術等方面的研究較多，而關于其分子生物學資料則很少，其分類地位和系統發育關系尚存爭議。

線粒體DNA是真核生物細胞質中的遺傳物質，呈母系遺傳，具有分子量小、進化速度較快、拷貝數量多等特點，且不易發生重組現象，已成為研究物種起源、進化、分類及種群遺傳分化的理想工具。與其他動物一樣，線粒體細胞色素氧化酶亞基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）基因是魚類線粒體13個蛋白編碼基因之一，中度保守，既能保證足夠的變異又易于被通用引物擴增，在種群遺傳學研究中，可作為屬、種系統進化研究的良好標記，常被用于分析親緣關系較近物種的系統發育以及地理種群之間系統關系的分子工具。已有研究表明，線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因是許多魚類、昆蟲和鳥類等動物分類與鑒別的最適DNA條形碼之一[3-5]。

本研究對烏鱧線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因進行擴增和測序，并從GenBank下載部分鱧科魚類的同源序列進行比較研究，初步分析它們之間的親緣關系和系統進化關系，以期為烏鱧的系統進化及其種質資源的保護和利用進一步提供分子生物學依據。

1材料與方法

1.1材料

烏鱧，購自鹽城市農貿市場，活體帶回實驗室后，用于DNA提取。

1.2總DNA提取

取約200 mg樣品肌肉，采用傳統的酚-三氯甲烷方法提取基因組DNA。DNA經沉淀、洗滌并干燥后，溶于100 μL TE緩沖液中，4 ℃冰箱保存備用。

1.3PCR擴增和測序

1.4數據分析

測序結果同GenBank中獲得的其他18種鱧科魚類的線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列合并（表1），用Clustal X 1.83軟件比對，確定變異位點；用MEGA 4.1軟件對序列進行分析，并基于Kimura雙參數模型，計算上述不同序列的堿基組成、密碼子不同位點的堿基含量，以及相互間的遺傳距離等信息；以鱸形目鯧亞目鯧科的銀鯧（Pampus argenteus）為外群，用非加權配對算術平均法（UPGMA）構建分子系統樹，通過重抽樣檢驗獲得系統樹分支的置信度（重復次數為1 000次）。

2結果與分析

2.1CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列分析

通過對烏鱧線粒體總DNA的提取、PCR擴增和序列測定，得到長度為708 bp的基因序列，經BLAST分析比較，證實所得序列為烏鱧CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因片段。分析該序列的堿基組成，其中T、C、A、G的含量分別為26.7%、31.1%、23.6%、 18.6%，A+T含量為50.3%，G+C含量為49.7%。從其堿基組成的偏向性看，G含量最低，A+T含量略高于G+C含量，這與其他魚類線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因同源序列的堿基特點相似[7-10]。

2.2遺傳距離及系統發育分析

遺傳距離多用來分析不同群體間的遺傳分化程度和群體內的遺傳多樣性，數值越大，群體內或群體間分化程度越高；數值越小，群體內或群體間分化程度越低。根據Kimura雙參數模型得到19種鱧科魚類之間的遺傳距離，其中烏鱧與斑鱧的遺傳距離最小，為0.002；烏鱧與月鱧等其他14種同屬魚類之間的遺傳距離為0.178～0.241；而烏鱧與同科副鱧屬3種魚類的遺傳距離則為0.239～0.253（表2）。可見，烏鱧與同屬的斑鱧等魚類間的分化程度較低，親緣關系較近，與副鱧屬魚類之間的分化程度相對較高。

基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列，采用非加權配對算術平均法構建分子系統樹。圖1顯示，相對于鯧科銀鯧的外群，所有供分析鱧科的2屬19種魚類聚成1個單系群；在鱧科內部，16種鱧屬魚類聚在一起形成單系，3種副鱧屬魚類聚成另1支，兩者互為姊妹群；烏鱧首先與斑鱧聚為1支，進而與由小盾鱧、紅鱧、側眼鱧組成的單系群形成姊妹群關系，且具有較高的置信度，說明烏鱧與這些物種的親緣關系較近。

3討論

細胞色素氧化酶亞基Ⅰ（CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]）為線粒體13個蛋白編碼基因中研究得最清楚的基因之一。相對于線粒體其他序列如D-loop、Cyt b等，CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]的進化速率較低，被廣泛用于魚類系統發育及DNA條形碼研究[11]。Hubert等通過對加拿大28科85屬190種共1 360尾淡水魚類樣本的研究，得出DNA條形碼可以有效應用于淡水魚類、尤其是小個體魚類分類學和系統學研究的結論[12]。近年來，國內學者也陸續開展了魚類DNA條形碼方面的研究工作，但迄今未見運用CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因作為烏鱧DNA條形碼進行分類及其系統發育關系研究的報道。

為了進一步揭示烏鱧的分類地位及其系統發育關系，本研究通過分子生物學技術獲得烏鱧線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列[CM（25]，聯合GenBank中其他18種鱧科魚類的

以其長度650 bp的同源序列為材料，進行遺傳距離分析及系統進化關系研究。結果表明：鱧科魚類明顯分化為2支，分別代表鱧屬和副鱧屬，這與目前公認的鱧科分類觀點一致[1，13]；鱧屬中烏鱧與斑鱧的親緣關系最近，與小盾鱧、紅鱧、側眼鱧等物種也有比較近的親緣關系，這與Li等以線粒體ND2及其側翼基因序列為材料所得到的研究結論[1]完全一致。

雖然本研究進一步驗證了鱧科的分類狀況，也進一步明確了烏鱧的分類地位及其系統發育關系，但由于受客觀條件的限制，本研究僅僅基于CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因的部分序列，研究對象也僅涉及到鱧科29個物種中的19種，因而研究結果仍然是初步的，還有待于我們從更多的鱧科物種、基于更豐富的線粒體基因或核基因材料，對烏鱧分類地位及鱧科魚類系統發育關系進行更加系統的研究。

參考文獻：

[1]Li X，Musikasinthorn P，Kumazawa Y. Molecular phylogenetic analyses of snakeheads （Perciformes：Channidae） using mitochondrial DNA sequences[J]. Ichthyological Research，2006，53（2）：148-159.

[2]董新培，穆淑梅，周楠，等. 不同地理群體烏鱧線粒體DNA控制區結構分析及遺傳多樣性[J]. 水產學報，2014，38（9）：1277-1285.

[3]劉連為，許強華，陳新軍. 基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]和Cytb基因序列的北太平洋柔魚種群遺傳結構研究[J]. 水產學報，2012，36（11）：1675-1684.

[4]張迪，雷光春，龔成，等. 基于CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的太湖新銀魚遺傳多樣性[J]. 湖泊科學，2012，24（2）：299-306.

[5]于亞男，宋超，侯俊利，等. 基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因部分序列的長江口蝦虎魚科魚類系統分類[J]. 淡水漁業，2014，44（5）：3-8.

[6]Ivanova N V，Zemlak T S，Hanner R H，et al. Universal primer cocktails for fish DNA barcoding[J]. Molecular Ecology Notes，2007，7（4）：544-548.[HJ1.7mm]

[7]郭奕惠，喻達輝，黃桂菊，等. 中國主要養殖羅非魚親緣關系的CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]序列分析[J]. 華中農業大學學報，2009，28（1）：75-79.

[8]孟瑋，楊天燕，海薩，等. 基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的亞東鮭DNA條形碼研究[J]. 水產學雜志，2010，23（1）：6-10.

[9]董麗娜，黃梓榮，艾紅，等. 北部灣3種金線魚屬魚類CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的比較分析[J]. 中國水產科學，2011，18（3）：508-514.[ZK）]

[10]趙明，宋煒，馬春艷. 基于線粒體CO[QX（Y15]Ⅰ[QX）]基因序列的棘頭梅童魚7個野生群體遺傳結構分析[J]. 中國水產科學，2015，22（2）：233-242.