趨化因子受體CXCR4在腎癌組織中的表達及其調控機制研究

彭迪，劉釗，李錦楠，張曉艷，王浩，王華，肖鳳君，張忠濤，胡澤斌，王立生，吳學杰，楊月峰

趨化因子受體CXCR4在腎癌組織中的表達及其調控機制研究

彭迪，劉釗，李錦楠，張曉艷，王浩，王華，肖鳳君，張忠濤，胡澤斌，王立生，吳學杰，楊月峰

目的研究趨化因子受體 CXCR4 在腎癌患者腫瘤組織中的表達水平，探討 CXCR4 表達調控的可能機制。

受體，CXCR4； 腎腫瘤； 轉化生長因子 β；細胞運動

近年來，我國腎癌的發病率呈逐年上升的趨勢，僅次于膀胱癌，位居男性泌尿系統惡性腫瘤的第二位[1]。腎癌早期癥狀并不明顯，同時，我國尚未建立完善的腎癌篩查體系，因此，往往發現較晚，失去了治療的最佳時機。腎癌對放療和化療均不太敏感，因此，傳統的治療方法以手術切除為主。近年來，隨著免疫治療、基因治療等技術的發展與突破，分子靶向治療有望為腎癌的治療帶來突破。

趨化因子受體 CXCR4（C-X-C motif chemokine receptor 4）是含有 7 個跨膜區的 G 蛋白偶聯受體家族成員，它表達于多種組織和器官中。CXCR4 參與體內多種生理機制，包括參與 HIV-1 病毒侵染，造血功能，胚胎發育及腫瘤發生、發展及遷移等。基質細胞衍生因子 1（stromal cell-derived factor 1，SDF-1）是 CXCR4 唯一配體，SDF-1/CXCR4 信號通路的激活，在多種惡性腫瘤，如非小細胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌等的轉移過程中發揮重要作用[2-5]。同時，近年來對于 CXCR4 分子及其機制研究的進一步深入，發現 CXCR4 是結直腸癌肝轉移預后和復發預測的重要分子；是胰腺癌腫瘤放化療后復發風險評估的理想分子之一；能夠作為預測腫瘤患者的藥物敏感性的重要指標等[6-8]。本課題擬通過檢測腎癌組織 CXCR4 的表達水平，明確其在腎癌發生、發展中的作用；同時，通過體外試驗，闡明其上游調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病例標本 收集 2014 年 5 月 – 2016 年10 月于中國人民武裝警察部隊總醫院行腎癌手術切除患者的癌組織和癌旁組織，共 12 例，其中，男性 8 例，女性 4 例，平均年齡 53.5 歲（29 ～78 歲）。患者術前未接受任何形式的放療、化療。病例標本收集后凍存于液氮中，后續用于 RNA 提取和基因表達檢測。

1.1.2 細胞系 人胚腎細胞 HEK293 培養于10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培養基中；正常人腎臟細胞 HKC、人腎癌細胞 786O、769P（本實驗室保存），培養于 10% FBS 的 1640 培養基。

1.1.3 重組腺病毒 重組腺病毒 Ad(E1-).sT 為攜帶可溶性轉化生長因子 β（transforming growth factor β，TGF-β）受體 II-人 IgGFc 融合蛋白（sTGF-βRIIFc）的復制缺陷型重組腺病毒；Ad(E1-).Null 為不攜帶外源基因的復制缺陷型腺病毒載體[9]。重組腺病毒載體均由 Adeasy 系統制備獲得病毒，采用氯化銫密度梯度離心純化病毒，采用紫外分光光度法測定病毒滴度和純度[10-11]。

1.1.4 主要試劑與儀器 人胚腎細胞 HEK 293購自 ATCC；Trizol 購自美國 Sigma 公司；AMV逆轉錄酶、SYBR Premix EX TaqTMII 實時定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測試劑盒購自日本 Takara 公司；1640 培養基、DMEM 培養基購自美國HyClone 公司；FBS 購自浙江天杭生物科技股份有限公司；抗 IgGFc 抗體購自美國 Jackson Immuno Research 公司。無水乙醇、異丙醇等化學試劑購自北京化學試劑公司。人 CXCR4 基因、人 TGF-β基因和管家基因 β-actin 引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，其序列為：人 CXCR4 引物，上游 5' acgccaccaacagtcaga 3'，下游：5' aagtcg ggaatagtcagc 3'；人 TGF-β 引物，上游，5' gcaacaattc ctggcgatac 3'；下游，5' caaccactgccgcacaact 3'；人β-actin 引物，上游，5' gggacctgactgactacctc 3'，下游，5' cttaatgtcacgcacgatt 3'。

1.2 方法

1.2.1 實時定量 PCR 檢測 CXCR4 在腎癌組織中的表達水平 在液氮保護下研磨凍存腎癌標本組織和癌旁組織（約 100 mg），加入 1 ml Trizol，常規方法提取 RNA。采用紫外吸收測定法測定RNA 濃度和純度；并按照 AMV 逆轉錄酶試劑盒說明進行反轉錄，獲得 cDNA 樣本。然后，以 cDNA為模板 PCR 擴增人 CXCR4 和 β-actin，引物序列如上所述。反應條件為 95 ℃ 預變性 10 min，95 ℃ 變性 15 s，60 ℃ 退火加延伸 1 min，共40 個循環。以 β-actin 為對照，采用 2-ΔCT，分析腎癌組織及癌旁組織中 CXCR4 的相對表達量。

1.2.2 TGF-β 在腎癌細胞系的表達水平 將對數生長期的人腎臟細胞系 HKC 以及人腎癌細胞系 769P 和 786O，分別提取 RNA，并進行反轉錄。采用實時定量 PCR 檢測目的基因 TGF-β 的表達。

1.2.3 Ad(E1-).sT 在人腎癌細胞 786O 中表達效率的檢測 人腎癌細胞 786O，每孔以 2 × 105個細胞/2 ml 接種于六孔板中，過夜培養后，重組腺病毒 Ad(E1-).sT 和對照病毒 Ad(E1-).Null 分別以25 000 VPs/細胞的強度感染細胞，感染后 48 h，Western blot 檢測目的基因 sTGF-βRIIFc 的表達水平。

1.2.4 阻斷 TGF-β 信號對人腎癌細胞 CXCR4表達的影響 人腎癌細胞 786O，每孔以 3 × 105個細胞/2 ml 接種于六孔板中，過夜培養后，重組腺病毒 Ad(E1-).sT 和對照病毒 Ad(E1-).Null 分別以10 000 VPs/細胞的強度感染細胞。孵育 24 h 后，更換新鮮的完全培養基，并加入 2 ng/ml 的重組人TGF-β 進行刺激，以未刺激細胞作為對照。刺激后24 h，收集細胞，提取 RNA 并進行反轉錄，采用實時定量 PCR 檢測 CXCR4 的表達水平。

1.2.5 劃痕實驗 人腎癌細胞 786O 細胞以每孔6 × 105個細胞/2 ml 接種于六孔板中，24 h 后，采用 5000 VPs 的 Ad(E1-).sT 和 Ad(E1-).Null 感染細胞，4 h 后更換新鮮的完全培養基；感染后 24 h進行劃痕，并更換培養基，加入 2 ng/ml 的 TGF-β，繼續培養。分別于劃痕后即刻、6、12、24 h 觀察劃痕愈合情況并拍照，計算愈合率，明確細胞的遷移作用。

1.3 統計學處理

本研究采用 prism5.0 進行統計分析，以?±s 進行描述，病例標本采用配對 t 檢驗；其他數據采用方差分析，并結合 t 檢驗進行兩兩比較。四個時間點拍照，測量劃痕愈合情況。以 P ＜ 0.05表示具有差異，P ＜ 0.01 表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 CXCR4 在腎癌組織中表達上調

12 例未經放、化療的腎癌患者，在手術治療過程中獲得的癌組織和癌旁組織，經實時定量 PCR檢測，結果顯示，腫瘤組織中 CXCR4 的表達水平顯著提升（與癌旁組織相比，P ＜ 0.05）。其中，有8 例患者表達上調，占所有病例數的 66.7%，如圖 1 所示。上述結果提示，CXCR4 表達上調在腎癌的發生、發展過程中可能發揮重要作用。

圖 1 腎癌患者腫瘤組織中 CXCR4 的表達檢測（**P ＜0.01）Figure 1 CXCR4 expression in tumor tissues of renal cancer patients (**P ＜ 0.01)

2.2 腎癌細胞 TGF-β 表達上調

為探索腎癌組織中 CXCR4 上調的機制，在腎癌細胞系中，對其可能的上游分子 TGF-β 進行檢測。以腎小管細胞 HKC 為對照，實時定量 PCR結果顯示，TGF-β 在腎癌細胞 769P 和 786O 中均表達上調（與 HKC 組比，P ＜ 0.001），且 786O細胞中的表達水平最高（與 769P 細胞組比，P ＜0.001）（圖 2）。上述結果提示，在腎癌細胞中，TGF-β 可能是介導 CXCR4 表達上調的重要分子，而 786O 是理想的細胞模型。

2.3 TGF-β 可在體外誘導 CXCR4 的表達

為檢測 TGF-β 在 CXCR4 表達中的調控作用，首先將 786O 細胞感染重組腺病毒 Ad(E1-).sT和對照病毒 Ad(E1-).Null，通過 Western blot 檢測可見，Ad(E1-).sT 在 786O 細胞中高效介導目的基因 sTGF-βRIIFc 的表達（圖 3）。

然后，對感染 Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 的786O 細胞，進行 2 ng/ml 的重組人 TGF-β 刺激，24 h 后檢測 CXCR4 的表達水平。結果顯示，2 ng/ml TGF-β 可高效誘導 CXCR4 的表達，而采用重組腺病毒 Ad(E1-).sT 阻斷 TGF-β 受體后，誘導作用消失（圖 4）。上述結果提示，TGF-β 受體信號通路在腎癌細胞 CXCR4 表達上調過程中發揮至關重要的作用。

2.4 Ad(E1-).sT 干預可抑制 786O 細胞的遷移作用

Ad(E1-).sT 干預后，采用劃痕實驗檢測了 786O細胞的遷移能力。圖 5 顯示，與 Ad(E1-).Null 組相比，Ad(E1-).sT 可以顯著抑制 786O 細胞的遷移作用。表明，TGF-β 在腎癌轉移過程中發揮作用，而 TGF-β 有可能通過上調 CXCR4 發揮其功能。

圖 2 實時定量 PCR 檢測 TGF-β 在腎癌細胞系中的表達水平（***P ＜ 0.001 vs HKC；###P ＜ 0.001vs 769P）Figure 2 The expression of TGF-β was detected by real-time quantitative PCR in renal cancer lines (***P ＜ 0.001 vs HKC;###P ＜ 0.001 vs 769P)

圖 3 Ad(E1-).sT 感染 786O 細胞后 sTGF-βRIIFc 表達檢測Figure 3 Expression of sTGF-βRIIFc in 786O cells infected by Ad (E1-).sT

圖 4 實時定量 PCR 檢測 TGF-β 刺激后，786O 細胞中CXCR4 的表達水平（***P ＜ 0.001vs Ad(E1-).Null + mock；###P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null + TGF-β）Figure 4 The expression of CXCR4 were detected by real-time quantitative PCR in TGF-β stimulated 786O cells (***P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null plus mock group;###P ＜ 0.001 vs Ad(E1-).Null plus TGF-β group)

圖 5 Ad(E1-).sT 對 786O 細胞遷移的影響[*P ＜ 0.05 vs對照；#P ＜ 0.05 vs Ad(E1-).Null]Figure 5 Effects of Ad (E1-).sT on migration of 786O cells [*P ＜ 0.05 vs control;#P ＜ 0.05 vs Ad(E1-).Null]

3 討論

TGF-β 作為多功能的細胞因子，在腫瘤發生、發展、遠端轉移等過程中發揮重要作用。在乳腺癌、前列腺癌骨轉移患者的外周血中，均能檢測到高水平的 TGF-β[12]；而在晚期腎癌患者的腫瘤局部，TGF-β 表達顯著提升。TGF-β 可以通過多種機制影響腫瘤的發生、發展和轉移：如 TGF-β 通過 PI3K/Akt/mTOR 通路上調缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）表達，促進腫瘤生長；通過 Scr/Fak/Akt 通路上調 VEGF 表達，促進血管生成[13-14]；通過誘導溶骨相關因子的表達（IL-11、PTHrP、CTGF），促進腫瘤骨轉移的發生和發展等[15-16]。同時，TGF-β 也是重要的免疫調節因子，可通過多種機制抑制腫瘤微環境的抗腫瘤免疫，包括：增強骨髓來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）的聚集；誘導 CD4+T 細胞分化為 CD4+Foxp3+調節性 T 細胞（regulatory T cells，Tregs）；下調 NK 細胞和 CD8+T 細胞表面 NKG2D 受體，進而減弱其細胞毒效應等[17-19]。

CXCR4 是一種 TGF-β 的重要靶基因，可通過 SDF-1/CXCR4 信號，發揮細胞內肌動蛋白聚合、骨架重構、偽足形成、細胞運動及侵襲力增加[20]等生物學活性。本課題中，對腎癌患者的腫瘤標本和癌旁組織進行了 CXCR4 表達的檢測，結果顯示，CXCR4 在腫瘤組織中表達顯著上調，提示CXCR4 在腎癌的發生、發展過程中發揮重要作用。那么，腎癌組織中 CXCR4 的表達上調是由 TGF-β誘導的嗎？我們的結果證實，TGF-β 在腎癌細胞中表達上調；外源 TGF-β 刺激可以誘導 CXCR4 的表達；同時，阻斷 TGF-β 可以抑制 TGF-β 誘導的 CXCR4 表達和腎癌細胞的遷移能力。上述結果表明，CXCR4 作為 TGF-β 的重要靶基因，在腎癌發生、發展和轉移過程中發揮重要作用，有望成為腫瘤治療的重要靶標。

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Expression of chemokine receptor CXCR4 in renal cancer patients and its regulatory mechanisms

PENG Di, LIU Zhao, LI Jin-nan, ZHANG Xiao-yan, WANG Hao, WANG Hua, XIAO Feng-jun, ZHANG Zhong-tao, HU Ze-bin, WANG Li-sheng, WU Xue-jie, YANG Yue-feng

ObjectiveTo study the expression of chemokine receptor CXCR4 in the tumor lesions of renal cancer patients and its possible regulatory mechanisms.MethodsThe tumor and adjacent tissues were collected and RNA was then extracted. RT-PCR was conducted to detect the expression of CXCR4 in tumor and adjacent tissues. The mRNA expression of transforming growth factor β (TGF-β) in human renal proximal tubular epithelial cell line HKC, and renal cancer cell lines, 769P and 786O were examined using real-time RT-PCR. Replication deficiency adenovirus Ad(E1-).sT and its control Ad(E1-).Null were transfected into 786O cells. TGF-β were added 24 h later for stimulation, and the expression of CXCR4 were detected using real-time RT-PCR. In addition, 24 h after adenoviruses infection, the ability of cell migration were observed by wound healing examination.ResultsThe expression of CXCR4 is much higher in the tumor lesions than that in the para-cancerous tissues. Among total 12 selected patients, CXCR4 was up-regulated in the tumor lesions of 8 patients. Moreover, compared with human renal proximal tubular epithelial cells, the expression of TGF-β, upstream regulator of CXCR4, was significantly increased. In 786O cells, stimulation with TGF-β could up-regulate the expression of CXCR4. Furthermore, Ad(E1-).sT not only inhibit TGF-β-induced CXCR4 expression, but also decreased cellular migration ability.ConclusionCXCR4 expression is increased in tumor lesions of most renal cancer patients, and is regulated by TGF-β. Our results suggest that CXCR4 is a promising target for the therapy of renal cancer.

Receptor, CXCR4; Kidney neoplasms; Transforming growth factor beta; Cell movement

s:WU Xue-jie, Email: drwxj@sinna.com; YANG Yue-feng, Email: yuefengyang1981@163.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.004

Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):19-23

國家“863”青年科學家專題項目（SS2014AA020515）；國家自然科學基金（81402558、81472396）

100039 北京，中國人民武裝警察部隊總醫院泌尿外科（彭迪、李錦楠、吳學杰）；100850 北京，中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所實驗血液學研究室（彭迪、劉釗、李錦楠、張曉艷、王浩、王華、肖鳳君、王立生、楊月峰）；100050 北京，首都醫科大學附屬北京友誼醫院普通外科（劉釗、張忠濤）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所（胡澤斌）

吳學杰，Email：drwxj@sinna.com；楊月峰，Email：yuefengyang1981@163.com

2016-12-12

方法收集腎癌患者（未接受放化療）的腫瘤組織和癌旁組織，將組織研磨后提取 RNA，采用實時定量 RT-PCR 檢測腫瘤組織和癌旁組織中 CXCR4 的表達水平；采用實時定量 RT-PCR 檢測腎小管細胞 HKC 以及腎癌細胞系769P 和 786O 中 TGF-β 的表達水平。復制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT 和對照病毒感染 786O 細胞后 24 h，采用2 ng/ml 的重組人 TGF-β 刺激 24 h，收集細胞，采用實時定量 RT-PCR 檢測目的基因 CXCR4 的表達水平。同時，病毒感染后 24 h，采用劃痕法檢測 786O 細胞的遷移能力。結果在腎癌患者中，腫瘤組織的 CXCR4 表達顯著高于癌旁組織：12 例患者中，有 8 例表達上調。與正常腎小管細胞相比，腎癌細胞系 769P 和 786O 中，CXCR4 的上游分子 TGF-β 表達上調。在 786O 細胞中，TGF-β 刺激可以顯著提升 CXCR4 的表達水平；而 Ad(E1-).sT 可以在786O 細胞中高效介導 sTGF-βRIIFc 的高效表達，并抑制CXCR4 的表達和細胞的遷移能力。

結論CXCR4 在腎癌組織中普遍表達上調，并受到 TGF-β的調控，有望成為腎癌治療的重要靶標。

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2017, 12(1):19-23

Author Affiliations:Department of Urology, General Hospital of People's Armed Police Forces China, Beijing 100039, China (PENG Di, LI Jin-nan, WU Xue-jie); Department of Experimental Hematology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China (PENG Di, LIU Zhao, LI Jin-nan, ZHANG Xiao-yan, WANG Hao, WANG Hua, XIAO Feng-jun, WANG Li-sheng, YANG Yue-feng); Department of General Surgery, Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, Beijing 100050, China (LIU Zhao, ZHANG Zhong-tao); Institute for in Vitro Diagnostic Reagents Control, the National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China (HU Ze-bin)

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