抗VEGF單克隆抗體生物學活性分析方法的建立及其應用

莫琳，周冬梅，徐軍，孫文正，楊彬

抗VEGF單克隆抗體生物學活性分析方法的建立及其應用

莫琳，周冬梅，徐軍，孫文正，楊彬

目的建立抗 VEGF 單克隆抗體生物學活性分析方法，并對實驗條件進行優化及方法學驗證。

方法從新生兒臍帶分離獲取人臍靜脈內皮細胞（HUVEC），使用第 4 ～ 6 代細胞進行活性檢測。HUVEC接種 96 孔板于 CO2培養箱培養 4 h 后加入不同濃度的抗 VEGF 單克隆抗體——VEGF165混合物孵育 48 h，加入CCK8 顯色 4 h，酶標儀讀取各孔 OD450吸光值，采用四參數擬合繪制標準曲線，計算參比品和樣品的 IC50值，獲取樣品的相對活性。

結果該方法專屬性強，僅在抗 VEGF 單克隆抗體上呈現相應的劑量關系曲線，標準曲線擬合度 r2＞ 0.99，精密度樣品相對活性 RSD ＜ 20%，方法在 50% ～ 200% 活性范圍內具有良好的準確性。用該方法對兩個候選藥分別進行 6 次重復性檢測，候選藥相對活性值分別為（95.80 ± 3.29）%，（101.10 ± 3.81）%。

結論本研究建立的 HUVEC 增殖抑制法特異性高、重復性好，并具有良好的準確性及精密度，可用于抗 VEGF 單克隆抗體生物學活性的評估。

人臍靜脈內皮細胞； 血管內皮生長因子類；抗 VEGF 單克隆抗體

腫瘤新生血管的生成是腫瘤與其周圍環境中血管生長因子相互作用的結果[1]，如果沒有新生血管的生成，原發腫瘤生長不超過 2 mm，腫瘤轉移將無法實現[2]。血管生成被認為是癌癥的十大特征之一[3]。許多因素參與血管的生成與發展，其中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管生成的重要調控因子，其在腫瘤組織中高水平表達。原位雜交研究表明，多種人實體腫瘤中均存在 VEGF mRNA 的表達[4]。VEGF 因子能促進內皮細胞分裂、增殖、遷移和血管構建，增加血管通透性，是目前發現功能最強、特異性最高的血管內皮生長因子[5-6]。因此，阻斷 VEGF 的作用已成為腫瘤治療的研究熱點。人源化抗 VEGF單克隆抗體貝伐珠單抗由美國 Genentech 公司研發生產，已經被批準用于結直腸癌、非小細胞肺癌、多形性成膠質細胞瘤的治療[7-9]。隨著貝伐珠單抗專利期的臨近，而臨床需求仍在不斷提高，全球范圍內掀起一股貝伐珠單抗生物類似藥研發的熱潮。在單抗生物類似藥的研發生產中，候選藥與原研藥的相似性評價是評估單抗生物類似藥質量、有效性、安全性的重要標準。生物學活性是生物類似藥的關鍵質量屬性之一，應建立穩定可靠的生物學活性檢測方法對生物類似藥進行質量控制。

抗 VEGF 單克隆抗體通過中和 VEGF 因子阻斷其與內皮細胞表面 VEGF 受體結合，從而抑制內皮細胞的增殖與遷移。本文利用抗 VEGF 單克隆抗體中和 VEGF 因子從而抑制人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）增殖的原理，建立抗 VEGF 單克隆抗體生物學活性檢測方法，并驗證了方法的重復性、精密度、準確性、專屬性等，用該方法對兩個候選藥的生物學活性分別進行了 6 次重復性檢測，進一步驗證了該方法的精密性及準確性，為抗 VEGF單克隆抗體生物學活性評估提供了穩定、可靠的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

新生胎兒臍帶由東莞市長安鎮港灣醫院提供；M199 培養基、VEGF165因子購自美國 Gibco 公司；ECGS 因子、肝素鈉、I 型膠原酶購自美國Sigma公司；CCK8 溶液購自日本同仁公司；青霉素-鏈霉素溶液、胎牛血清、胰酶、PBS 溶液購自美國 Hyclone 公司；原研藥參比品與候選藥由廣東東陽光藥業藥物研究院提供；倒置熒光顯微鏡購自日本 Olympus 公司；MD/M2e 多功能酶標儀為美國分子儀器公司產品。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC 細胞培養 新生胎兒臍帶用 I 型膠原酶消化，以培養液 A（M199 + 20% FBS + 30 μg/ml ECGS + 100 ng/ml 肝素鈉 + 1% 雙抗溶液）于二氧化碳培養箱培養獲得第 1 代 HUVEC細胞，待細胞匯合度達 100% 后用胰酶消化，以1∶3 比例傳代，選用第 4 ～ 6 代細胞進行實驗。

1.2.2 HUVEC 增殖抑制法標準曲線繪制 細胞生長至對數生長期，用 0.25% 胰酶，0.02% EDTA消化后加入培養液 B（M199 + 20% FBS）重懸細胞，離心棄上清。使用培養液 C（M199 + 2% FBS + 90 ng/ml 肝素鈉）重懸細胞并計數，再將細胞接種96 孔板（1 × 104個細胞/孔），孵育 4 h。抗 VEGF單克隆抗體用培養液 C 稀釋至 5 μg/ml 作為最高作用濃度點，于另一 96 孔板將其 2 倍梯度稀釋獲得 10 個抗體系列作用濃度點，并與等體積的62.5 ng/ml VEGF165溶液混合，200 r/min 振蕩混勻10 s，于 37 ℃ 孵育 3 h 后將其以 100 μl/孔加入接種了 HUVEC 細胞的 96 孔板，細胞置于 CO2培養箱中孵育 48 h，加入 CCK8 溶液 20 μl/孔顯色 4 h，顯色結束后于酶標儀讀取各孔 OD450值。

1.2.3 數據分析 利用 Softmax 軟件分析實驗數據，以抗體濃度為橫坐標，對應的吸光值為縱坐標，進行四參數擬合，繪制抗體-劑量反應曲線，樣品相對活性按以下公式進行計算：

1.2.4 實驗條件的優化 VEGF165作用濃度的確定：VEGF165以 500 ng/ml 作為最高作用濃度點，2 倍梯度稀釋至 0.488 ng/ml 進行檢測；抗體濃度范圍：分別將抗 VEGF 單抗進行 1∶2 倍（最高作用濃度 5000 ng/ml）、1∶3 倍（最高作用濃度 25 000 ng/ml）、1∶4 倍梯度稀釋（最高作用濃度50 000 ng/ml），各稀釋 10 個作用濃度點進行檢測；細胞接種密度：分別以 5000、10 000、12 000 個細胞/孔接種 96 孔板進行檢測；孵育時間的選擇：分別將抗體-VEGF165混合液孵育時間設定為 48、72 h 后進行檢測。

1.2.5 方法學驗證

1.2.5.1 專屬性 將抗 TNF-a 單抗（5 μg/ml）、培養液 C、空輔（培養液 C 稀釋 10倍）、65 ℃ 加熱 90 min 的抗 VEGF 單抗（5 μg/ml），于 96 孔板 2 倍梯度稀釋獲取 10 個系列作用濃度點代替抗-VEGF 單抗系列作用濃度點進行檢測。

1.2.5.2 重復性及中間精密度 由 2 名不同實驗人員各自平行配制 6 份 5 μg/ml 抗 VEGF 單抗溶液，于不同的時間，使用不同臍帶提取的、不同代次的 HUVEC 細胞進行檢測。

1.2.5.3 準確度 視 5 μg/ml 抗 VEGF 單抗溶液為 100% 線性濃度點，平行配制 200%、150%、100%、75%、50% 線性溶液各 3 份進行檢測，按公式：回收率（%）= 相對活性值/理論活性值 × 100%，計算各線性點回收率。

1.2.6 候選藥相對活性檢測 以原研藥為參比品，運用建立的 HUVEC 增殖抑制法在不同的時間測定兩個候選藥的相對生物學活性。

2 結果

2.1 HUVEC 增殖抑制法標準曲線繪制

采用 Softmax 軟件分析數據，以抗 VEGF 單抗濃度為橫坐標、對應的吸光值為縱坐標進行四參數擬合，標準曲線呈現典型的 S 型，信噪比為 2.3，r2＞ 0.99（圖 1）。

2.2 實驗條件的優化

2.2.1 VEGF 作用濃度的選擇 將 VEGF165稀釋至 500 ng/ml 作為最高作用濃度點，2 倍梯度稀釋至 0.488 ng/ml（共計 11 個濃度點）進行檢測，獲取 VEGF165促 HUVEC 增殖劑量關系曲線，結果見圖 2。當 VEGF165濃度在500 ～ 31.25 ng/ml時曲線達到高點平臺期。因此，將 VEGF165的作用濃度選定為 62.5 ng/ml。

圖 2 VEGF 因子刺激 HUVEC 細胞增殖曲線Figure 2 Dose-response curve of VEGF promote HUVEC proliferation assay

2.2.2 抗 VEGF 單抗作用濃度范圍的選擇 分別將抗 VEGF單抗進行 1∶2 倍、1∶3 倍、1∶4 倍梯度稀釋，各設計 10 個作用濃度點進行檢測，結果見圖 3，其中抗 VEGF 抗體以 5000 ng/ml 為最高作用濃度進行 2 倍梯度稀釋，曲線最為理想。

圖 3 不同濃度抗 VEGF 單克隆抗體抑制 HUVEC 細胞增殖曲線Figure 3 Assay dose-response curves using three different serial dilutions of anti-VEGF mAb

2.2.3 細胞接種密度的選擇 將 HUVEC 細胞分別以 5000、10 000、12 000 個/孔接種 96 孔板進行檢測，結果如圖 4。其中當細胞接種密度為10 000 個/孔時曲線窗口差值、信噪比、抗體作用濃度點的分布最為理想。

圖 4 不同細胞接種密度 HUVEC 細胞增殖抑制法曲線Figure 4 Assay dose-response curves using different cell densities of HUVEC

2.2.4 抗體-VEGF165溶液孵育時間的選擇 分別將抗體-VEGF165溶液孵育 HUVEC 細胞 48 及72 h（圖 5）。當孵育時間為 72 h 時，僅有兩個抗體濃度點落于高點平臺期，為確保實驗方法的穩定性及工作效率，將抗體-VEGF165溶液孵育時間確定為 48 h。

圖 5 抗體-VEGF165溶液不同孵育時間 HUVEC 增殖抑制法曲線Figure 5 Dose-response curve of anti-VEGF mAb against HUVEC proliferation assay with different incubation time

2.3 方法學驗證

2.3.1 專屬性 本研究中共設計 4 組專屬性溶液：抗 TNF-a 單抗、培養液 C、空輔及 65 ℃ 加熱90 min 的抗 VEGF 單抗溶液。其中僅在抗 VEGF單抗溶液中呈現劑量關系曲線，結果見圖 6。

圖 6 專屬性驗證Figure 6 Assay dose response curve using different mAb samples

2.3.2 重復性及精密度 由兩位實驗人員各自獨立配制 6 份 5 μg/ml 抗 VEGF 單抗溶液，于不同日期，選用不同臍帶提取的、不同代次的 HUVEC細胞進行檢測，結果見表 1。不同試驗人員配制的抗 VEGF 單抗溶液相對活性平均值分別為：（102.70 ± 5.30）%、（103.50 ± 3.73）%，兩人測得的共 12 份溶液相對活性平均值為（103.10 ± 4.24）%。

表 1 重復性驗證（n = 6）Table 1 Relative bioactivity of two bevacizumab samples (n = 6)

2.3.3 準確度及線性范圍 平行配制 50%、75%、100%、150%、200% 的線性點溶液各 3 份進行檢測，檢測結果見表 2。5 組線性溶液相對活性平均值分別為：（52.53 ± 3.05）%、（80.17 ± 2.25）%、（103.00 ± 2.52）%、（164.00 ± 3.05）%、（225.00 ± 11.8）%。

表 2 不同線性點溶液相對活性檢測結果及回收率實驗（n = 3）Table 2 Relative activity and recovery of anti-VEGF mAb against HUVEC proliferation assay using different concentrations of bevacizumab (n = 3)

2.4 候選藥相對生物學活性檢測

以原研藥為參比品，在不同的時間，復蘇不同臍帶提取的 HUVEC 細胞分別傳代至第 4 ～ 6 代用于測定兩個候選藥的相對生物學活性，分別進行6 次檢測，結果見表 3。1 號候選藥測定結果平均值為（95.80 ± 3.29）%，CV% = 3.42；2 號候選藥測定結果平均值為（101.10 ± 3.81）%，CV% = 3.80；兩個候選藥獨立進行的 6 次相對活性檢測結果高度一致。

表 3 兩株候選藥相對活性檢測結果（n = 6）Table 3 Relative activities of two biosimilar candidates of bevacizumab (n = 6)

3 討論

伴隨著抗體類生物類似藥研發的熱潮，如何進行單抗類生物類似藥質量的評估、確保藥物的安全性及有效性是生物類似藥研發的重要任務之一。生物學活性是生物類似藥質量研究最為關鍵的屬性之一，其受藥物作用機制、檢測用細胞、試劑批次差異、實驗人員操作誤差等方面的影響，使得分析方法的建立存在一定的挑戰。

抗 VEGF 單克隆抗體體外生物學活性模型包括：抑制 VEGF 誘導 HUVEC 細胞增殖、遷移、NO 的產生、滲透率及鈣離子濃度的變化等[10-11]。其中 HUVEC 增殖抑制法作為檢測抗 VEGF 單抗生物學活性的經典檢測方法，其能最大程度模擬抗 VEGF 單克隆抗體在體內抑制新生血管生成的過程[12]，因此被廣泛用于進行抗 VEGF 單克隆抗體生物學活性的檢測。

本文中用 I 型膠原酶從新生兒臍帶分離獲取原代 HUVEC 細胞，使用原代HUVEC 細胞專用培養基 M199 進行細胞培養，獲得了性質均一、穩定性好的原代 HUVEC 細胞[13]用于分析方法的建立。通過條件摸索確定 VEGF165作用濃度為62.5 ng/ml，選擇 5 μg/ml 抗 VEGF 單抗作為最高作用濃度點，2 倍梯度稀釋方式，孵育時間為 48 h，可呈現典型的 S 型抗體-劑量曲線。經驗證表明，建立的 HUVEC 增殖抑制法特異性高、重復性好且具有良好的精密度及準確性，不同新生兒臍帶提取的 HUVEC 細胞于同一樣品的檢測上，檢測結果穩定。方法運用于 2 個候選藥的 6 次重復性檢測，相對活性高度一致。

本研究建立的抗 VEGF 抗體生物學活性檢測方法，穩定性高、變異系數小，為抗 VEGF 單克隆抗體生物學活性評價建立了穩定可靠的檢測方法。

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Development, optimization, and application of a cell-based assay for bioactivity determination of anti-VEGF monoclonal antibody

MO Lin, ZHOU Dong-mei, XU Jun, SUN Wen-zheng, YANG Bin

ObjectiveTo development, optimize a cell-base assay for bioactivity determination of anti-VEGF monoclonal antibody (mAb) and to utilize the mAbs to inhibit VEGF induced proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).MethodsFresh HUVEC from human umbilical cords were cultured up to the fourth generation but no more than sixth generation should be used. HUVEC were seeded into each well of a 96-well plate. The plate were incubated for 4 h at 37 ℃ and 5% CO2and then HUVEC were treated with anti-VEGF antibodies containing solution for 48 h. CCK8 were added to each well for another 4 h at 37 ℃ and 5% CO2. The cellular response was recorded at a 450 nm absorbance using the SpectraMax M2e. The EC50values of the control and samples were obtained by using four parameters curve and then the bioactivity of samples were calculated.ResultsThis assay possessed excellent specificity. Only anti-VEGF antibody showed a typical dose-response curve with more than 0.99 of a standard curve fit of r2value and less than 20% of a RSD for the precision validation. This assay also presented a good accuracy within the activity range of 50% - 200%. This assay was used to conduct 6 measure each for two different samples containing active anti-VEGF mAbs using a commercial anti-VEGF mAb as the control. A mean relative activity of (95.80 ± 3.29)% and (101.10 ± 3.81)% was obtained for these two samples respectively.ConclusionWe have successfully developed, optimized, and applied the HUVEC proliferation inhibitory assay for bioactivity determination of anti-VEGF mAbs with excellent specificity, reproducibility and accuracy.

Human umbilical vein endothelial cells; Vascular endothelial growth factors; Anti-VEGF monoclonal antibodies

YANG Bin, Email: YangBin@hecpharm.com

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2017.01.005

Chin Med Biotechnol, 2017, 12(1):24-28

廣東省引進創新科研團隊計劃（201101Y0104990178）

523867 東莞，廣東東陽光藥業有限公司

楊彬，Email：YangBin@hecpharm.com

2016-12-08

www.cmbp.net.cn 中國醫藥生物技術, 2017, 12(1):24-28

Author Affiliation:Sunshine Lake Pharma Co. Ltd., Dongguan 523867, China

www.cmbp.net.cn